一种将纳米氮化铁复合材料用于DNA提取的方法与流程

本发明属于材料科学和生命科学的交叉领域，涉及一种将纳米氮化铁复合材料用于DNA提取的方法。

背景技术：

DNA提取是生物技术、基础和临床医学、法医学以及农林学领域的常用实验技术。目前，提取DNA的传统方法，包括苯酚氯仿抽提法和离心柱法，它们的操作复杂，用时长，使用苯酚氯仿抽提时用还到了苯酚、氯仿等毒性试剂，且它们均不利于实现自动化、高通量操作。为了克服这些问题，出现了磁分离方法。磁分离方法是利用磁性微球，在微球的表面修饰上对核酸有吸附作用的特定活性官能基团，利用磁珠的磁性，在外磁场的作用下对DNA进行分离、富集的技术。随着纳米材料科学的发展，磁性微球已经开始被用于核酸的分离纯化，具有高效、快速、无污染、易于操作等优势，展现了广阔的发展前景。

目前已经用于DNA提取的纳米磁性材料为铁的氧化物，且氧化铁材料用于DNA分离纯化方面的技术已经趋于成熟。它已经有了比较合适的表面修饰方法以及与DNA大分子偶联的方法。市场上已经有了以Fe₃O₄作为磁性材料的试剂盒。

目前公开的专利和文献中，报道的磁分离法提取DNA所用的磁珠均为铁及铁的氧化物。尚未见将纳米氮化铁用于DNA的提取的报道。而氮化铁的磁性比传统的氧化铁要强，将其用于DNA的提取，与传统磁珠相比，有磁响应性好，分离灵敏、速度快等优势，而且分离同样的DNA，磁珠的用量会更少，更利于相关自动化、高通量仪器的研发。

石墨烯(Graphene)是一种由碳原子以sp2杂化轨道组成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜，只有一个碳原子厚度的二维碳材料。石墨烯具有强的韧性、电导性及导热性。铁及铁氮化合物具有优良的磁性能，但其化学稳定性较差，尤其是铁相。利用石墨烯作为包覆材料能够很好改善磁性颗粒的化学稳定性及电导性差的问题，使得这种复合材料能够很好地应用在磁流体、靶向药物、电磁波吸收材料、电磁屏蔽材料、氧化还原催化剂、精细陶瓷材料和锂电池等多个领域。

目前公开的专利和文献中，报道的多是碳包覆金属纳米颗粒的制备方法，如热解法、电弧法、浸渍法、CVD法等获得碳包覆铁纳米颗粒；对于石墨烯包覆的铁氮化合物纳米颗粒，并没有一种方法可以直接获得。

申请公布号为CN101347455A，公布日为2009年1月21日，专利名为一种碳包覆铁纳米粒子及其作为治疗肝癌药物载体的应用，其发明了一种碳包覆铁纳米粒子，特别是由直流电弧法制备获得。

申请公布号为CN102623696A，公布日为2012年8月1日，专利名称：一种壳核型包覆氮化铁纳米复合粒子制备方法与应用，其发明了一种壳核型碳包覆氮化铁纳米复合粒子制备工艺，特别是以直流等离子体原位合成的碳包覆铁纳米颗粒作为前驱体，再经过氮化工艺获得碳包覆氮化铁纳米复合粒子。

申请公布号为CN101710512A，公布日为2010年5月19日，专利名为石墨烯与碳包覆铁磁性纳米金属复合材料及其制备方法。其发明了一种由石墨烯及碳包覆的铁磁性纳米颗粒，且提供了一种特殊的CVD法制备出该种复合粉体材料。

这些方法都具有各自的优点，但是也有较多的不足，如试验设备复杂、制备条件严格、流程繁琐等，造成制备成本较高，从而影响石墨烯/碳包覆铁和铁氮化合物粉体的开发与应用。

技术实现要素：

鉴于上述本领域的现状，本发明目的在于提供一种将纳米氮化铁复合材料用于DNA提取的方法，通过对纳米氮化铁复合材料进行表面修饰，从而使其能与DNA大分子偶联，将其应用于DNA的提取。

本发明首先提供一种石墨烯包覆可变相态纳米磁性复合材料。

本发明还提供一种石墨烯包覆可变相态纳米磁性复合材料的制备方法，且该方法可以通过调控制备过程中等离子体的含氮比来调控磁性核的物相类型。

本发明技术方案如下：

一种石墨烯包覆可变相态纳米磁性复合材料，具有核壳结构，壳体为石墨烯壳，由多层石墨烯片组成，壳层厚度为5-50nm；核芯为磁性核，是颗粒直径为10-90nm相态可变的纳米磁性颗粒。

其中，所述纳米磁性颗粒的相态为铁相的α-Fe、γ-Fe，和γ-Fe(N)、γ’-Fe₄N、ε-Fe₃N、α”-Fe₁₆N₂相的铁氮化合物中的一种或多种。

本发明还提出所述的石墨烯包覆可变相态纳米磁性复合材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)连续并多次对等离子体产生装置的反应腔体进行惰性气体清洗后，以惰性气体充满整个反应腔体，隔绝空气；

(2)通过等离子体电源激发得到稳定的惰性气体等离子体流后，通过输入反应气源形成混合等离子体流，再将二茂铁粉末热蒸发，以载流气形式将二茂铁蒸气送入等离子体中心区域；

(3)利用等离子体高焓值及化学活化效果，将二茂铁迅速热解并发生化学反应后，在等离子体焰流尾部通过形核长大得到纳米磁性颗粒并且在颗粒表面包覆石墨烯；

(4)在惰性气体保护条件下将反应腔降到室温，收集得到的复合粉体，即为石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料。

等离子体法制备石墨烯包覆可变相态纳米磁性颗粒，与其他方法相比，制备颗粒度较小、粒径分布均匀且可通过控制等离子体中的含氮比来获得不同物相的磁性核。本发明采用二茂铁(C₁₀H₁₀Fe)为反应原料，通过等离子体促进反应，直接获得石墨烯包覆可变相态纳米磁性颗粒复合粉体。

其中，采用二茂铁(C₁₀H₁₀Fe)作为铁源及碳源，二茂铁粉末的蒸发流床温度设置为100～400℃；所述载流气为氩气、氮气、氨气的一种或多种。

进一步地，所述的等离子体流是感性耦合等离子体流、容性耦合等离子体流及微波耦合等离子体流中的一种，均由惰性气体和反应气源混合形成，反应气源和惰性气体的摩尔比例为0～5:1；所述的惰性气体为氩气、氦气、氖气中的一种或多种，反应气源为氢气、氮气、氨气中的一种或多种。

其中，通过调整反应气源、惰性气体和载流气的流量来控制等离子体的含氮比，从而控制纳米磁性颗粒的相态组成，使得纳米磁性颗粒的相态为α-Fe、γ-Fe、γ-Fe(N)、γ’-Fe₄N、ε-Fe₃N、α”-Fe₁₆N₂中的一种或多种。

本发明的优选技术方案之一为：所述等离子体的含氮比(氮原子占等离子体总原子量的摩尔比)为0时，所得复合材料中的纳米磁性颗粒的相态为铁相的α-Fe和γ-Fe中的一种或两种。

本发明的另一优选技术方案为：所述等离子体的含氮比为5～80％时，所得复合材料中的纳米磁性颗粒的相态为γ-Fe(N)、γ’-Fe₄N、ε-Fe₃N中的一种或多种。

本发明的优点在于：

(1)本发明提出的方法，利用二茂铁粉末作为铁源及碳源，以等离子作为合成环境，减少反应物带来的毒性及环境污染，利于大量生产。

(2)通过调控制备过程中等离子体的含氮比可以控制所获得的磁性纳米颗粒的物相。

(3)通过该途径所制备的碳包覆的纳米磁性粉末粒径细小、分布均匀、球形度好，且制备流程简短。

本发明所制备的石墨烯包覆可相变态纳米磁性复合材料同时具有良好的化学稳定性、磁性能及电性能，因此在靶向药物、磁流体、吸波材料，锂电池材料及催化剂等多个领域具有广泛的应用潜力。

上述方法收集到的复合粉体除含有所需要的纳米氮化铁复合材料外，还含有一些未包覆的石墨烯粉末，且所生成的磁性颗粒(因本发明所选用石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料主要成分为氮化铁，故在下文中也称石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料为纳米氮化铁复合材料)的粒径大小不一，可进一步对其进行筛选，以去除不具磁性的石墨烯粉末杂质，并将不同粒径的磁性颗粒分开。

由于刚制得的上述这种石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料，其生物相容性，分散性都还具有一定缺陷，并不能直接用于DNA的提取。还需要对其进行表面改性制备复合纳米磁性微球，并对制得的微球进行筛选便于标准化，这样才能方便用于DNA的提取。为了将纳米氮化铁复合材料用于DNA的提取，本发明还建立了一个对上述纳米氮化铁复合材料进行表面修饰，并将修饰后的微球用于DNA的提取的方法。

一种SiO₂基复合磁性微球，其由SiO₂对上述石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料进行包覆而制得，即在上述石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料的表面包覆有SiO₂层。

优选地，所述SiO₂基复合磁性微球中SiO₂层的厚度约为180-200nm。

优选地，所述SiO₂基复合磁性微球的粒径为200nm-300nm。

本发明还提供所述SiO₂基复合磁性微球的制备方法，包括以下步骤：

1)称取20mg上述石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料加入70ml含1％吐温20的异丙醇中，超声分散10min；

2)逐滴加入10ml含正硅酸乙酯的异丙醇；

3)加入一定比例的氨水和去离子水，调节pH至10，配成100ml悬浊液；

4)于45℃反应1.5h-2h，离心，用无水乙醇洗沉淀；

5)将沉淀重悬浮于无水乙醇，用磁分离法去除未包覆到纳米氮化铁复合材料上的SiO₂等杂质；

6)低速离心(转速一般500-800rpm)；将沉淀取出，干燥，即得。

正硅酸乙酯在碱性条件下水解产生SiO₂，产生的SiO₂团聚在所述纳米氮化铁复合材料表面，形成SiO₂的包覆层，当包覆的微球达到某一大小(在本阀门所述的环境下约为200-300nm)时，达到稳定状态，大小不再增长。当然，也有部分SiO₂自身之间发生团聚，形成SiO₂微球，这些微球会在步骤5中被筛出。

进一步地，还包括对所制得的SiO₂基复合磁性微球进行筛选的步骤，使所得的微球更好地用于DNA的提取。

具体地，所述筛选的方法包括：

1)将修饰好的SiO₂基复合磁性微球重悬浮于无水乙醇，超声分散(至少10min)；

2)静置沉淀(至少30min)，分别收集沉淀和上清；

3)将步骤2)中的上清继续静置沉淀(至少30min)；

4)重复上述步骤2)和3)，直至上清静置1h未形成沉淀为止。

经上述方法筛选出的磁珠粒径不等，粒径主要分布在200nm-300nm之间。

本发明还包括上述石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料或SiO₂基复合磁性微球在DNA提取上的应用。

本发明还提供一种利用上述石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料或SiO₂基复合磁性微球进行提取DNA的方法，包括以下步骤：

1)使用合适的方法裂解样品组织或者细胞，获得裂解液；

2)去除裂解液中可能会吸附到所述纳米氮化铁复合材料或SiO₂基复合磁性微球上的其它物质(比如RNA和某些蛋白质)；

3)向裂解液中加入所述石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料或SiO₂基复合磁性微球和偶联剂，使所述纳米氮化铁复合材料或SiO₂基复合磁性微球与DNA结合；

4)磁分离，将吸附上DNA的所述石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料或SiO₂基复合磁性微球与裂解液中的其它材料分离；

5)将DNA从所述石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料或SiO₂基复合磁性微球上洗脱，获得DNA。

优选地，所述偶联剂为盐和聚乙二醇混合溶液；所述盐可选用常用的可溶性中性盐。

本发明方法即可用于质粒DNA也可用于基因组DNA的提取；且能够完成各种常规DNA的提取。

本发明新型纳米氮化铁复合材料是一种由石墨烯包覆的复合材料，具有核壳结构，外壳为石墨烯，磁性核为铁的氮化物。与传统氧化铁磁性材料相比，这种材料有更好的磁性，在应用方面更具优势。一方面，磁性强的材料，达到同样的磁性要求它所用的量要更小。在外面包覆的介质厚度相同的条件下，以氮化铁为核心的复合微球可以做的更小。更小的体积带来的是更大的相对表面积，有利于其表面各种反应的发生，便于其和DNA的结合。另一方面，由于氮化铁的磁性较强，同种大小的颗粒，氮化铁的磁性要强于氧化铁，反应在DNA的提取的过程中就是分离时氮化铁的颗粒更加灵敏。选用纳米氮化铁复合材料的优势是它的磁响应性好，分离灵敏、速度快等优势，而且分离同样的DNA，磁珠的用量会更少，更利于相关自动化、高通量仪器的研发。

附图说明

图1为实施例1、实施例2和实施例3制备得到的石墨烯包覆可相变态纳米磁性复合材料的XRD图谱。

图2为实施例1制备的石墨烯包覆可变相态纳米颗粒复合材料的粒径分布及TEM图

图3和图5为实施例2制备的石墨烯包覆可变相态纳米颗粒复合材料的TEM图。

图4为实施例3制备的石墨烯包覆可变相态纳米颗粒复合材料的TEM图。

图6为实施例5中筛选出的磁珠分散在溶液中的实物照片及其在外磁场下聚集的照片。

图7为实施例6中提取的质粒的DNA浓度鉴定结果，以及电泳照片。

图8为实施例7中提取的人体组织DNA浓度结果，以及对其进行β-globin基因片段扩增鉴定的电泳照片。

图9为实验例1中所用材料的振动样品磁强计(VSM)检测图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

本发明提出的墨烯包覆可变相态纳米磁性复合材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)连续并多次对等离子体产生装置的反应腔体进行惰性气体清洗后，以惰性气体充满整个反应腔体，隔绝空气；

(2)通过等离子体电源激发得到稳定的惰性气体等离子体流后，通过输入反应气源形成混合等离子体流，再将二茂铁粉末热蒸发，以载流气形式将二茂铁蒸气送入等离子体中心区域；

(3)利用等离子体高焓值及化学活化效果，将二茂铁迅速热解并发生化学反应后，在等离子体焰流尾部通过形核长大得到纳米磁性颗粒并且在颗粒表面包覆石墨烯；

(4)在惰性气体保护条件下将反应腔降到室温，收集得到的复合粉体，即为石墨烯包覆纳米磁性颗粒复合材料。

采用的设备可以为已有的等离子体发生设备，实施例中，具体采用专利CN104851548A所公开的设备。

如无特别说明，实施例中采用的手段均为本领域常规的技术手段。

实施例中石墨烯包覆可变相态纳米磁性复合材料的制备的具体工艺如下：

实施例1：

以市售二茂铁粉为原料，多次用氩气清洗反应腔体后，以氩气为等离子形成气建立稳定运行的氩等离子体，其中氩气流量为5slpm，边保护气氩气流量为5slpm。恒温流床温度设置为120℃，通过流量为3slpm的氩气将二茂铁蒸气送入等离子体焰流中，经过等离子体高温分解和活化反应得到石墨烯包覆可变相态纳米磁性颗粒，产物的XRD图如图1所示，TEM图及粒径分布如图2所示。

由图1可知，实施例1的物相组成为α-Fe、γ-Fe和C。由图2可知，得到的石墨烯包覆可变相态纳米磁性复合材料粒径分布在10～90nm之间，平均粒径在26.3nm。颗粒基本呈球形或椭球型且被壳层包覆，测得核芯直径和壳层厚度约分别为20nm和5nm。经过对核壳的晶层间距进行测量发现，壳层的晶面间距约为0.35nm，与石墨烯的(002)面的晶面间距接近，这说明壳层由多层石墨烯片共同组成；核的晶面间距为0.203nm，与α-Fe的(110)晶面间距和/或γ-Fe的(111)晶面间距接近，这与XRD数据相符合。复合材料粒度分布均匀、球形度好。

实施例2：

以市售二茂铁粉为原料，多次用氩气清洗反应腔体后，以氩气和氮气为等离子形成气共同建立稳定运行的氩氮等离子体，其中氩气流量为5slpm，氮气流量为1slpm，边保护气氩气流量为10slpm。恒温流床设置为160℃，载气流量为1slpm的氩气，其他操作同实施例1。得到石墨烯包覆氮化铁纳米磁性颗粒的XRD图如图1所示，TEM图如图3所示。

由图1可知，实施例2制备的产物的物相组成为γ-Fe(N)、γ’-Fe₄N、ε-Fe₃N。由图3和图5可见，得到的石墨烯包覆可变相态纳米磁性复合材料粒径分布在10～90nm之间，具有明显的核壳结构，核芯外包覆多层的石墨烯片层。复合材料的分布均匀、球形度好。

实施例3：

以市售二茂铁粉为原料，多次用氩气清洗反应腔体后，以氩气和氮气为等离子形成气共同建立稳定运行的氩氮射频等离子体，其中氩气流量为5slpm，氮气流量为3slpm，边保护气氩气流量为10slpm。恒温流床设置为180℃，其他操作同实施例2。得到石墨烯包覆氮化铁纳米磁性颗粒的XRD图如图1所示，TEM图如图4所示。

由图1所示，实施例3的物相组成为γ-Fe(N)、ε-Fe₃N。由图4可见，得到的石墨烯包覆可变相态纳米磁性复合材料粒径分布在10～110nm之间，具有明显的核壳结构，核芯外包覆多层的石墨烯片层。复合材料的分布均匀、球形度好。

以上方法收集到的粉体除我们需要的磁性材料粉体外，还存在一些未包覆的石墨烯粉末，并且生成的磁性颗粒的粒径大小不一，需对其进行筛选，去除不具磁性的石墨烯粉末杂质，并将不同粒径的磁性颗粒分开。

实施例4：SiO₂基复合磁性微球及其制备(纳米氮化铁的表面修饰)

使用生物相容性更好，且易进行表面修饰的SiO₂对所实施例2制得的纳米氮化铁复合材料进行包覆，使其易于与DNA结合。

使用水解法用SiO₂包覆纳米氮化铁复合材料，包括以下步骤：

①称取20mg实施例1制得的纳米氮化铁复合材料加入70ml含1％吐温20的异丙醇中，超声分散10min；

②逐滴加入10ml含正硅酸乙酯的异丙醇；

③加入一定比例的氨水和去离子水，调节PH至10，配成100ml悬浊液；

④45℃反应1.5h-2h，离心，用无水乙醇洗沉淀；

⑤将沉淀重悬浮于无水乙醇，用磁分离法去除未包覆到纳米氮化铁复合材料上的SiO₂等杂质；

⑥低速离心(转速500-800rpm)；

⑦将沉淀取出，干燥。

实施例5：筛选出适合于DNA提取的磁珠

①将实施例4修饰好的SiO₂基复合磁性微球(磁珠)重悬浮于无水乙醇，超声分散10min；

②静置沉淀30min，分别收集沉淀和上清；

③将步骤②中的“上清”继续静置沉淀30min；

④重复上述步骤②、③，直至上清静置1h未形成沉淀为止。

经测试，静置1h未形成沉淀的磁珠均可用于DNA的提取。以上述方法筛选出的磁珠粒径不等，粒径主要分布在200nm-300nm之间。

图6为本实施例所筛选出的磁珠分散在溶液中的实物照片及其在外磁场下聚集的照片。

实施例6：SiO₂基复合磁性微球用于质粒DNA提取的方法

将实施例5制得的包覆好的磁珠，以一定浓度的盐和聚乙二醇溶液作为偶联剂，使其与DNA以氢键结合；提取、分离后用Tris缓冲溶液或者蒸馏水将DNA从复合微球上洗脱。

所用的大肠杆菌类型为XL1-Blue/pQE30，所用菌液由该种菌于37℃培养12h获得。

细菌裂解方法：

①取5ml大肠杆菌液于离心管中10000x离心1min；

②弃上清，加入150ul溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0))；

③加入150ul溶液II(用0.4N的NaOH和2％的SDS等体积混合)反复翻转数次，室温静置5min；

④加入150ul溶液III(醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8)，混合翻转数次，至白色絮状沉淀生成，14000x，4℃离心10min；

⑤取出上清，即得裂解液。

磁珠用于质粒DNA提取方法：

①向裂解液中加入450ul聚乙二醇和NaCl混合溶液，加入实微量施例3制备的SiO₂基复合磁性微球，反复颠倒混匀数次，静置5min；

②将离心管置于磁力架上，磁分离，去上清；

③用无水乙醇清洗沉淀，将离心管置于磁力架上，再次进行磁分离，去上清；

④待无水乙醇挥发，加入去离子水或者TE溶液溶解DNA；

⑤将离心管置于磁力架上，分离磁珠，吸出上清，所得溶液即为所提DNA。

图7为本实施例所提取的质粒的DNA浓度鉴定结果，以及电泳照片。

实施例7：磁性微球用于基因组DNA提取的方法

①将所需提取的组织、细胞样本进行预处理(绞碎、沉淀等)；

②加1ml 10％SDS裂解液，混匀；

③加50ul(1mg)蛋白酶K，37℃恒温反应数小时，直到组织完全解体；

④盐析，加入5mol/L氯化钠溶液，混匀数次，5000r离心1min，取上清；

⑤加入450ul聚乙二醇和NaCl混合溶液，加入微量实施例5制备的SiO₂基复合磁性微球，反复颠倒混匀数次，静置5min；

⑥将离心管置于磁力架上，磁分离，去上清；

⑦用无水乙醇清洗沉淀，将离心管置于磁力架上，再次进行磁分离，去上清；

⑧待无水乙醇挥发，加入去离子水或者TE溶液溶解DNA；

⑨将离心管置于磁力架上，分离磁珠，吸出上清，所得溶液即为所提DNA。

图8为本实施例所提取的DNA(人体组织)浓度结果，以及对其进行β-globin基因片段扩增鉴定的电泳照片。

实验例1

图9为实施例1所选用的石墨烯包覆纳米氮化铁复合材料的主要成分的振动样品磁强计(VSM)检测图，其饱和磁性强度为184.41emu/g。

已知室温下Fe₃O₄饱和磁化强度92emu/g，Fe₄N的饱和磁化强度为193emu/g。可见，本发明所用材料的磁性要好于传统的Fe₃O₄相关材料。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。