微粒扩增大鼠骨髓干细胞7天后结果。
[0043]图7是3D打印PLGA多孔支架的电镜图。
[0044]图8是组织工程软骨复合支架的电镜图。
【具体实施方式】
[0045]实施例1:软骨细胞外基质源性微载体的制备
[0046]将获取的500g新鲜猪关节软骨用无菌生理盐水反复冲洗干净后，与一定量无菌三蒸水混合，置于粉碎机内进行粉碎。分别过筛孔直径为100 μm和500 μm的不锈钢筛子，得到直径100 μ m-500 μ m的软骨细胞外基质源性微粒。4°C下加入1% SDS溶液，置于摇床内，持续振荡8小时。用无菌三蒸水冲洗掉残存SDS溶液后，再将微粒加入5ml DNA酶(50U/mL)和RNA酶(lU/mL)溶液中，37°C条件下，置于摇床中振荡4小时，去除细胞成分。将脱细胞后的软骨细胞外基质源性微粒进行彻底清洗，去除残留的脱细胞液。封装好后置于25kGyC。?射线下进行辐射灭菌，即得到无菌的软骨细胞外基质源性微粒。
[0047]本发明制备的软骨细胞外基质源性微粒呈圆形或椭圆形(图1，2)，甲苯胺蓝染色呈强阳性(图1)，证实其富含糖胺聚糖。
[0048]软骨细胞外基质源性微载体的脱细胞方法
[0049]将获取的新鲜猪关节软骨用粉碎机进行湿法粉碎。分别过筛孔直径为100 μ m和500 μ m的不锈钢筛子，得到直径100 μ m-500 μ m的软骨细胞外基质源性微粒。分别使用1 %Triton,3% Triton、0.5% SDSU% SDS,2% SDS的脱细胞溶液对软骨细胞外基质源性微粒进行处理，方法同上。再用DNA酶(50U/mL)和RNA酶(lU/mL)溶液处理，方法同上。
[0050]DNA含量、GAG含量、总胶原含量等检测结果表明，与其它组对比，1% SDS组不仅可以比较彻底的去除细胞成分，而且能保留较多的GAG和胶原等细胞外基质成分。33258染色示去细胞前，软骨细胞外基质源性微粒内可见大量软骨细胞残留(图3);脱细胞后，未见明显残存DNA碎片(图4)。
[0051]组织工程软骨复合支架的制备
[0052]将新鲜的猪关节软骨进行湿法粉碎、过筛、脱细胞、Co6°灭菌，制备得直径100 μ m-500 μ m的软骨细胞外基质源性微载体(方法同上)。将lOOmg软骨细胞外基质源性微载体和50ml含有2 X 106大鼠软骨细胞的DMEM细胞悬液混合，置于旋转式三维生物反应器的反应舱(Rotary Cell Culture Systems, RCCS-D)中共培养。为了利于细胞帖附到微粒上，生物反应器的转速设置为20rpm，每转1分钟，间歇30分钟。24小时后，转速设置为50rpm，持续转动。生物反应器置于37°C 5% 0)2条件下。培养基每2_3天更换一次。共培养1天后，可见大部分软骨细胞已帖附到微载体表面(图5)。培养7天后，可见软骨细胞在微载体表面大量扩增，并保持较高的细胞活性(图6)。将孔隙直径约为1000 μ m的3D打印PLGA多孔支架(图7)置于培养皿中，并浸没于1.2% (w/v)海藻酸钠溶液中。收集负载有软骨细胞的软骨细胞外基质源性微粒填充于PLGA多孔支架的孔隙中。向培养皿中添加适量102mmol CaCl2溶液，使上述溶液形成凝胶。将培养皿置于37°C培养箱中30分钟后，吸除多余的液体，用无菌PBS液洗三遍，即获得本发明所述组织工程软骨复合支架(图8)。
[0053]实施例2
[0054]按照实施例1中的方法制备得直径100 μ m-500 μ m的软骨细胞外基质源性微载体。
[0055]将lOOmg软骨细胞外基质源性微载体和50ml含有1 X 106大鼠骨髓间充质干细胞的DMEM细胞悬液混合，置于旋转式三维生物反应器的反应舱(Rotary Cell CultureSystems，RCCS-D)中共培养。为了利于细胞帖附到微粒上，生物反应器的转速设置为30rpm,每转1分钟，间歇30分钟。24小时后，转速设置为80rpm，持续转动。生物反应器置于37°C 5% 0)2条件下。培养基每2-3天更换一次。
[0056]将孔隙直径约为600 μπι的3D打印PLGA多孔支架置于培养皿中，并浸没于1.8%(w/v)海藻酸钠溶液中。收集负载有软骨细胞的软骨细胞外基质源性微粒填充于PLGA多孔支架的孔隙中。向培养皿中添加适量102mmol 2% (w/v)CaCl2溶液，使上述溶液形成凝胶。将培养皿置于37°C培养箱中10分钟后，吸除多余的液体，用无菌PBS液洗三遍，即获得本发明所述组织工程软骨复合支架。
[0057]实施例3
[0058]按照实施例1中的方法制备得直径100 μ m-500 μ m的软骨细胞外基质源性微载体。
[0059]将lOOmg软骨细胞外基质源性微载体和50ml含有8X 106大鼠软骨细胞的DMEM细胞悬液混合，置于旋转式三维生物反应器的反应舱(Rotary Cell Culture Systems,RCCS-D)中共培养。为了利于细胞帖附到微粒上，生物反应器的转速设置为50rpm，每转1分钟，间歇30分钟。24小时后，转速设置为lOOrprn，持续转动。生物反应器置于37°C 5%0)2条件下。培养基每2-3天更换一次。
[0060]将孔隙直径约为2000 μπι的多孔脱钙骨基质支架置于培养皿中，并浸没于2.4%(w/v)纤维蛋白原溶液中。收集负载有软骨细胞的软骨细胞外基质源性微粒填充于多孔脱钙骨基质支架的孔隙中。向培养皿中添加适量102mmol 4% (w/v)凝血酶溶液，使上述溶液形成凝胶。将培养皿置于37°C培养箱中20分钟后，吸除多余的液体，用无菌PBS液洗三遍，即获得本发明所述组织工程软骨复合支架。
【主权项】
1.一种组织工程软骨复合支架，是通过将负载有种子细胞的软骨细胞外基质源性微载体填充于三维多孔支架孔隙内复合构建而成的。2.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架，其特征在于，所述的种子细胞为软骨细胞或干细胞。3.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架，其特征在于，所述的软骨细胞外基质源性微载体的直径为100-500 μm，所述的三维多孔支架孔隙的直径为600-2000 μm。4.一种组织工程软骨复合支架的制备方法，具体如下: 1)将新鲜关节软骨置进行低温湿法粉碎并过筛，得到直径ΙΟΟμπι-δΟΟμπι的软骨细胞外基质源性微粒后，进行脱细胞处理，去除免疫原性，制备得到软骨细胞外基质源性微载体； 2)将软骨细胞外基质源性微载体和种子细胞置于生物反应器中共培养，形成软骨微组织； 3)将三维多孔支架置于培养皿中，并浸没于水凝胶前体液中； 4)将步骤2)得到的软骨微组织填充于上述三维多孔支架的孔隙中，并向培养皿中添加水凝胶致凝剂，使软骨微组织与三维多孔支架结合成一个复合支架； 5)将培养皿置于37°C培养箱中孵育10-30分钟后，清洗，最终获得所述组织工程软骨复合支架。5.如权利要求4所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的低温湿法粉碎，是指将获取的新鲜关节软骨用无菌生理盐水反复冲洗干净后，与无菌三蒸水混合，并加入碎冰块，4 °C条件下，置于粉碎机内进行粉碎。6.如权利要求4所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞方法采用的是化学脱细胞方法，具体如下:将软骨细胞外基质源性微粒加入1 % SDS溶液中，置于摇床内，4°C条件下振荡8小时，用无菌三蒸水反复冲洗后，再将软骨细胞外基质源性微粒加入DNA酶和RNA酶的混合溶液中，37°C条件下，置于摇床中振荡4小时。7.如权利要求4所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1)还包括:将封装好的软骨细胞外基质源性微载体置于25kGy Co6°射线下进行辐射灭菌后，存放于4°C条件下，备用。8.如权利要求4所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的共培养是指将种子细胞和软骨细胞外基质源性微载体以1-8X 106种子细胞/lOOmg软骨细胞外基质源性微载体的混合比例置于生物反应器中培养。9.如权利要求4所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的生物反应器的转速设置为20-50rpm，每转1分钟，间歇30分钟，24小时后，转速设置为50-100rpm，持续转动，生物反应器置于37°C 5% C02条件下，培养基每2_3天更换一次。10.如权利要求4所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的三维多孔支架为3D打印多孔PLGA支架或多孔脱钙骨基质支架；所述的水凝胶前体液为海藻酸钠溶液或纤维蛋白原溶液；所述的水凝胶致凝剂为CaCl2溶液或凝血酶溶液。
【专利摘要】本发明属于软骨组织工程领域。本发明公开了一种基于细胞外基质源性软骨微组织构建的组织工程软骨复合支架及其制备方法。具体而言，通过对新鲜软骨进行湿法粉碎、过筛、脱细胞等工艺，制备软骨细胞外基质源性微载体，可作为种子细胞扩增载体。生物反应器下，此微载体快速扩增软骨细胞并维持其表型，同时也可以促进干细胞向软骨方向诱导分化，并形成软骨微组织。将软骨微组织填充于具有良好力学性能的三维多孔支架的孔隙中，构建成本发明所述的组织工程软骨复合支架。这种复合支架具有良好的力学性能、富含天然软骨细胞外基质成分、为种子细胞的生长提供了良好的微环境、有利于干细胞向软骨方向诱导分化，并有望加速组织工程软骨的体内构建速度。
【IPC分类】A61L27/54, A61L27/38, A61L27/36
【公开号】CN105288737
【申请号】CN201510639642
【发明人】彭江, 尹合勇, 王玉, 汪爱媛, 卢世璧, 全琦, 孙振, 孙逊, 许文静, 郭全义, 朱昀, 刘舒云
【申请人】中国人民解放军总医院, 北京申佑生物科技有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年9月30日