]在脱水后，样本可以被嵌入830在塑料树脂中，以及被制备用于进行薄切片。对样本的切片832可以通过例如超薄切片术或使用聚焦离子束进行切片来执行。在步骤834中，样本的薄切片然后被放置在基板上。在一些实施例中，基板采取具有跨越表面分布的基准点的平面基板的形式，在样本体积和基板的边界处形成基准标记的二维阵列。在一些实施例中，基准点是金纳米棒以及基板是玻璃盖玻片，如图4中所示的。一旦样本已经被应用到基板，其准备好用于成像。一般地，光学成像步骤836优选作为第一成像过程，因为光学成像过程通常不引起样本体积中的引人注意的物理变化。在步骤838中然后实施带电粒子成像。
[0039]在一些实施例中，使用干涉测量PALM来产生3D超分辨率图像，如图9中所示的。所制备的样本902被放置在显微镜(诸如在图5中示出的显微镜)中，以及在步骤904中用激发光来照明该样本902。然后获得一系列荧光图像906。同时，也收集908干涉测量数据，该干涉测量数据被解译以提供Z轴信息。然后将高斯拟合应用910到每个发射器点扩散函数，以及与干涉测量Z轴数据相组合来给出以三个维度的点。这些点组成最终的3D图像912。在一些实施例中，多个荧光标记被连贯地成像。标记被选择为具有非重叠荧光发射光谱，这样它们的荧光可以通过使用例如二向色性光学器件而被分离。
[0040]如在图3中更清楚看到的，在将样本引入到带电粒子显微镜的真空腔中时，可能对样本体积发生物理变化。例如，样本可以收缩或变形，导致所使用的两个显微技术之间的样本体积中的位置之间的相关性的损失。本发明提高了样本体积的光学图像和带电粒子图像之间的相关性。如早先所描述制备和分布的基准标记在光学超分辨率图像以及带电粒子图像两者中都是可见的。基准标记遍及样本体积的分布和位置可以因此在光学体积图像和带电粒子体积图像两者中被确定。因为基准标记在样本体积矩阵内是不动的，它们连同样本体积经受的任意物理变化一起以及连同样本体积内的感兴趣特征一起移动。通过在光学图像和带电粒子图像两者中在样本体积内对基准标记的精确三维定位，可以确定每个基准点在成像技术之间的移动量，以及因此可以确定样本体积在成像过程之间的变形量。此外，基准点形状的任意变化可以被用于确定样本体积的变形。然后可以将校正应用到任一组图像以允许成像方法之间的精确相关。
[0041]在步骤480(图8)中，基准点在光学图像中的位置与基准点在带电粒子束图像中的位置相关。有用的相关技术由Huang等人(Int.Journal of Applied Mechanics 03，335(2011) “Huang”)提出。Huang使用一系列数字体积相关算法来致力于使用激光扫描共焦显微术的软凝胶的三维变形测量。第一算法被用来对整数体素(integer-voxel)相关计算进行加速。然后，使用两个不同的算法来获得子体素位移以及变形之前和之后的体积图像的应力场。尽管Huang使来自激光扫描共焦显微术的样本的不同层的图像相关，由Huang使用的技术可以被用于使光学图像和EM图像相关。Peeters等人(Ann.B1med.Engineering，2004年10月；32(10):1443-1452)描述了用于量化后续图像之间的变形的另一个可能方法，如Unlu等人(Medical Imaging, Vol.5747)所做的那样。其他方法可以在带电粒子图像和光学图像两者中使用边沿检测，以及将3D变换应用到图像来匹配光学图像和带电粒子图像之间的边沿。
[0042]在电子显微镜中失真的图像可以通过在该系列图像中重新分布像素来“去失真”，使得EM图像中的基准点与光学图像中基准点位置的三个维度中的位置匹配。此外，在步骤842中，也可以通过来自初始球形形状的基准点的电子束图像的偏差来确定失真，以及EM图像的像素可以被重新布置以使得基准点的图像示出基准点是球体。本发明的优选方法或装置具有许多新颖的方面，以及因为本发明可以被体现在用于不同目的的不同方法或装置中，不是每个方面都需要被呈现在每个实施例中。此外，所描述实施例的许多方面可以是可单独授予专利权的。本发明具有广泛的适用性以及如在以上示例中所描述和示出的那样可以提供许多益处。实施例将根据具体应用而极大地变化，以及并不是每个实施例都将提供所有益处以及满足可由本发明实现的所有目标。
[0043]应当认识到的是，本发明的实施例可以经由计算机硬件、硬件和软件二者的组合或通过储存在非临时性计算机可读存储器中的计算机指令来实施。根据在此说明书中描述的方法和附图，该方法可以使用(包括用计算机程序配置的非临时性计算机可读储存介质，其中这样配置的储存介质使计算机以特定和预定义的方式进行操作)标准编程技术在计算机程序中实施。每个程序可以按高级过程语言或面向对象的编程语言的方式来实施以与计算机系统进行通信。然而，如果期望的话，程序可以按汇编语言或机器语言的方式来实施。在任意情况下，语言可以是经编译的或经解释的语言。此外，程序可以运行在出于该目的而被编程的专用集成电路上。
[0044]进一步地，方法可以在任意类型的计算平台中实施，该计算平台包括但不限于个人计算机、迷你计算机、大型机、工作站、联网式或分布式计算环境、与带电粒子工具或其他成像设备等分离、成一体或通信的计算机平台。本发明的方面可以被实施于储存在无论是可从计算平台移除还是与计算平台成一体的非临时储存介质或设备(诸如硬盘、光学读和/或写储存介质、RAM、R0M等等)上的机器可读代码中，使得它可由可编程计算机读取，以用于当储存介质或设备被计算机读取来执行本文所描述的过程时配置和操作该计算机。此外，机器可读代码或它们的部分可以通过有线或无线网络来传输。本文中描述的发明包括这些和其他各种类型的非临时性计算机可读储存介质，此时这样的介质包含用于连同微处理器或其他数据处理器一起实施上文所描述的步骤的指令或程序。本发明也包括计算机本身，此时根据本文所描述的方法和技术对该计算机进行编程。
[0045]计算机程序可以被应用到输入数据来执行本文描述的功能以及由此变换输入数据来生成输出数据。输出信息被应用到一个或多个输出设备，诸如显示监视器。在本发明的优选实施例中，经变换的数据表示物理和有形对象，包括在显示器上产生物理和有形对象的特定视觉描述。
[0046]尽管先前描述中的许多部分都指向来自钻孔切割的矿物样本，但本发明可以用来制备任意合适材料的样本。除非另行指出，术语“工件”、“样本”、“基板”和“样品”在本说明书中被可互换地使用。进一步地，每当本文中使用术语“自动的”、“自动化的”或类似的术语时，这些术语将被理解为包括自动的或自动化的过程或步骤的手动发起。
[0047]在实施例中，一种用于利用光学地获取以及用带电粒子束系统获取的图像对样本体积中的感兴趣区域的位置进行三维相关的方法，包括提供支撑在基板上的样本体积，所述样本体积包含感兴趣区域以及包括在所述样本体积的光学图像和带电粒子图像两者中都可识别的遍及所述样本体积分布的基准点；将样本引入到光学系统中；使用所述光学系统对所述样本体积进行成像;使用一个或多个光学图像来识别遍及所述样本体积分布的基准点的三维位置;将所述样本体积引入到带电粒子束系统中；使用带电粒子束对所述样本体积进行成像;使用一个或多个带电粒子图像来识别遍及所述样本体积分布的基准点的三维位置；以及使用所述光学图像和所述带电粒子束图像中的基准点的位置来使所述样本体积中的感兴趣区域的位置相关。
[0048]在一些实施例中，遍及所述样本体积分布的基准点包括荧光标记。
[0049]在一些实施例中，所述荧光标记以足够低的浓度遍及所述样本体积分布，所述足够低的浓度能够在没有来自附近荧光标记的实质干扰的情况下对每个荧光标记单独地成像。
[0050]在一些实施例中，该方法进一步包括在样本体积和基板的交界面处的X-Y平面中的基准点的平面层，所述基准点与遍及所述样本体积分布的那些基准点是可区分的。
[0051]在一些实施例中，使用光学系统对所述样本体积进行成像包括三维超分辨率成像。
[0052]在一些实施例中，超分辨率成像包括光子激活定位显微术。
[0053]在一些实施例中，使用带电粒子束系统通过顺序成像和材料去除循环来获得对象的三维位置。
[0054]在一些实施例中，成像包括获得扫描电子显微镜图像以及材料去除包括用聚焦离子束研磨。
[0055]在一些实施例中，基准点包括荧光纳米粒子。
[0056]在一些实施例中，纳米粒子是染料功能化的球体。
[0057]在一些实施例中，所述染料功能化的球体包含存在于球体表面上并且未渗入球体内部的染料。
[0058]在一些实施例中，所述染料是可光激活的染料或蛋白质。
[0059]在一些实施例中，所述纳米粒子是量子点。
[0060]在实施例中，提出了一种用于校正样本体积中的空间变化的方法，其包括使用光学系统对所述样本体积进行成像;使用所收集的一个或多个光学图像来确定遍及所述样本体积分布的基准点的三维位置;将样本引入到带电粒子系统中；使用带电粒子束对所述样本进行成像;使用所收集的一个或多个带电粒子束图像来确定遍及所述样本体积分布的基准点的三维位置;将所述一个或多个光学图像中的基准点的位置与所述一个或多个带电粒子束图像中基准点的位置进行比较;计算所述一个或多个光学图像与一个或多个带电粒子图像之间的基准点的位置上的差异；以及对所述一个或多个光学图像或者一个或多个带电粒子图像应用校正来计及对所述样本体积的空间变化。
[0061 ] 在一些实施例中，所述方法进一步包括在已经应用校正后用一个或多个带电粒子图像覆盖一