合时使具有羧酸、氨基或环氧基等官 能团的单体与其它单体进行共聚，按照常规方法藉由该官能团使抗体亲和性物质（例如瓜 胶口 乂歹》、蛋白质A、蛋白质G)与聚合物结合。或者，也可以在聚合物的聚合时使具有 羧酸、氨基或环氧基等官能团的单体与其它单体进行共聚，并按照常规方法使针对检测对 象抗原的抗体(结合性物质)与这些官能团直接结合。如此，可以省去连结物质的使用。 [0095](颗粒侧结合性物质）
[0096]颗粒侧结合性物质为任意的材料，根据需要并根据靶标物质的种类来适当选择即 可。作为吸附或结合在上述复合颗粒的表面的生物分子(结合性物质），例如可以举出抗原、 抗体、DNA、RNA、糖、糖链、配体、受体、蛋白质或肽。此处，配体是指与蛋白质特异性结合的物 质，例如是指与酶结合的底物、辅酶、调节因子、或者激素、神经递质等，不仅包括低分子量 的分子或离子，还包括高分子量的物质。此处所用的抗体可以为任意类型的免疫球蛋白分 子，也可以为Fab等具有抗原结合部位的免疫球蛋白分子片段。另外，抗体可以为单克隆抗 体，也可以为多克隆抗体，优选为具有不同的抗原识别部位的两种单克隆抗体。使结合性物 质结合于连结物质的方法没有特别限定，可以利用这种技术中的常规方法来进行。
[0097] 根据图5所示的示例，将优选的材料示于下述表A中。
[0098] 【表A】
[0100] [分散剂]
[0101] (分散剂基剂）
[0102] 分散剂基剂例如为亲水性的高分子化合物，优选为聚阴离子或聚阳离子。聚阴离 子是指具有2个以上阴离子基团的物质，聚阳离子是指具有2个以上阳离子基团的物质。作 为聚阴离子的示例，可以举出DNA和RNA等核酸。这些核酸中沿着核酸骨架存在2个以上的磷 酸二酯基，由此具有聚阴离子的性质。另外，聚阴离子还包括含有多个羧酸官能团的多肽 (由谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸构成的多肽）、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、以及含有丙烯酸或 甲基丙烯酸作为聚合成分的聚合物、羧甲基纤维素、透明质酸以及肝素等多糖等。另一方 面，作为聚阳离子的示例，可以举出聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚烷基胺、聚乙烯亚胺 或聚丙基乙烯亚胺等。需要说明的是，聚阴离子(羧基)或聚阳离子(氨基）的官能团数优选 为25个以上。
[0103](分散剂侧结合性物质）
[0104] 分散剂侧结合性物质根据需要并根据靶标物质的种类来适当选择即可。其种类优 选考虑向上述分散剂基剂中的导入来选择。具体物质与作为上述颗粒侧结合性物质所列举 的物质含义相同。
[0105] 分散剂基剂与结合性物质的结合方法没有特别限定，例如可以举出使双方与相互 具有亲和性的物质(例如，亲和素和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S转移酶)结合并藉由这些 物质间接结合的方法。在使两者直接结合的情况下，可以藉由官能团进行结合，例如在使用 官能团的情况下，可以根据Ghosh等的方法(Ghosh et al:Bioconjugate Chem.、l、71_76、 1990)的马来酰亚胺-硫醇偶联来进行结合。具体而言，可以举出下述两种方法。在其第1种 方法中，首先在核酸的5'端导入巯基(别名：硫氢基），另一方面，使6-马来酰亚胺己酸琥珀 酰亚胺酯(例如，"EMCS(商品名)"（同仁化学研究所公司制造））与抗体反应而导入马来酰亚 胺基。接着，使这两种物质藉由巯基和马来酰亚胺基而结合。在第2种方法中，首先，与第1种 方法同样地在核酸的5 '端导入巯基，使作为同双官能性试剂的N，N-1，2-亚苯基二马来酰亚 胺进一步与该巯基反应，由此向核酸的5'端导入马来酰亚胺基，另一方面，向抗体上导入巯 基。接着，使这两种物质藉由巯基和马来酰亚胺基而结合。
[0106] 除此以外，作为将核酸导入至蛋白质中的方法，例如已知Nucleic Acids Research第15卷5275页（1987年）和Nucleic Acids Research第16卷3671页（1988年）中记 载的方法。这些技术可以应用于核酸与抗体的结合。
[0107] [靶标物质]
[0108] 作为靶标物质，可以举出临床诊断中利用的物质，具体而言，可以举出体液、尿、咳 痰、粪便等中包含的人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M、人免疫球蛋白A、人免疫球蛋白E、人白 蛋白、人纤维蛋白原(纤维蛋白和它们的分解产物）、α-甲胎蛋白（AFP)、C反应蛋白（CRP)、肌 红蛋白、癌胚抗原、肝炎病毒抗原、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盘催乳素(HPL)、HIV病 毒抗原、过敏原、细菌毒素、细菌抗原、酶、激素(例如，人促甲状腺激素(TSH)、胰岛素等）、药 剂等。
[0109]实施例
[0110] 通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不由此来限定解释。
[0111] 利用表A所示的材料重现了图5所示的体系。作为标记颗粒，如表A所示，将磁性颗 粒用二氧化硅颗粒被覆，其平均粒径为约200nm。使其含有于包含样本的试验液中，在约50 °C下加热15分钟。之后照射激发光(550nm)，通过上述标记颗粒的发光（580nm)状态对上述 样本中包含的靶标物质进行检测。此时，在样本的存在下，分散剂藉由靶标物质结合于磁性 荧光热响应性颗粒上，因而维持了分散，结果，与加热前相比，荧光强度未发生变化;与此相 对，在不存在样本的条件下，磁性荧光热响应性颗粒通过加热而凝聚，之后沉降，结果，与加 热前相比，确认到荧光强度降低。
[0112] 虽然结合其实施方式对本发明进行了说明，但是申请人认为，只要没有特别指定， 则本发明不限定于说明的任何细节，应当在不违反所附权利要求书所示的发明精神和范围 的情况下宽泛地解释。
[0113] 本申请主张基于2013年10月2日在日本进行了专利申请的日本特愿2013-207387 的优先权，将其参照于此并将其内容作为本说明书记载内容的一部分引入。
[0114] 符号说明
[0115] 1磁性材料相(磁性材料颗粒、核）
[0116] 2透明材料相(荧光二氧化硅相、壳）
[0117] 2a透明材料(连续相）
[0118] 2b焚光材料(焚光色素，分散相）
[0119] 3热响应性聚合物(热响应性聚合物相）
[0120] 4连结材料
[0121] 5颗粒侧结合性物质
[0122] 6分散剂侧结合性物质
[0123] 7分散剂基剂
[0124] 10热响应性荧光颗粒
[0125] 11复合颗粒
[0126] 20荧光标记颗粒(焚光热响应性磁性颗粒）
[0127] 30分散剂
[0128] 100连结结构物
[0129] S靶标物质
[0130] Μ 磁铁
【主权项】
1. 一种靶标物质的检测方法，其为使包含样本的试验液中含有下述标记颗粒、加热后 照射激发光、通过所述标记颗粒的发光状态来检测所述样本中包含的靶标物质的方法，所 述靶标物质的检测方法中， 通过所述加热，使所述标记颗粒的凝聚状态发生变化， 标记颗粒中，在包含磁性材料和荧光材料的复合颗粒的表面具有热响应性聚合物，进 而具有与靶标物质具有结合性的生物分子。2. 如权利要求1所述的靶标物质的检测方法，其中，在所述加热后，通过在所述试验液 中局部聚集的所述标记颗粒的荧光发光的显现，鉴定为不存在靶标物质;通过未显现出所 述聚集的荧光发光，鉴定为存在靶标物质。3. 如权利要求1或2所述的靶标物质的检测方法，其中，在所述试验液中导入分散剂。4. 如权利要求1~3中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述激发光的波长为 300nm~700nm，所述焚光的波长为350nm~800nm。5. 如权利要求1~4中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述复合颗粒包含具 有所述磁性材料的相和具有所述荧光材料的相，具有所述荧光材料的相由透明材料所形成 的连续相和荧光材料所形成的分散相构成。6. 如权利要求1~5中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，按照跨越处于10°C~ l〇〇°C范围的所述热响应性聚合物的临界溶解温度(CST)的方式来进行所述试验液的加热。7. 如权利要求1~6中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，对所述试验液赋予磁 力，使处于凝聚状态的所述标记颗粒聚集到被赋予了磁力的部位。8. 如权利要求1~7中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述复合颗粒的平均 粒径小于lym。9. 如权利要求5~8中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述透明材料包含二 氧化硅或聚苯乙烯。10. 如权利要求1~9中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，所述磁性材料为磁铁 矿、氧化银、铁氧体、钻铁氧化物、锁铁氧体、碳钢、妈钢、KS钢、稀土类钻磁铁或赤铁矿。
【专利摘要】一种靶标物质的检测方法，其为使包含样本的试验液中含有下述标记颗粒、加热后照射激发光、通过所述标记颗粒的发光状态来检测所述样本中包含的靶标物质的方法，该靶标物质的检测方法中，通过所述加热，使所述标记颗粒的凝聚状态发生变化[标记颗粒中，在包含磁性材料和荧光材料的复合颗粒的表面具有热响应性聚合物，进而具有与靶标物质具有结合性的生物分子]。
【IPC分类】G01N33/553, G01N21/64, G01N33/543
【公开号】CN105556289
【申请号】CN201480050961
【发明人】福岛将行, 大久保典雄, 三好一富, 西田昌贵
【申请人】古河电气工业株式会社
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年10月1日
【公告号】WO2015050150A1