一种基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纸芯片微流控技术领域，具体涉及一种检测汞离子的方法。
【背景技术】
[0002]汞是一种可以在生物体内积累的毒物，它很容易被皮肤以及呼吸和消化道吸收。水俣病是汞中毒的一种。汞破坏中枢神经组织，对口、粘膜和牙齿有不利影响。长时间暴露在高汞环境中可以导致脑损伤和死亡。尽管汞的沸点很高，但在室内温度下饱和的汞蒸气已经达到了中毒计量的数倍。是一种对人体极具生理毒性的重金属离子。
[0003]纸作为一种二维的材料，具有吸水性好、比表面积大、环保、生物相容性好等优点，此外由于它的易加工成型性，近年来被人们广泛重视。自2007年Whitesides课题组开展了纸芯片上的检测技术后，纸芯片的应用在科研上得到迅速地发展。并利用纸芯片的特点成功的研制出验孕试纸条、血糖试纸条以及其他的病原体检测试纸条等。人们不仅关注于纸芯片的低成本，更关注于纸芯片给人们带来的便利，但是现如今的纸芯片制作相对比较麻烦，而且需要一些后期的处理。
[0004]所以形成一种方便快捷的纸芯片制作方法迫在眉睫。
[0005]焚光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer，FRET)，是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在1nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提出了一种能够快速、直接、低价地检测汞离子的方法，同时为可视化检测提供基础。
[0007]本发明的提出检测汞离子的方法，是一种基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法，具体是以纸芯片为为载体，利用荧光能量共振转移(FRET)的方法检测重金属萊离子，根据Cy3焚光染料标记Hg2+适配体(Cy3-Hg2+-aptamer)能特异性结合Hg2+开$成T-Hg2+-T结构的性质，以Cy3-Hg2+_aptamer作为焚光报告分子，氧化石墨稀作为焚光淬灭剂，快速、低成本、直接地检测Hg2+。
[0008]本发明的基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法，具体操作步骤如下:
1、利用纸芯片切割机完成纸芯片的设计与切割;纸芯片材质为玻璃纤维；
2、用氧化石墨烯处理纸芯片(纸芯片上滴加4.0-5.0yL氧化石墨烯，自然晾干)；
3、向经氧化石墨稀处理的纸芯片上滴加Hg2+适配体:Cy3-Hg2+-aptamer，然后再向此纸芯片上加入事先配制好的萊离子溶液;暗处反应10min-30min;
4、在530-600nm激发光波长下，用荧光倒置显微镜激发，得到荧光恢复图片，用数码相机将荧光恢复图片记录下来(此过程在暗处操作)。
[0009]本发明中，纸芯片一般米用圆形，直径:2.00mm-3.0mm，厚度:0.2mm-0.5mm。
[00?0]本发明中，用于纸芯片处理的氧化石墨稀浓度为0.5-1.0mg/mL。
[0011 ]本发明中，Hg2+适配体:Cy3-Hg2+_aptamer浓度为5.0-10.0μΜ。
[0012]本发明中，汞离子溶液的浓度为0.2-1000μΜ，由PBS缓冲液配制，调节pH到7.2-7.4。
[0013]本发明中，用到的纸芯片切割机为普通的家用式切割机。
[0014]本发明中，检测时所用的仪器为荧光倒置显微镜和数码相机。
[0015]与现有报道相比，本发明具有操作简单、成本低、快速直接等有益效果:
1、本发明方法采用纸芯片切割机直接将玻璃纤维切成想要的芯片，无需后续处理，方法简单易操作；
2、本发明方法的纸芯片材质为玻璃纤维，由于玻璃纤维固有的强度使得纸芯片易于切害J，而且可以达到微米级别，以及超强吸水性加速了反应的速度；
3、本发明方法的数据处理环节采用荧光倒置显微镜和数码相机分别来激发和收集数据，降低了检测成本，简化了实验过程，而且通过获取的照片可以直接得出实验结论。
【附图说明】
[0016]图1基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的原理图。
[0017]图2基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的荧光电子照片。
[0018]图3基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的灵敏度验证。
【具体实施方式】
[0019]下面对本发明结合附图做进一步说明:
1、用家庭式的薄片切割机作为形成玻璃纸芯片的主要工具，设计和制作了二维的微小纸芯片(例如直径:3.0mm;厚度:0.5mm)，此纸芯片不需要特殊的修饰或者活化步骤；
2、纸芯片上的荧光能量共振转移检测汞离子的灵敏度验证，具体步骤为:
(1)取灭菌过的纸芯片分别滴加4.0yL氧化石墨烯，自然晾干；
(2)向以上的纸芯片上滴加2.0yLCy3标记的萊离子aptamer;置于暗处直到其表面没有明显的液体聚集；
(3)在步骤(2)暗处理的过程向离心管中分别加入浓度梯度的汞离子溶液3.0yL(梯度为:0.2 0.5 1.0 10.0 50.0 200.0 500.0 1000.ΟμΜ)，用pH为7.4的PBS缓冲液调其pH;
(4)将步骤(3)中的反应液滴加到步骤(2)中的纸芯片上，暗处反应1min;
(5)将纸芯片放到荧光倒置显微镜下，激发波长为580nm，用数码相机拍下荧光恢复的照片(此过程在暗处操作)；
(6)最后利用Photoshop和ImageJ软件将得到的荧光图片进行了处理，得到了灵敏度曲线图，参见图3。
【主权项】
1.一种基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法，其特征在于，以纸芯片为载体，利用荧光能量共振转移的方法检测重金属汞离子，根据Cy3荧光染料标记Hg2+适配体Cy3-Hg2+_aptamer能特异性结合Hg2+形成T-Hg2+-T结构的性质，以Cy3-Hg2+_aptamer作为焚光报告分子，氧化石墨烯作为荧光淬灭剂，直接地检测Hg2+。2.根据权利要求1所述的基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法，其特征在于，具体操作步骤如下: (1)利用纸芯片切割机完成纸芯片的设计与切割;纸芯片材质为玻璃纤维； (2)用氧化石墨烯处理纸芯片:纸芯片上滴加4.0-5.0yL氧化石墨烯，自然晾干； (3 )向经氧化石墨稀处理的纸芯片上滴加Hg2+适配体:Cy3-Hg2+-aptamer，然后再向此纸芯片上加入事先配制好的萊离子溶液;暗处反应10min-30min; (4)在530-600nm激发光波长下，用荧光倒置显微镜激发，得到荧光恢复图片，用数码相机将荧光恢复图片记录下来，此过程在暗处操作。3.根据权利要求2所述的基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法，其特征在于，所述纸芯片为圆形，直径:2.00mm-3.0mm，厚度:0.2mm-0.5mm。4.根据权利要求2所述的基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法，其特征在于，用于纸芯片处理的氧化石墨稀浓度为0.5-1.0mg/mLo5.根据权利要求2所述的基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法，其特征在于，Hg2+适配体:Cy3-Hg2+_aptamer浓度为5.0-10.ΟμΜ。6.根据权利要求2所述的基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法，其特征在于，所述汞离子溶液的浓度为0.2-1000μΜ，由PBS缓冲液配制，调节pH为7.2-7.4。
【专利摘要】本发明属于纸芯片微流控技术领域，具体公开了一种基于纸芯片的荧光共振能量转移检测汞离子的方法。本发明此以玻璃纤维芯片作为载体，利用荧光能量共振转移的方法检测重金属汞离子。根据Cy3荧光染料标记Hg2+适配体（Cy3-Hg2+-aptamer）能特异性结合Hg2+形成T-Hg2+-T结构的性质，以Cy3-Hg2+-aptamer作为荧光报告分子，氧化石墨烯作为荧光淬灭剂，快速、低成本、直接地检测Hg2+。纸芯片由普通的家用切割机设计和切割而成，不需要进一步的修饰或者活化；本发明还将荧光倒置显微镜作为激发光源为荧光图片的获取提供激发光，最后用数码相机将获取的荧光图片记录下来，为疾病诊断和生物分析提供了潜在的需要。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105527266
【申请号】CN201610043793
【发明人】李花, 方雪恩, 孔继烈
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月22日