基于基准点的相关显微术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及相关的显微术以及特别地涉及相关的光和电子显微术成像。
【背景技术】
[0002]生物样本中细胞结构的显微图像可以揭示关于生物过程和细胞架构的重要信息。使用光学显微术和电子显微术两者的相关方法产生最为综合性的结果。例如，光显微术信息可以用来识别样本内的生物重要性的区域和它们的动力学(dynamics)。然后电子显微术可以用来在固定和/或拉紧之后解析那些区域中的结构细节。
[0003]用常规光学显微镜收集的图像在分辨率方面被限制到所使用的光的波长的大约一半。对于实际的光学显微术，这个极限是200nm左右。因为这种限制，常规光学显微镜被说成是衍射受限的。许多技术为了提高分辨率超越衍射极限而存在。这样的技术被称为超分辨率技术。一个特定的技术是随机性光学重建显微术(STORM)。另一个技术是光激活定位显微术(PALM)。这些技术被用于使用可以在“开”状态和“关”状态之间切换的荧光标记来形成样本图像，在所述“开”状态中该标记发荧光，以及在所述“关”状态中该标记不发荧光。STORM典型地使用荧光有机染料，而PALM典型地使用荧光蛋白质。当标记在荧光发射之后进入黑暗状态并且然后在一段时间内对刺激不敏感时，实现状态之间的切换。由于这种未激活，绝大多数标记在给定的时间处于黑暗状态，其中仅有少数发射荧光。在形成样本的超分辨率图像方面，收集样本的较大系列的单独图像来独立于相邻标记定位每个个体标记。
[0004]在单独的图像中，每个标记表现为衍射受限点扩散函数。将高斯拟合应用到每个点扩散函数，以及标记位置现在由高斯拟合中心处的点来表示。通过对每个标记顺序成像并且应用这个过程，建立起样本的超分辨率图像，其允许成像越过衍射极限。可以使用例如被选择来基于不同标记的发射光谱来将它们的发射分离的二向色性光学器件来同时地成像不同颜色的荧光染料。使用若干波长通道可以允许同时对若干不同的细胞成分成像。
[0005]PALM的一个变化形式是干涉测量PALM，或“iPALM”。通过布置多个透镜，例如一个透镜在样本上方以及一个透镜在样本下方，所收集到的荧光可以引起与自身相干涉，以便产生干涉图案，其取决于两个透镜系统之间光路长度上的差异。这允许在Z维度上的定位。
[0006]非超分辨率技术(诸如共焦成像)也允许三维荧光成像(虽然具有降低的分辨率)。本发明还可以有利于也涉及这些类型的光学成像模态的相关显微术。
[0007]相关的显微术涉及用使用一种成像技术所创造的一个或多个图像覆盖利用另一种成像技术创造的一个或多个图像。例如，一个图像可以通过光学显微镜形成以及另一个图像可以通过带电粒子束显微镜形成。在一个示例中，iPALM被用来形成光学图像以及扫描电子束被用来形成一系列图像，并且这些图像被相关。iPALM技术提供了关于样本中具体区域的定位信息，而来自于电子显微镜的图像可以示出样本的总体特性。这个过程在生物样本成像方面是尤其有用的，其中生物样本中的特定蛋白质或其他结构可以用有机染料来在化学上被功能化或在基因上被改性以表示荧光蛋白质，其可以用iPALM来成像。将iPALM数据与来自带电粒子系统的数据相关提供了关于样本的超微结构内荧光标记位置的情境信息。选择合适的带电粒子制备和成像技术，可以构建三维图像来给出特定特征位于样本中何处的极好的视角。
[0008]在上文描述的相关显微术示例中，iPALM被用来获得样本的三维超分辨率荧光图像，首先通过顺序定位X-Y图像平面中的感兴趣区域以及从分子坐标(mo Iecularcoordinate)呈递二维超分辨率图像。从每个分子发出的光的同时多相位干涉进一步被用于提取Z轴位置，从而定义第三个维度。使用iPALM成像的相同样本然后由带电粒子系统来成像。带电粒子系统可以循环操作，其中例如聚焦离子束(FIB)去除样本的几纳米厚的层以暴露由SEM所成像的新表面。这个循环可以重复很多次以形成样本中的逐渐更深(ever-deeper)的层的一叠图像。
[0009]然而iPALM图像和电子显微术(EM)图像的相关是受限的。用于相关的现有方法涉及使用样本体积和支撑基板的交界面处的基准点的平面层。这允许了 X-Y平面中的精确位置信息，但在Z平面中定位不佳。例如，在二维X-Y平面中的相关通过使用如在颁发给Hess等人的美国专利N0.7,924,432( “Hess”)中所描述的技术来产生极好的数据。在这个技术中，在X和Y维度中的相关一般是直截了当地。然而，使用Hess的方法的Z平面的相关依赖于经切片的样本的顶表面和底表面之间的插值。这变得有问题，因为样本切片可能经历由于电子和离子束诱发的失真而引起的变化以及由于样本制备和插入到真空中以用于带电粒子处理而在样本中发生的变化。
[0010]当生物样本被制备用于带电粒子显微术时，经常导致对样本的物理变化。这些物理变化可能由于样本的“湿”制备而发生。这样的制备的一个示例是用重金属着色剂给样本着色，该重金属着色剂在带电粒子系统中是可见的。物理变化也可以起因于样本在带电粒子系统中暴露于真空环境。这些物理变化降低了使iPALM图像与相同样本的带电粒子图像相关以获得样本的(尤其在Z维度上的)有价值信息的能力。
[0011]已经做出了一些尝试来克服在Z维度上精确成像的缺陷。这样的尝试包括在样本的顶表面上使用荧光标记。然而，这样的尝试并未克服由于样本的变形引起的数据相关中的缺陷。由使用荧光标记的当前方法所呈现出的另一个困难是荧光染料遍及包含标记的样本体积的存在。如果染料遍及样本体积存在，则通常对于使用需要对个别的单光子发射事件进行成像的随机性iPALM或STORM过程来精确定位标记而言，存在过多的染料。结果，遍及样本体积而分散的染料的亮度可能产生如此多的荧光以至于难以精确定位附近的感兴趣区域。
【发明内容】
[0012]本发明包括用于光学图像和带电粒子图像的三个维度中的精确相关的方法。
[0013]—些实施例提供了遍及样本体积来分布对象或基准点的方法。这些基准点在光学图像和带电粒子图像两者中都是可见的，以及可以被用来使来自光学方法的图像中样本内的位置与来自带电粒子成像的图像中样本内的位置相关。在一些实施例中，基准点的形状以及基准点的位置被用来使图像相关。
[0014]前述内容已经非常宽泛地概述了本发明的特征和技术优点以便可以更好地理解接下来的本发明的详细描述。本发明的附加特征和优点将在下文中被描述。本领域技术人员应当领会的是，所公开的概念和具体实施例可以被容易地用作用于修改或设计用于实现本发明的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应该认识到的是，这样的等价构造并不脱离如在所附权利要求中所阐述的本发明的范围。
【附图说明】
[0015]为了更透彻地理解本发明及其优点，现在对连同附图一起进行的以下描述做出参考，其中:
图1示出了具有遍及样本体积而嵌入的多个基准点的样本。
[0016]图2示出了根据本发明实施例的涂有染料的球形基准点。
[0017]图3是经历物理变形之前和之后的样本的视图。
[0018]图4示出了根据本发明的安装到基板上以用于成像的样本。
[0019]图5示出了用于照明和观察荧光基准标记的光学显微镜的示意图。
[0020]图6示出了包括电子束镜筒和离子束镜筒的双射束系统的示意图。
[0021 ]图7示出了使用双射束系统的针对样本的切片和观察过程。
[0022]图8是示出了用于制备用于相关的光和电子显微术的样本的步骤的流程图。
[0023]图9是示出了用于iPALM的步骤的流程图。
【具体实施方式】
[0024]本文描述的方法用光学显微术和电子显微术之间的更精确的相关数据来产生样本的三维图像。该方法并未被限制于任意特定的光学显微术技术或限制于任意特定的带电粒子束成像技术。本发明可以与衍射受限光学技术和超分辨率光学技术一起使用。实施例也可以与宽场(broad field)光学技术(诸如PALM、iPALM、STROM、SIM、STED、结构化照明技术和4Pi)以及扫描技术(诸如扫描共焦显微术、近场扫描光学显微术和TIRF)这两者一起使用。本发明可以与确定性超分辨率技术(诸如STED、GSD、RESOLFT和SSHO以及随机性超分辨率技术(诸如SOFI和诸如SPDM、SroMphymod、PALM、FPALM、STORM和dSTORM之类的所有单分子定位方法(SMLM)) —起使用。这些技术作为示例而被列出以及并非是对本发明的应用的限制。
[0025]可以在本发明实施例中使用的带电粒子成像技术包括扫描电子显微术、扫描离子显微术、透射电子显微术和扫描透射电子显微术，包括这些技术的变化形式，诸如透射电子显微术层析成像技术。
[0026]本发明的一些实施例包括使用其表面上具有标记的纳米球体。在一些实施例中，表面可以被功能化以及随后被处理以提供标记，诸如荧光染料。对纳米球体的这种处理优选地对表面限制了染料的存在。通过对纳米球体的表面限制染料，球体的形状可以在光学图像中被更容易地确定，从而帮助追踪可能对样本体积发生的物理变化。
[0027]一旦已经使用超分辨率显微术和带电粒子显微术获得样本体积的三维图像，就可以比较包含在样本体积中的基准点的位置和形状，以及做出校正来对准位置。这允许超分辨率图像和带电粒子图像中的(特别是在Z轴上的)位置之间的优良相关。
[0028]在X-Y维度上的成像以及在Z维度上的初始成像可以使用已知的系统和方