合并乙酸乙酯液，蒸 干，残渣加乙酸乙酯lml溶解，制成对照药材溶液。薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照 药材溶液各5~10μ1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸= 20:20:1为展 开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的 位置上，显相同颜色的荧光主斑点。结果参见图6。结果显示供试品色谱中，在与对照药材色 谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，且分离效果好，斑点清晰，阴性对照无干扰。
[0087] 2.2肾茶薄层色谱鉴别方法的耐用性试验
[0088] 按所建立的肾茶薄层色谱鉴别方法在不同的温度和湿度条件下进行考察：图6、图 7、图8结果显示，在不同的温度和湿度环境下，供试品色谱中，在与肾茶对照药材相应的位 置上，均能显示相同颜色的荧光主斑点。
[0089] 2.3 10批治疗血尿的中药组合物的中肾茶薄层色谱的鉴别
[0090] 取10批治疗血尿的中药组合物的依法进行试验，结果参见图9。结果显示10批治疗 血尿的中药组合物的供试品色谱中，在与肾茶对照药材色谱相应的位置上，均显相同颜色 的荧光主斑点，且分离效果好，斑点清晰，阴性对照无干扰。
[0091] 通过专属性、耐用性及10批样品试验，结果显示供试品色谱中，在与肾茶对照药材 色谱相应的位置上，均显相同颜色的荧光主斑点，且分离效果好，斑点清晰，阴性对照无干 扰，此方法操作简便，专属性强，重现性好。
[0092] 实施例3
[0093] 3小蓟薄层色谱鉴别方法的建立
[0094] 3.1小蓟中的蒙花苷是小蓟中众多黄酮类化合物中活性高的化合物之一，也是小 蓟饮片中含量最高的黄酮类成分。现拟建立制剂中小蓟和蒙花苷的薄层色谱鉴别方法。 [0095] 取本品治疗血尿的中药组合物0.5g，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸 干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取小蓟对照药材lg，加甲醇10ml，超声处理 30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，制成对照药材溶液。再取蒙花苷对照品，加 甲醇制成每lml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和 对照药材溶液各ΙμL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯：甲酸:水= 8:1:1为展开剂， 展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，晾干约1小时，置紫外光灯365nm检视。结果参见图10。
[0096] 供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，缺小蓟的 阴性样品中也未见干扰。在与对照药材色谱相应的位置上，仅显2个相同颜色的荧光斑点， 且阴性对照有干扰。因此在此项薄层色谱鉴别中仅保留蒙花苷对照品进行对照。
[0097] 由于供试品中背景颜色深，现对供试品进行进一步处理，将供试品溶液蒸干，残渣 用水3ml使溶解，加在14~30目，2g，内径为lcm的聚酰胺柱上，用水50ml洗脱，弃去水洗脱 液，再用乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。其余操 作同上，结果参见图11。结果显示供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜 色的斑点，但斑点Rf (比移值)值高，且和相邻斑点分离不清晰，故重新选择展开剂。取对照 品溶液和供试品溶液展开剂乙酰丙酮:丁酮：乙醇:水=1:3:3:13进行试验。结果参见图12。 结果显示供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且分离效果 好，斑点清晰，阴性对照无干扰。
[0098] 采用其他展开剂进行试验：乙酸乙酯：丁酮:三氯甲烷：甲酸:水=15:15:6:4:1，二 氯甲烷:乙酸乙酯:丁酮：甲酸:水= 8:15:15:2:1，结果供试品的斑点分离不好，存在干扰。
[0099]最终确定的小蓟中蒙花苷薄层色谱鉴别方法如下：
[0100] 取本品治疗血尿的中药组合物〇.5g,加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸 干，残渣用水3ml使溶解，加在14~30目，2g，内径为lcm为聚酰胺柱上，用水50ml洗脱，弃去 水洗脱液，再用乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。 另取蒙花苷对照品，加甲醇制成每lml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法试 验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各ΙμL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酰丙酮：丁 酮：乙醇：水=1:3 :3:13为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，晾干约1小时，置 365nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，见相同颜色的荧光 斑点。
[0101] 3.2小蓟薄层色谱鉴别方法的耐用性试验
[0102] 按所建立的小蓟薄层色谱鉴别方法在不同的温湿度条件下进行考察：图12、图13、 图14结果显示，在不同的温度和湿度环境下，供试品色谱中，在与蒙花苷对照品相应的位置 上，均能显示相同颜色的荧光斑点。
[0103] 3.3 10批治疗血尿的中药组合物的中小蓟薄层色谱的鉴别
[0104] 取10批治疗血尿的中药组合物的依法进行试验，结果参见图15。结果显示10批治 疗血尿的中药组合物的供试品色谱中，在与蒙花苷对照品色谱相应的位置上，均显相同颜 色的荧光斑点，且分离效果好，斑点清晰，阴性对照无干扰。
[0105] 通过专属性、耐用性及10批样品试验，结果显示供试品色谱中，在与蒙花苷对照品 色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点，且分离效果好，斑点清晰，阴性对照无干扰，此方 法操作简便，专属性强，重现性好。
[0106] 实施例4
[0107] 4.1仪器及试药
[0108]高效液相色谱仪:Agilent 1200型高效液相色谱仪
[0109] Agilent ZORBAX SB-Cis高效液相色谱柱
[0110] 乙腈、甲醇、十二烷基磺酸钠为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
[0111] 天平:赛多利斯电子天平、TB-215D电子分析天平。
[0112] 超声仪：AS 7240A Ultrasonic Cleaner
[0113] 盐酸小檗碱对照品：中国药品生物制品检定所，批号110713-200911，供含量测定 用，纯度86.8%，使用前无需处理。
[0114] 治疗血尿的中药组合物的：均由云南理想药业有限公司提供批号：20150101， 20150102,20150103,20141011,20141012,20141013,20141014,20141015,20150104， 20140304,2012010243,2012030299,20120301100,20120106101,20120104102, 20120105103,20120303104,20120306113,2013090315,20130904173
[0115] 制备阴性对照的药材:均由由云南理想药业有限公司提供。
[0116] 4.2溶液的制备
[0117] 4.2.1对照品溶液的制备
[0118] 精密称取盐酸小檗碱对照品0.03770g，置50ml量瓶中，加盐酸：甲醇=1:100混合 溶液溶解并至刻度，摇匀，即得浓度为〇. 6545mg · πιΓ1对照品溶液A。精密量取对照品溶液A 5ml置50ml量瓶中，加盐酸：甲醇=1:100混合溶液溶解并至刻度，摇匀，即得浓度为65.45μ g · πιΓ1对照品溶液Β。
[0119] 4.2.2供试品溶液的制备
[0120] 用盐酸：甲醇=1:100混合溶液为提取溶剂，采用超声处理的方法作为提取方法。
[0121] 取治疗血尿的中药组合物的批号：2012010243装量差异项下，混匀，取约0.3g，精 密称定，精密加盐酸：甲醇=1:100混合溶液50ml，置具塞锥形瓶中，称定重量，分别超声10、 20、30、40、50、60分钟，功率250W，频率40kHz，制得供试品溶液，结果参见表1。
[0122] 表1测定盐酸小檗碱的供试品溶液超声时间的考察
[0123]
[0124] 由测定结果看，超声40分钟与50分钟差别不大，超声60分钟能够完全的提出制剂 中的盐酸小檗碱，但由于时间过长，黄柏采用的超声40分钟作为提取时间。
[0125] 经以上试验比较，供试品溶液的制备方法确定为：取装量差异项下的本品治疗血 尿的中药组合物，混匀，取约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸：甲醇=1:100 混合溶液50ml，称定重量，超声处理40分钟，放冷，用盐酸：甲醇=1:100混合溶液补足减失 的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0126] 4.2.3阴性样品溶液的制备
[0127] 取处方中除黄柏外的其它药材，按处方剂量及制法和工艺要求制备不含黄柏的空 白样品，照上述4.2.2供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。
[0128] 4.3色谱条件
[0129] 4.3.1最大吸收波长的确证
[0130] 取对照品溶液，用紫外分光光度法在190nm-400nm的波长范围内进行扫描，结果显 示在348 · 8nm波长处具有最大吸收。因此选取349nm为检测波长。
[0131] 4.3.2流动相的选择
[0132] 采用的流动相：乙腈:0.1 %磷酸溶液=45:55。0.1 %磷酸溶液，每100ml加十二烷 基磺酸钠0. lg。结果表明，采用上述流动相时，所测成分盐酸小檗碱峰的分离度及分析时间 能得到满意的结果。
[0133] 4.3.3色谱条件的确定
[0134] 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Ci8(150mmX4.6mm，5ym);
[0135] 流动相：乙腈:0.1 %磷酸溶液=45:55;每100ml的0.1 %磷酸溶液加十二烷基磺酸 钠