一种高效液相色谱检测油脂中4-hhe和4-hne的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种高效液相色谱检测油脂中反式-4-羟基-2-己烯醛(4-HHE)和反式-4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)的方法。
【背景技术】
[0002] 无论是食品加工业还是家庭烹饪，热处理都是不可或缺的一部分，加热会加速油 脂以及富含脂质食品的氧化。油脂氧化会产生多种初级氧化产物和次级氧化产物，初级氧 化产物主要是氢过氧化物，但是氢过氧化物容易分解成次级氧化产物，例如醛类、酮、短链 烃，α，β-不饱和-4-羟醛就是醛类中重要的一类。α，β_不饱和-4-羟醛(结构式见附图1)主要 有以下五种：
[0003] 1、R = C2H5:反式-4-羟基-2-己烯醛(4-ΗΗΕ);
[0004] 2、R = C4H9:反式-4-羟基-2-辛烯醛(4-H0E);
[0005] 3、R = C5H11:反式-4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE);
[0006] 4、R = C6H13:反式-4-羟基-2-癸烯醛(4-HDE);
[0007] 5、R = C7H15:反式-4-羟基-2-^碳烯醛(4-HUE)。
[0008] 富含多不饱和脂肪酸的油脂容易氧化产生α，β-不饱和羟醛。在油脂过氧化反应过 程中，η-6系列的多不饱和脂肪酸(如亚油酸、花生四烯酸)会形成4-ΗΝΕ，η-3系列的多不饱 和脂肪酸(如DHA、EPA)会形成4-ΗΗΕ。由于鱼肉富含η-3系列的多不饱和脂肪酸，过氧化容易 产生4-ΗΗΕ;动物肉以及大部分的植物油富含η-6系列的多不饱和脂肪酸，过氧化容易产生 4-HNE。
[0009] 1980年，Benedetti以及同事们发现肝微粒体脂质过氧化过程中产生的主要的细 胞毒素是4-HNE，这一发现引起了人们对α，β不饱和羟醛的兴趣。羟醛的官能团有醛基、双 键、羟基这三种，属于比较活泼的物质，能够与巯基和氨基发生反应进而可以修饰蛋白质、 核酸以及其他的生物分子，具有细胞毒性和致突变性。其中，4-ΗΝΕ是最具代表性的α，β不饱 和羟醛，因为4-ΗΝΕ的毒性最大，含量也较为丰富。4-ΗΝΕ参与低密度脂蛋白的改性，容易形 成动脉粥样硬化;4-ΗΝΕ还可以与半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸形成稳定的化合物。目前很多证 据表明4-ΗΝΕ与动脉粥样硬化、海默病、帕金森综合征、亨廷顿舞蹈病有关。数据显示：100μΜ 以及更高浓度的4-ΗΝΕ可以引起急性毒性，导致细胞大量死亡；1-20μΜ范围内，4-ΗΝΕ可以抑 制DNA和蛋白质的合成;甚至在更低的浓度（<0. ΙμΜ)，4-ΗΝΕ就可以影响细胞的新陈代谢。
[0010] 目前，国内对4-ΗΗΕ、4-ΗΝΕ的研究主要集中在医学上，检测的方法主要是利用试剂 盒以及免疫细胞组化检测方法等。张莉在《香烟烟雾暴露对大鼠4-ΗΝΕ和γ -GCS表达的影 响》（山西医科大学，2012)中采用了双抗体夹心酶联免疫吸附(ABC-ELISA)法检测鼠 BALF及 外周血4-ΗΝΕ的含量。试剂盒以及免疫细胞组化检测方法适用于生物样本，而且成本也比较 高。国内对食品中4-HHE、4-ΗΝΕ的研究还比较少，没有建立食品中4-HHE、4-ΗΝΕ的检测方法。 目前国外文献报道检测食品中4-ΗΗΕ、4-ΗΝΕ的方法主要有HPLCXC-MSjPLC-MS^HNMI^， 但是近年来使用的这些方法大都需要衍生化，HPLC分析常用的衍生试剂是2,4_二硝基苯 肼，GC-MS常用的衍生试剂是五氟苄基羟胺盐酸盐和三甲基硅烷。但是衍生试剂只有基团针 对性，没有物质针对性;而且前处理操作程序相对比较麻烦，此外衍生试剂成本比较高，GC-MS、HPLC-MS的成本也较HPLC高很多，且需要专业的人员进行操作，维护和使用的成本也较 尚。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高效液相色谱 检测油脂中反式-4-羟基-2-己烯醛(4-HHE)和反式-4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)的方法。本方 法使用比较简单的HPLC，不需要衍生样品，前处理过程中实现了复杂的油脂样品的提取净 化，利用梯度洗脱实现样品中4-HHE与4-HNE同时检测。
[0012] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0013] -种高效液相色谱检测油脂中4-HHE和4-HNE的方法，包括以下步骤：
[0014] (一）提取油脂中的4-HHE、4-HNE:取油脂，加入含有BHT的蒸馏水，涡旋、超声后高 速离心后收集水层，然后再对油层重复上述加蒸馏水、涡旋、超声的操作一次，将两次收集 的水层合并，得到含有待检测物4-HHE、4-HNE的澄清溶液；
[0015]具体操作时，可以参考的参数条件为：取lg油样，加入10mL蒸馏水（含有10yL的 10mg/mL BHT溶液），祸旋2min，超声3min，重复祸旋、超声3次进行萃取，之后4500rpm转速下 离心10min后收集水层，然后再对油层重复上述加蒸馏水、涡旋、超声的操作一次，将两次收 集的水层合并，得到含有待检测物4-HHE、4-HNE的澄清溶液。
[0016](二）用萃取柱进行4-HHE、4-HNE的净化：用甲醇活化C18萃取柱，再用水平衡C18萃 取柱，将含有待检测物4-HHE、4-HNE的澄清溶液流经C18萃取柱，上样结束后，先用石油醚洗 脱非极性物质，之后利用甲醇水混合溶液（甲醇、水体积比80: 20)将目标物洗脱，氮气吹扫 去除石油醚，洗脱液定容，再对洗脱液进行浓缩，然后将浓缩液过0.22μπι的微孔过滤膜，待 用；
[0017]具体操作时，可以参考的参数条件为：首先用3mL甲醇活化C18萃取柱，再用3mL水 平衡C18萃取柱。然后将上一步骤得到的含有待检测物4-HHE、4-HNE的澄清溶液上样，上样 结束后，先用15mL石油醚洗脱非极性物质，之后利用3mL甲醇水混合溶液（甲醇、水体积比 80:20)将目标物洗脱入2mL的容量瓶，氮气吹扫去除石油醚，之后再用上述甲醇水混合溶液 定容至2mL，对洗脱液进行浓缩，然后将浓缩液过0.22μπι的微孔过滤膜，待用。
[0018] (三)利用HPLC进行分析，利用外标法进行定量:上述处理后浓缩液经HPLC检测后， 根据4-HHE、4-ΗΝΕ的线性标准曲线，计算油脂中4-HHE、4-ΗΝΕ的含量。
[0019] 4-HHE、4-ΗΝΕ的线性标准曲线的制作方法为:分别配制浓度为0.4、1、4、10、20、40μ g/mL的4-HHE以及0.4、4、10、20、40yg/mL的4-ΗΝΕ标准溶液，经HPLC检测(HPLC检测条件与对 待检测物的检测条件相同）后，根据进样浓度和对应色谱峰制成线性标准曲线。
[0020] HPLC检测工艺为：高效液相色谱(Surveyor plus，美国Thermo公司）分别以水和甲 醇为流动相A和流动相B，以流速0.25~1. OmL/min进行梯度洗脱，在最初的2min内，水和甲 醇的体积比是70:30，在2~20min内，体积比线性变化为0:100，100 %甲醇维持5min，25.1~ 3〇11^11内水与甲醇的比例是70:30。
[0021] HPLC检测使用的检测器为光电二极管阵列检测器，检测波为220-225nm，柱温为30 °C，进样量为2~5yL。
[0022] HPLC检测使用的色谱柱为反相C18柱，比较有代表性的有以下两种规格:4.6mmX 150mm，2.7μηι; 4.6mm X 250mm，5μηι。色谱柱的规格不同，流速就不同。
[0023]与现有技术相比，本发明方法使用比较简单的HPLC，不需要衍生样品，前处理过程 中实现了复杂的油脂样品的提取净化，利用梯度洗脱实现样品中4-ΗΗΕ与4-ΗΝΕ同时检测。 本发明检测方法简单、稳定，成本相对较低。在油脂以及油炸食品的分析领域具有很重要的 意义。
【附图说明】
[0024]图1为α，β-不饱和-4-轻醛的结构式；
[0025]图2为反式-4-羟基-2-己烯醛、反式-4-羟基-2-壬烯醛标准品的谱图；
[0026] 图3为油脂样品的谱图；
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