物转化方法的结果
[0129] 本公开的方法亦可用于以高通量方式迅速地筛选植物转化方法的结果。由于由 DNA重组产生的GE植物和植物细胞中基因型和表达特征的差异，由植物转化方法产生的植 物和植物细胞并不必然包含导入的转基因蛋白质例如异源蛋白质的相同或类似的表达分 布。此外，内源蛋白质可展示不同形式改变的表达分布。在本公开的一些实施方案中，从通 过植物转化方法产生的植物、植物组织或植物细胞制备复杂蛋白质样品。然后可对所述制 备的复杂蛋白质样品进行多重MS/MS分析。然后分析来自不同样品的MS谱以鉴定那些显 示所需表达特征的样品。然后可繁殖鉴定出的样品的来源植物、植物组织或植物细胞以选 择所需的表达特征。
[0130] VIII.实现转基因的生物限制
[0131] 转基因可逃离转基因植物并变得例如通过异花授粉而整合入环境中周围的非转 基因植物的基因组。在多数情况下，这是不希望的。在一些实施方案中，使用本公开的方法 以实现将转基因生物限制于转基因植物。在这些和其他实施方案中，可从有受来自转基因 植物的遗传材料污染风险的植物、植物组织或植物细胞制备复杂蛋白质样品。可对制备的 复杂蛋白质样品进行多重MS/MS分析。然后分析来自不同样品的MS谱以确定那些含有靶 转基因蛋白质，例如，表达于转基因植物中的转基因蛋白质的样品。在样品中靶蛋白的存在 与所述转基因逃至来源植物、植物组织或植物细胞相关。通过销毁、限制范围（confine)或 者其他方式限制污染的植物、植物组织或植物细胞的生长，可实现生物限制。
[0132] 除了本文中具体描述的那些具体实施例，实施方案可有多种修饰和替代形式。因 此，实施方案并不限于公开的特定形式。相反，本公开的范围涵盖所附权利要求中记载的所 有修饰、等同和替代形式。
[0133] 实施例
[0134] 实施例I
[0135] 选择六种不同的转基因蛋白质（CrylF、Cry34、Cry35、AAD-l、AAD-12和PAT)以供 开发LC\MS\MS多重分析。通过质谱法在复杂蛋白质混合物的单次注入中检测并鉴定各蛋 白质。
[0136] 多重分析的第一种型式是通过分别蛋白水解消化所述六种蛋白质，然后将所得的 蛋白质肽补强至经蛋白水解消化的植物组织提取物，并使用LC\MS\MS以供在单次注入中 检测所述六种蛋白质的每一个的特定前体/碎片离子来进行的。然后将在该第一种多重型 式过程中开发的方法学应用于在现行的自交玉米育种材料中表达的四种蛋白质的多重检 测 。
[0137] 实施例II
[0138] 植物中的LC\MS\MS多重检测
[0139] 表1列出了接收的每种单个储备蛋白质的浓度，和进行胰蛋白酶消化时每种蛋白 质所得的稀释。在用蛋白酶胰蛋白酶消化之前，将所有蛋白质缓冲液交换至25mM碳酸氢 铵，pH7. 9 (SIGMA)以确保有效的消化条件。将来自每种储备蛋白质（参见表1)的等分试 样转移至无菌的1. 5mLeppendorf管，并使用25mM碳酸氢铵，pH7. 9补足至100μL。将 ZebaDesaltSpinColumn(Pierce#89882)根据制造商的推荐用于每种蛋白质的缓冲液交 换。进行Zeba柱的三次旋转洗涤，每次洗涤使用300μL的25mM碳酸氢铵，pH7. 9,并在 1500g旋转1分钟。然后将每个样品蛋白质的100μL等分试样施于Zeba柱树脂的表面， 并在1500g旋转2分钟。然后将经缓冲液交换的材料直接用于胰蛋白酶消化以供生成蛋白 质肽片段。六种蛋白质的起始胰蛋白酶消化并不包括烷基化半胱氨酸氨基酸残基的方法步 骤。该烷基化步骤可在之后添入，但以高通量分析作为目标，排除烷基化步骤可为最终分析 节约显著的时间和努力。添加1μL的0. 5MDTT使每个100μL经缓冲液交换的蛋白质样 品成为5mMDTT，然后在95°C热变性20分钟，并冷却至室温（25°C)。将测序级的修饰的胰 蛋白酶重悬于25mM碳酸氢铵，pH7. 9至0. 4μg/μL的浓度。将胰蛋白酶添加至每个蛋白 质样品至1:20至1:50的最终酶对底物比的范围。使用下述温度分布在热循环仪中进行胰 蛋白酶消化：37°C进行16小时，然后冷却至4°C。在胰蛋白酶消化之后，将3yL的10%甲 酸添加至每个蛋白质消化物。
[0140] 表1:对于每个LC\MS\MS多重-6蛋白质胰蛋白酶消化物的蛋白质浓度和稀释
[0141]
[0143] 首先，通过ESI_LC\MS\MS分别分析六个经胰蛋白酶消化的蛋白质样品的每一个 以确定会提供用于在单次分析中同时多重鉴定所有六种蛋白质的检测敏感度和特异性的 胰蛋白酶肽片段。用于方法开发的质谱仪为AppliedBiosystemsMDSSciex4000QTrap HybridTripleQuad,(FosterCity,CAmodel#1004229_V)，其利用配有TSI探针的Turbo VESI源套。将样品通过AgilentllOOHPLC系统导入质谱仪。表2包括对于不同装置组件 的具体模型号和固件版本信息。
[0144] 表2:对于装置组件的模型/固件版本信息
[0145]
[0146] 反向层析是使用装配PhenomenexJupiterProteo50X2. 0mm4μΜ柱的Agilent 1100HPLC系统用下述上样条件进行的：95%Α(Η20/0. 1%甲酸）/5%B(乙腈/0. 1%甲酸） 进行1分钟，然后20分钟梯度至90%B。将柱以90%B的2分钟维持来再生，然后以5分 钟重新平衡至5%。对于各蛋白质肽的最初筛选，将每种蛋白质大约10-50fmol加载至柱以 供分析。
[0147] 对六种待进行多重分析的蛋白质的每一种进行纳入了两个EPI扫描的IDA采集方 法，该扫描是对来自对于每种蛋白质具特异性的MRM列表转换检测出的两种最丰富的离子 进行的。该碎片化数据对于从每种检测出的肽选择表现最高丰度的碎片离子提供了信息。 一般而言，选择来自检测出的前体肽的三种最多的碎片离子以供进一步方法开发。对于该 IDA采集，Sciex4000QTRAP纳入了下述条件：IS电压 5500、DP75、EP10、CXP12、CUR10、 CADHIGH、TEM450、GS1 35、GS2 35、RESQ1 单元和RESQ3 单元。对于每种肽的CE值是 用对每个肽使用的最优值经验地测试的。使用从对于六种蛋白质的每一种进行的单独IDA 分析累积的肽碎片化数据，然后对每种单独的蛋白质进行MRM分析以鉴定来自每种蛋白质 的具有良好电离效率的前体离子。对于每种多重蛋白质，使用所有胰蛋白酶肽（tryptic peptides)的MRM列表以构建单独的MRM分析方法。使用单个蛋白质MRM分析数据作为电 离效率的量度，在多重形式中对于每种蛋白质选择肽作为前体离子。多重肽列于表3。
[0148] 表3 :选用于起始多重_6LC\MS\MS方法的肽
[0151] 实施例III
[0152] 然后使用从单个蛋白质分析生成的前体/碎片离子数据构建了对于所有六种DAS 蛋白质的单个LC\MS\MS多重靶向MRM分析。这些肽首先通过用来自六种蛋白质的每一种 的胰蛋白酶消化材料补强碳酸氢铵缓冲液（25mM，pH7.9)来进行LC\MS\MS多重检测。将 大约5-20fmol的每种蛋白质注入柱上以供补强的缓冲液的起始多重-6分析。
[0153] 图1-6显示了在单次注入中检测出的六种蛋白质的每一种的提取离子层析图。具 体而言，图1显示AAD-1的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于AAD-1 ((R) -2, 4-二氯苯氧基 丙酸双加氧酶）的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含AAD-12、CrylF、 Cry34、Cry35和PAT的单次注入中检测出。
[0154] 图2显示AAD-12的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于AAD-12 ((S) -2, 4-二氯苯 氧基丙酸/α-酮戊二酸双加氧酶）的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中 在含AAD-1、CrylF、Cry34、Cry35和PAT的单次注入中检测出。
[0155] 图3显示CrylF的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于CrylF(杀虫晶体蛋白 crylFa(杀昆虫delta-内毒素CrylF(a)))的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提 取物中在含AAD-1、AAD-12、Cry34、Cry35和PAT的单次注入中检测出。
[0156] 图4显示Cry34的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于Cry34(晶体蛋白ET79[苏 云金芽孢杆菌])的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含AAD-1、AAD-12、 CrylF、Cry35和PAT的单次注入中检测出。
[0157] 图5显示Cry35的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于Cry35 (Cry35Ab类似物[苏 云金芽孢杆菌])的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含AAD-1、AAD-12、 CrylF、Cry34和PAT的单次注入中检测出。
[0158] 图6显示PAT的LC\MS\MS多重检测。该数据为对于Cry35 (草胺膦N-乙酰基转 移酶（PPTN-乙酰基转移酶））的提取的LC\MS\MS离子层析图，在玉米种子提取物中在含 AAD-1、AAD-12、CrylF、Cry34和Cry35的单次注入中检测出。
[0159] 在确证了所有六种蛋白质的LC\MS\MS多重检测之后，将碳酸氢铵肽混合物稀释 至来自玉米种子组织的蛋白酶消化的提取物以供在种子基质中进行检测。使用的种子组织 是来自现行的近交材料。将补强的样品在碳酸氢铵中1:10稀释，然后在玉米种子提取物中 1:2稀释，使得大约0. 2至lfmol的每种蛋白质注入柱并使用LC\MS\MS多重方法检测。
[0160] 实施例IV
[0161] 通过质谱法在来自近交植物材料（5XH751XT)的复杂蛋白质样品的单次注入中检 测并鉴定了四种不同的转基因蛋白质（Cryl、Cry34、Cry35和PAT)。在叶和种子组织中均 检测出了蛋白质。
[0162] 使用上文所列的多重-6方法以在来自近交系植物材料（5XH751XT)的复杂蛋白质 样品的单次注入中检测四种不同的转基因蛋白质（Cryl、Cry34、Cry35和PAT)的存在。在 该尝试中，开发了单次注入多重-4方法以测量四种蛋白质在玉米种子和玉米叶组织中的 存在。实验对照涉及与在消化之前掺入完整转基因蛋白质的空白（null)5XH751提取物的 比较，以及与消化的空白5XH751提取物的比较。
[0163] 对于该实验，亦考虑到了多重方法鲁棒性分析性能所需的提取方法。因为多重检 测是同时测量来自每种单个样品的多种蛋白质，使用的蛋白质提取方法需要对于所有蛋白 质均有效以供准确测量。如图11所示，对于玉米叶和种子组织均测试了提取条件。在开始 理解这四种不同的蛋白质会如何表现的尝试中，测试了三种不同的提取条件，以寻找单一 的提取方