专利名称：一种重组广谱苏云金芽孢杆菌制备杀虫剂的方法
技术领域：
本发明涉及生物农药的制备方法，更具体涉及苏云金芽孢杆菌制备杀虫剂的方法。
本发明所称的重组广谱苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis LCJ-12)是通过基因工程手段构建的对鳞翅目和鞘翅目害虫均有高毒力的菌株，根据该菌既杀鳞翅目昆虫又杀鞘翅目昆虫的特点，取鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、菌(Jun)的第一个字母组成其代码LCJ，又因该菌是从众多重组工程菌中筛选出来的毒力最高、且编号为12的一株，所以将该重组广谱苏云金芽孢杆菌命名为Bacillus thuringiensis LCJ-12。
鳞翅目是我国农林牧业生产中危害最大的害虫，而鞘翅目害虫对农林牧业生产的危害仅次于鳞翅目害虫，1991年我国新疆霍城地区首次发现马铃薯甲虫入侵，迅速蔓延并对农作物造成巨大危害。因此，构建出对鞘翅目和鳞翅目害虫皆有效的重组广谱苏云金芽孢杆菌并运用其生产新型杀虫剂具有紧迫性和现实意义。
用该菌生产的杀虫剂可广泛应用于毒杀农、林、果、蔬上的小菜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫等鳞翅目害虫及小猿叶甲、马铃薯甲虫等鞘翅目害虫。
在重组广谱苏云金芽孢杆菌制备杀虫剂方面，文献“含二元毒素基因的苏云金杆菌重组子晶体蛋白质分析及其对蚊幼虫的毒性”(微生物学杂志，-1999，19(1)1-5)通过电转化法将含球形芽孢杆菌二元毒素基因的重组质粒pCW2转化野生型苏云金芽孢杆菌以色列亚种获得一株含二元毒素基因的重组菌株B+CW-1。重组菌株能表达二元毒素及-内毒素和cytA毒素，并形成2类位于芽孢孢外膜外的伴孢晶体。文献“杀虫防病基因工程枯草芽孢杆菌的构建”(生物工程学报，-1999，15(2)215-220)分别以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pHB201和pRP22为载体，通过感受态转化方法，将Bt HD-1杀虫蛋白质基因cry1Ac导入水稻纹枯病生防菌株枯草芽孢杆菌B916。工程菌株质粒酶切电泳分析，Southern印记分析和杀虫生物活性测定结果证实了cry1Ac基因的导入及其在B916中的有效表达。抑菌测定证明了工程菌保持了原野生型菌株良好的抑菌活性。文献“苏云金芽孢杆菌以色列亚种130KDa杀蚊蛋白质基因在枯草芽孢杆菌中的表达”将苏云金芽孢杆菌以色列亚种杀蚊蛋白质基因亚克隆到pNQ122载体上，通过枯草芽孢杆菌原生质体转化，得到KMr-CMs的正反向克隆子。蛋白质(Western-blotting)免疫杂交证明杀蚊蛋白质基因在枯草芽孢杆菌中表达了具有免疫活性的杀蚊蛋白质。所表达的杀蚊蛋白在实验中具有杀蚊活性。但上述各种杀虫剂均不具备同时杀鳞翅目害虫和鞘翅目害虫的功能。
本发明的目的在于，提供一种用重组广谱苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis LCJ-12)制备杀虫剂的方法，用该方法制备的杀虫剂对鳞翅目害虫和鞘翅目害虫均有良好的防治效果，且对人、畜及其它动植物无害，不污染环境，且可降低生产和使用成本，并提高农产品的质量。
为了达到上述目的，本发明采用如下制备方法1材料和方法1.1重组广谱苏云金芽孢杆菌的制备方法a、采用一株高效杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillusthuringiensis LCJ-12)，该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM201003，作为苏云金芽孢杆菌受体菌株，该菌株含cry3A基因；采用pHT304/1Ac10重组质粒，该重组质粒含杀鳞翅目昆虫的cry1Ac基因；b、在含有氨苄青霉素的LB培养基中接种大肠杆菌，35-37℃剧烈摇晃培养8-12小时，将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈震荡，加200μl溶液II；加150μl用冰预冷的溶液III，于4℃下12000g离心10分钟，用等量酚-氯仿-异戊醇抽提上清液，用2倍体积上清液的乙醇于-20℃沉淀DNA，得到大肠杆菌重组质粒pHT304/1Ac10c、将受体菌接种在LB培养基中，28-30℃摇动培养8-10小时后，冰浴20-30分钟，在4℃下12000g离心10分钟，先用电击洗脱液洗两次，再用电击缓冲液洗一次，最后悬浮在电击缓冲液中，得到受体菌电击感受态细胞，置-20℃保存；d、将pHT304/1Ac10质粒DNA与受体菌感受态细胞悬液充分混均，取200μl注入电击转化杯中，用大肠杆菌电击转化仪(E.coliGene Pulser)在2.5KV下电击一次，将电击液转入4mlLB培养基中，28-30℃振动培养2小时后，涂布于含红霉素20μg/ml的LB平板上，28-30℃下培养3天；e、在红霉素(20μg/ml)抗性平板上挑选单个菌落，涂片镜检，选取具有苏云金芽孢杆菌特征的菌落在红霉素平板上传代，以检测其稳定性，经过二十代的遗传传代和毒力生物测定及PCR检测，获得毒力最高的并含有cry1Ac及cry3A基因的重组广谱苏云金芽孢杆菌，即为本发明的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12。
所述的LB培养基为0.5％氯化钠(NaCl)，0.5％酵母粉，1.0％胰蛋白胨，余者为水，pH7.2-7.4。
所述的抗生素采用氨苄青霉素工作浓度为100μg/ml，红霉素工作浓度为20μg/ml。
所述的电击洗脱液为lmmol/L(pH7.0)N-双(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-(乙磺酸)，简称HEPES。
所述的电击缓冲液为1mmol/L(pH7.0)HEPES，10％甘油。
所述的溶液I为50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，10mmol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)。
所述的溶液II为0.2mol/mL氢氧化钠，1％十二烷基磺酸钠。
所述的溶液III为5mol/L乙酸钾，2.5mol/L冰乙酸。
所述的毒力生物测定所用的试虫为初孵棉铃虫(Helithisarmigera)幼虫及2龄柳蓝叶甲(Playiodera versicolora)幼虫。
所述的PCR检测是指用特异性引物检测cry1Ac及cry3A基因；检测cry1Ac基因的特异性引物序列为TYIUNI2 5’ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTATC3’TYIIAC 5’TCACTTCCCATCGACATCTACC3’检测cry3A基因的特异性引物序列为CoL1A 5’GTCCGCTGTATATTCAGGTG3’CoL2A 5’AGGTGCCAACTAACCATGTT3’1.2生产配方生产配方的主要成分有2.5％淀粉；0.4％蛋白胨；2.6％黄豆饼粉；0.1％酵母粉；2.0％玉米浆；0.2％鱼粉；0.2％磷酸二氢钾(KH2PO4)；0.04％七水硫酸镁(MgSO47H2O)；0.1％碳酸钙(CaCO4)；α-淀粉酶(占淀粉含量的1/400)。总含固量6.4％。1.3检测昆虫初孵棉铃虫(Helithis armigera)和2龄柳兰叶甲(Playioderaversicolora)。1.4生产过程1.4.1种子发酵500ml三角瓶，装培养基50ml，30±1℃，摇床转速为200r/min，发酵10-12小时终止。1.4.2生产发酵40吨发酵罐，装料25吨，每罐接种两个三角瓶，接种温度35-37℃，发酵温度28-31℃，恒速搅拌250r/min，通气量1∶0.5-1∶1.5，发酵至芽孢晶体形成并有40-50％孢晶分离时终止。消泡剂为泡敌BAPE，适量加入。
表1发酵罐中的发酵情况罐次菌体发育情况放罐pH生产周期效价20小时 38小时 (小时) (IU/μL)
1整齐同步孢晶脱落20％8.03824582发育良好30％孢晶脱落8.03826281.5发酵液后处理1.5.1悬浮剂生产发酵液经GF-105碟片式高速离心机循环离心后，仅去除约40％的上清液。在此种低倍浓缩的发酵液中按要求加入防腐剂和乳化剂等制成悬浮剂。1.5.2粉剂生产低倍浓缩发酵液直接或加10％轻质碳酸钙后，以BLSA规格的高压气流喷雾干燥机进行干燥，喷雾塔进口温度195-200℃，出口温度85-90℃。制得重组广谱苏云金芽孢杆菌杀虫剂可湿性粉剂。
表2后处理工艺生产菌剂的结果鳞翅目毒力效价鞘翅目毒力效价剂型含水量(％)IU/μl IU/mgCU/μlCU/mg悬浮剂 4600 - 5300 - -粉剂(直接喷雾) - 28600 - 32000 5.12粉剂(加碳酸钙) - 16000 - 21500 2.751.6杀虫剂的毒力效价测定1.6.1杀鳞翅目效价测定选用初孵棉铃虫，按照中华人民共和国农业行业标准NY293-95《苏云金芽孢杆菌制剂》中的规定进行。测得该重组广谱苏云金芽孢杆菌杀虫剂悬乳剂的毒力效价为4600IU/μl；粉剂的毒力效价为28600IU/mg；加入10％轻质碳酸钙的粉剂毒力效价为16000IU/mg。1.6.2杀鞘翅目效价测定选用2龄柳兰叶甲幼虫，以自制粉剂为标准制剂(毒力效价定为20000CU/mg)，参照行业标准方法进行测定。测得该重组广谱苏云金芽孢杆菌悬乳剂的毒力效价为5300CU/μl；粉剂的毒力效价为32000CU/mg；加入10％轻质碳酸钙的粉剂毒力效价为21500CU/mg。
重组广谱苏云金芽孢杆菌杀虫剂在田间试验和应用中对鳞翅目害虫的防效良好而稳定，已生产悬乳剂30吨，高效粉剂625公斤，生产工艺基本成熟，达到了工业化生产示范规模。由于杀虫范围包括了鳞翅目和鞘翅目害虫，一种杀虫剂具多种杀虫特性，无需同时生产多种杀虫剂，提高了使用价值，节约了生产成本和使用成本。且国内目前尚无杀鞘翅目苏云金芽孢杆菌商品制剂，因而经济价值提高，估计每吨生产成本因此可降低30％，价格可提高20％，按常规乳悬剂4000元/吨，一级粉剂50000元/吨计，综合经济效益可增加500元/吨(乳剂)和4000元/吨(粉剂)。根据21万亩应用资料的不完全统计，使用重组广谱杀虫剂，对鞘翅目害虫的防治效果明显优于市售苏云金芽孢杆菌制剂，降低了农药防治费用、增加了农作物产量，综合经济效益已近1367万元。经实验证明其安全性与野生苏云金芽孢杆菌杀虫剂无异，对人、畜及其它动、植物无害，不污染环境，且可提高农产品质量，有良好的社会和生态效益。因而，从优越性的杀虫特性、生产和使用成本降低、工业化生产技术成熟、对人和动植物安全、不污染环境及市场有需求等方面考虑，重组广谱苏云金芽孢杆菌杀虫剂有良好的推广应用前景。
重组广谱Bt杀虫剂的中试和工业化示范规模生产于湖北省康欣生物农药公司和江苏省江都淀粉化工厂进行。进行了发酵小试及中试、菌剂生产、田间试验、示范和大田应用、质量标准化及安全性试验。生产乳悬剂30吨，高效粉剂625公斤。乳悬剂毒力效价4600IU/μL(杀鳞翅目)和5200-5500CU/μL(杀鞘翅目)。可湿性粉剂毒力效价28600IU/mg(不加填料)、16000IU/mg(加填料)和18000-32000CU/mg。完成对棉铃虫、稻纵卷叶螟及甜菜夜蛾等鳞翅目害虫和猿叶甲、马铃薯甲虫等鞘翅目害虫的田间小区试验和示范应用。小区试验中，对上述鳞翅目害虫的防效分别为78.8-92.0％、69.8-85.7％、58.5-61.9％及58.1-63.7％，对上述鞘翅目害虫防效分别为97.0-100％及38.9-44.5％，而国内3种商品制剂及美国产品Dipel粉剂对鞘翅目害虫均无效。示范试验中，对棉铃虫、小菜蛾、烟青虫等鳞翅目害虫防效达到66.5-92.0％；对小猿叶甲防效达81.0-94.0％，对马铃薯甲虫防效为47.3-48.1％。大田应用面积21.05万亩，防治效果良好(表3)。初步建立了重组广谱Bt杀虫剂的质量标准化的检测技术系统。进行了急性毒性试验和生态安全性研究。获准了农业部遗传工程体中试级安全性评价和申报了野外释放级安全性评价。
表3重组广谱苏云金芽孢杆菌杀虫剂大田防治害虫的效果应用地点 防治害虫作物防效(％) 面积(万亩)河北定州等7地市棉铃虫 棉花63.0-90.011.6浙江嘉善等3地市猿叶甲 蔬菜70.0-92.01.5新疆霍城 马铃薯甲虫 马铃薯 67.8-85.72.95深圳市蔬菜基地 小菜蛾 蔬菜70.5-85.65.0合计 7种 5种 21.0权利要求
1.一种重组广谱苏云金芽孢杆菌制备杀虫剂的方法，其特征在于，该制备方法按下列步骤顺序进行(1)首先制备重组广谱苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis LCJ-12)，方法如下a、采用一株高效杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillusthuringiensis LCJ-12)，该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM201003，作为苏云金芽孢杆菌受体菌株，该菌株含cry3A基因；采用pHT304/1Ac10重组质粒，该重组质粒含杀鳞翅目昆虫的crylAc基因；b、在含有氨苄青霉素的LB培养基中接种大肠杆菌，35-37℃剧烈摇晃培养8-12小时，将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈震荡，加200μl溶液II；加150μl用冰预冷的溶液III，于4℃下12000g离心10分钟，用等量酚-氯仿-异戊醇抽提上清液，用2倍体积上清液的乙醇于-20℃沉淀DNA，得到大肠杆菌重组质粒pHT304/1Ac10；c、将受体菌接种在LB培养基中，28-30℃摇动培养8-10小时后，冰浴20-30分钟，在4℃下12000g离心10分钟，先用电击洗脱液洗两次，再用电击缓冲液洗一次，最后悬浮在电击缓冲液中，得到受体菌电击感受态细胞，置-20℃保存；d、将pHT304/1Ac10质粒DNA与受体菌感受态细胞悬液充分混均，取200μl注入电击转化杯中，用大肠杆菌电击转化仪(E.coliGene Pulser)在2.5KV下电击一次，将电击液转入4mlLB培养基中，28-30℃振动培养2小时后，涂布于含红霉素20μg/ml的LB平板上，28-30℃下培养3天；选取具有苏云金芽孢杆菌特征的菌落在红霉素平板上传代，以检测其稳定性，经过二十代的遗传传代和毒力生物测定及PCR检测，获得毒力最高的并含有cry1Ac及cry3A基因的重组广谱苏云金芽孢杆菌，即为本发明的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12；所述的LB培养基为0.5％氯化钠(NaCl)，0.5％酵母粉，1.0％胰蛋白胨，余者为水，pH7.2-7.4。所述的抗生素采用氨苄青霉素工作浓度为100μg/ml，红霉素工作浓度为20μg/ml。所述的电击洗脱液为1mmol/L(pH7.0)N-双(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-(乙磺酸)，简称HEPES；所述的电击缓冲液为1mmol/L(pH7.0)HEPES，10％甘油；所述的溶液I为50mmol/L葡萄糖，25mmol/L三羟甲基氨基甲烷(pH8.0)，10mmol/L乙二胺四乙酸(pH8.0)；所述的溶液II为0.2mol/mL氢氧化钠，1％十二烷基磺酸钠；所述的溶液III为5mol/L乙酸钾，2.5mol/L冰乙酸；所述的毒力生物测定所用的试虫为初孵棉铃虫(Helithisarmigera)幼虫及2龄柳蓝叶甲(Playiodera versicolora)幼虫；所述的PCR检测是指用特异性引物检测cry1Ac及cry3A基因；检测cry1Ac基因的特异性引物序列为TYIUNI2 5’ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTATC3’TYIIAC 5’TCACTTCCCATCGACATCTACC3’检测cry3A基因的特异性引物序列为CoL1A 5’GTCCGCTGTATATTCAGGTG3’CoL2A 5’AGGTGCCAACTAACCATGTT3’(2)生产配方的主要成分有2.5％淀粉；0.4％蛋白胨；2.6％黄豆饼粉；0.1％酵母粉；2.0％玉米浆；0.2％鱼粉；0.2％磷酸二氢钾(KH2PO4)；0.04％七水硫酸镁(MgSO47H2O)；0.1％碳酸钙(CaCO4)；α-淀粉酶(占淀粉含量的1/400)，总含固量6.4％；(3)检测昆虫采用初孵棉铃虫(Helithis armigera)和2龄柳兰叶甲(Playiodera versicolora)；(4)种子发酵用500ml三角瓶，装培养基50ml，30±1℃，摇床转速为200r/min，发酵10-12小时；(5)生产发酵用40吨发酵罐，装料25吨，每罐接种两个三角瓶，接种温度35-37℃，发酵温度28-31℃，恒速搅拌250r/min，通气量1∶0.5-1∶1.5，发酵至芽孢晶体形成并有40-50％孢晶分离时终止。消泡剂为泡敌BAPE，适量加入；(6)发酵液经GF-105碟片式高速离心机循环离心后，仅去除约40％的上清液，加入防腐剂和乳化剂制成悬浮剂；(7)低倍浓缩发酵液直接或加10％轻质碳酸钙后，以BLSA规格的高压气流喷雾干燥机进行干燥，喷雾塔进口温度195-200℃，出口温度85-90℃，制得重组广谱苏云金芽孢杆菌杀虫剂可湿性粉剂。
全文摘要
本发明提供了一种重组广谱苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis LCJ－12)制备杀虫剂的方法,该方法通过制备菌种、种子发酵、生产发酵、生成悬浮剂及生成粉剂等步骤制成杀虫剂;该杀虫剂对鳞翅目害虫和鞘翅目害虫均有良好的防治效果,对人、畜及其它动植物无害,不污染环境,且可降低生产和使用成本,并提高农产品的质量。
文档编号A01N63/02GK1329830SQ0111428
公开日2002年1月9日 申请日期2001年6月15日 优先权日2001年6月15日
发明者高梅影, 彭可凡, 戴顺英 申请人:中国科学院武汉病毒研究所