合物的扫描电镜图。根据微阵列电极工作区域的大小，确定出试验所用最佳量，滴加纳米ΑΤΟ-壳聚糖溶液的量为3 μ?，固定30 min ;
3)取四环素适配体，滴加量为3 μ L，固定40 min，孵育温度为室温。
[0017]实施例2微阵列电极的线性关系
配置1-1.0X10 6 ng/mL的四环素标准溶液，将上述制备好的微阵列电极适配体传感器分别滴加不同浓度的四环素标准溶液，滴加量为3 μ?，在常温下孵育30 min,检测发生免疫反应前后阻抗变化得到其工作曲线。如图2，曲线分别代表不同四环素浓度所对应的阻抗值，随着浓度的增加，阻抗值逐渐增大。本试验中，对影响适配体传感器的性能参数进行了优化(如图3)。以四环素浓度的对数为横坐标，阻抗变化值为纵坐标建立关系曲线，可以得到在1-1.0X106 ng/mL范围内线性相关，线性回归方程分别为:△ R=14.002LogC(M) + 137.8 ( R2 =0.9657)(如图4)，该方法有利于整个制备过程中试验条件的严格控制，更好地实现人为因素的干扰作用，还充分体现了微阵列电极操作便捷、响应快速、试剂消耗少等优势。有待用于实际样品中四环素残留的快速检测工作。
[0018]实施例3使用微阵列电极适配体传感器检测牛奶样品的加标回收率测定从当地超市购买纯牛奶进行实际样品检测。在测试之前，对牛奶进行预处理:把牛奶按照1:10的比例进行稀释，然后分装到离心管中，以20000转/秒(rpm)的速度离心90min。离心结束后，牛奶分为明显的三层，上、下层是脂肪和酪蛋白等大分子物质，为了避免大分子物质对四环素的包裹，我们去中间一层的乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四环素，浓度分别是g/mL，g/mL，g/mL。使用本发明的微阵列电极适配体传感器进行接触样品前后的阻抗值测试。测试后根据已经获得的阻抗变化与四环素浓度的关系曲线得到实际的检测值。实际样品检测的回收率在94%-104%之间，说明本发明的微阵列电极适配体传感器能够较好的用于牛奶实际样品的抗生素残留的检测，具体的如图5所示。
[0019]实施例4使用微阵列电极适配体传感器检测牛奶实际样品
1)选取纯牛奶，把牛奶按照1:10的比例进行稀释，然后分装到离心管中，以20000转/秒(rpm)的速度离心90min ;离心结束后，取中间一层乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四环素，制备浓度分别是g/mL，g/mL，g/mL的四环素溶液，备用；
2)微阵列电极的清洗:首先在1M NaOH溶液中浸泡15min ;然后在1M HC1溶液中浸泡15 min ;再用蘸有无水乙醇的擦镜纸对电极表面擦拭；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗，如有需要，可以通过显微镜观察微阵列电极的表面状态，(清洗过程与乙醇、丙酮等方法进行对比清洗效果，选出了适当的清洗方法)；
3)取纳米ΑΤ0-壳聚糖溶液，滴加量为3μ L，固定30 min ;
4)取四环素适配体，滴加量为3y L，固定40 min，孵育温度为室温；
5)固定抗体后，微阵列电极滴加底液PBS后进行阻抗检测，利用得到的Impensence阻抗图谱获取所测阻抗值Zi ;
6)滴加牛奶样品液，加入底液PBS后进行阻抗检测，利用得到的Impensence阻抗图谱，获取所测阻抗值z2 ;
7)计算四环素添加前后的阻抗变化△ZzZfZi,根据阻抗变化与四环素浓度的关系曲线获得牛奶实际样品四环素浓度的信息。
【主权项】
1.一种基于微阵列电极的抗生素残留检测方法，其特征在于，该传感器的组装过程为:将一定量纳米ΑΤΟ与壳聚糖的混合液修饰微电极表面；再将四环素适配体有效固定在微电极表面；最后，利用抗原抗体间的特异性反应，滴加不同浓度的抗生素，加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)底液后进行阻抗检测，进而制备出了一种新型的抗生素残留适配体传感器。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述抗生素分子为四环素。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，使用的微电极为叉指阵列微电极(IDAM电极)是由一对电极间相互啮合组合的微阵列电极构成的，其中每个微阵列电极又是由多个宽度及间距都为微米级的电极并联组成，微阵列电极的具体尺寸一般是:电极长为2~10毫米，电极高为0.1-0.2微米，电极宽为1~20微米，电极梳齿间的间距为1~20微米金叉指微电极，总尺寸为2cmX lcmX0.05cm，由50对指宽和指间距均为15 μ m的交叉阵列电极组成。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，适配体在微阵列电极上的固定步骤如下: 1)清洗并测试微阵列电极； 2)将步骤1)所得微阵列电极进行底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数，进行优化； 3)将步骤2)所得的微阵列电极，在最优条件下滴加纳米ΑΤΟ-壳聚糖混合液，获得纳米ΑΤΟ-壳聚糖修饰界面； 4)在步骤3)所得纳米ΑΤΟ-壳聚糖修饰电极表面滴加四环素适配体，获得适配体修饰界面。5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述清洗并测试微阵列电极，是分别浸入一定浓度的氢氧化钠、盐酸溶液中等一段时间，再经超纯水冲洗；最终，用氮气吹干后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述底液pH、适配体浓度、孵育时间等参数进行了优化:底液pH选取7.5 ;适配体浓度选取6 μΜ ;孵育时间30 min。7.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述滴加纳米ΑΤΟ-壳聚糖混合液，滴加量为3 μ L，固定30 min。8.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述滴加四环素适配体，滴加量为3 μ L，固定40 min，孵育温度为室温。9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，检测方法建立具体步骤如下: 1)微阵列电极的清洗:首先在1M NaOH溶液中浸泡15min ;然后在1Μ HC1溶液中浸泡15 min ;再用蘸有无水乙醇的擦镜纸对电极表面擦拭；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗，如有需要，可以通过显微镜观察微阵列电极的表面状态，(清洗过程与乙醇、丙酮等方法进行对比清洗效果，选出了适当的清洗方法)； 2)取0.2 g壳聚糖粉末溶解于100 mL 0.2%乙酸溶液中并不断搅拌3 h，制备质量分数为0.2 %的壳聚糖溶液；然后用电子天平称量1.2 g纳米ΑΤΟ粉体溶于上述制备好的4mL壳聚糖溶液中，利用超声清洗仪超声30min，然后置于程式振荡器上，震荡30min，直到溶液达到均匀稳定的状态，根据微阵列电极工作区域的大小，确定出试验所用最佳量，滴加纳米ΑΤΟ-壳聚糖溶液的量为3 μ?，固定30 min ; 3)取四环素适配体原液，用PBS稀释不同倍数，配置2μ M，4 μ M，5 μ M，6 μ M，8 μ M，ΙΟμΜ等不同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值为6μΜ，滴加四环素适配体的浓度为6μΜ，固定40min ； 4)滴加不同浓度的四环素标准液，加入底液PBS后进行阻抗检测，建立四环素浓度与阻抗变化之间的标准曲线，在l-1.0X106ng/mL范围内线性范围良好，线性回归方程分别为:AR=14.002 LogC(M) + 137.8 (线性相关系数 R2 =0.9657)。10.根据权利要求1所述方法，牛奶中四环素残留具体检测步骤如下: 1)牛奶样品预处理方法如下:把牛奶按照1:10的比例进行稀释，然后分装到离心管中，以20000转/秒(rpm)的速度离心90min ;离心结束后，取中间一层乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四环素，制备浓度分别是g/mL，g/mL，g/mL的四环素溶液，备用； 2)在微阵列电极上固定适配体后，加入底液PBS进行阻抗检测，利用得到Impensence阻抗图谱，获取所测阻抗值Zi ; 3)滴加牛奶样品液，加入底液PBS后进行阻抗检测，利用得到的Impensence阻抗图谱，获取所测阻抗值Z2 ; 4)计算四环素添加前后的阻抗变化，根据阻抗变化与四环素浓度的关系曲线获得牛奶实际样品四环素浓度的信息。
【专利摘要】本发明公开了一种基于微阵列电极的抗生素残留检测方法，属于农产品安全检测技术领域。本发明利用微阵列电极体积小、传质速率快、扩散层薄等优点，将一定量纳米ATO（氧化锡锑）修饰在微电极表面，有效提高所制备生物传感器的灵敏度，另一方面利用壳聚糖良好的生物相容性，实现抗体在修饰界面的有效固定。整个试验过程中，对参数进行优化，获得最佳的测试条件：7.5作为底液pH值、6μM作为适配体浓度、选取30min作为抗生素与适配体的孵育时间。制备出的四环素免疫传感器，通过计算接触样品前后免疫传感器的阻抗值的变化，获得样品中四环素的浓度信息。该传感器在1-1.0×106ng/mL浓度范围检测四环素的线性关系良好，可用于实际样品中目标成分四环素的检测。
【IPC分类】G01N27/06
【公开号】CN105353003
【申请号】CN201510671949
【发明人】郭业民, 胥清翠, 张前前, 孙霞, 戚彬
【申请人】山东理工大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年10月19日