专利名称：产生高γ－亚麻酸含量的大豆的方法
技术领域：
本发明涉及能改变一种宿主生物使其产生Δ6-脂肪酸脱氢酶以及在该酶的作用下产生γ-亚麻酸的方法。本发明还涉及含有异源调节顺序进行功能性结合的Δ6-脂肪酸脱氢酶编码区的重组表达载体。重组表达载体中的启动子为CaMV35S组成型启动子或大豆β-伴球蛋白种子启动子。在农杆菌介导的遗传转化中，从子叶节和胚轴诱导出的丛生芽，在50mg/L Kan筛选培养基中连续筛选，再生芽的生存率为15％，将再生苗转入生根培养基之前，先将其基部切去采用生根粉浸润，再放入不含卡那霉素的生根培养基中培养，这一方法可提高生根率达到80％。采用本发明方法转基因于缺陷γ-亚麻酸的大豆中产生γ-亚麻酸。
从天然产生γ-亚麻酸的物种中获取参与γ-亚麻酸生物合成的遗传物质，并将分离到的遗传物质单独或组合在一种能产生γ-亚麻酸的异源系统中进行表达是十分有意义的。
目前产生γ-亚麻酸的方法已有许多，中国专利92113085公开了“通过Δ6-去饱和酶生产γ-亚麻酸”，这一专利主要阐述了兰藻细菌Δ6-去饱和酶转基因藻类产生γ-亚麻酸，与本申请背景技术相似但发明内容差异较大。
本发明涉及从深黄被孢霉M6-22分离的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因是全长的结构基因，核苷酸长度为1374bp，编码457个氨基酸。
本发明涉及包括Δ6-脂肪酸脱氢酶基因与外源调节区即非源于Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的单元，进行功能性结合的重组表达载体。
本发明提供了产生γ-亚麻酸大豆的方法，通过本发明分离的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化的大豆细胞以及该细胞再生的植物。
本发明还提供了含有Δ6-脂肪酸脱氢酶cDNA的载体。在不同生物体中构建合适的表达载体指导Δ6-脂肪酸脱氢酶编码顺序，这是本领域技术人员所熟悉的。本文所述的表达载体指的是组成型载体或整合型载体，用于调控目的基因的表达。优选的载体是质粒。这类载体含有能够有效进行基因表达的顺序单元，这些顺序单元包括启动子等。本发明所用的大豆转化表达载体中含有组成型的CaMV35S或β-伴球蛋白大豆种子特异性启动子。
在缺陷或缺乏γ-亚麻酸的生物体产生γ-亚麻酸的方法，它包括用一种从真菌中分离的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因并转化到缺陷或缺乏γ-亚麻酸的生物体中表达和增加γ-亚麻酸含量，所述的真菌为深黄被孢霉M6-22(Mortierella isabellina M6-22)，其中Δ6-脂肪酸脱氢酶基因结构为SEQ ID NO1(Genbank接受号为AF306634)。
所述的生物体是低等真核生物的酵母菌、高等植物中的烟草、大豆或油菜。所述的酵母菌为酿酒酵母INVSCl(Saccharomyces cereviciae INVScl)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)，表达载体分别为pYMICL6和pPMICL6。
所述的烟草为Nicotiana tabacum cv.xanthi和N.tabacum cv.YN(云南大金元)，表达载体分别为pGAMICL6和pBMICL6；所述的大豆为吉林35、吉林37、吉林43、黑农37和绥农10品种，表达载体为pBMICL6，所述的表达载体的启动子为β-伴球蛋白大豆种子启动子或CaMV35S启动子，将带有Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的重组的表达载体通过农杆菌介导法感染大豆的子叶节和胚轴诱导出丛生芽和再生植株；所述的油菜为甘蓝型油菜(Brassica napus)99F045C、99F044C和99F057C三系杂交组合的恢复系，用农杆菌介导法对恢复系子叶柄进行遗传转化获得再生植株。
一种产生高γ-亚麻酸含量的大豆的方法，包括1)用一种表达载体转化大豆细胞，所述的表达载体含有SEQ ID NO1(Genbank接受号为AF306634)的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，所述的表达载体为双元载体pBMICL6，启动子为组成型的CaMV35S或特异性大豆β一伴球蛋白种子启动子，选择标记为卡那霉素或潮霉素；2)将带有Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的重组的表达载体通过农杆菌介导法感染大豆的子叶节和幼胚诱导出丛生芽和再生植株。
所述的转化方法是从子叶节和胚轴诱导出的丛生芽，在50mg/L Kan筛选培养基中连续筛选，再生芽的生存率为15％，待丛生芽生长至2cm高时转至生根培养基中，降低Kan浓度为25％或完全去除。所述的转化方法是将再生苗转入生根培养基之前，先将其基部切去采用生根粉浸润，再放入不含卡那霉素的生根培养基中培养，待再生苗在生根培养基中长出主根后，转入蛭石或土壤中。
所述的大豆为吉林35、吉林43、吉林47、黑农37和绥农10大豆品种。
本发明提供了在缺陷γ-亚麻酸的大豆细胞中产生γ-亚麻酸的方法。这些方法涉及了在宿主细胞中有功能性的表达载体，该表达载体使Δ6-脂肪酸脱氢酶在宿主细胞中表达，使宿主细胞产生γ-亚麻酸。本发明还涉及对大豆种子中γ-亚麻酸的产生进行选择控制。在转化方法上本发明涉及到抗性筛选和再生芽生根培养的条件。可提高生根率达到80％。采用本发明方法转基因于缺陷γ-亚麻酸的大豆中产生γ-亚麻酸，适用于γ-亚麻酸的大规模生产和适用于大豆的脂肪酸谱的改变。
图2显示毕赤酵母表达载体pPMICL6，该质粒是由质粒pPIC3.5K(购自Invitrogen公司)和本实验室构建的含有完整的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D基因)的质粒pTMICL6构建而成的。质粒pPIC3.5K经EcoRI和NotI双酶切后，电泳回收纯化大片段；以pTMICL6质粒为模板，PCR获得5′端带EcoRI位点，3′端带NotI位点的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，用EcoRI和NotI双酶切，电泳回收纯化D6D基因片段，将上述两个片段经T4DNALigase连接后，转化大肠杆菌DH5α，筛选并鉴定出重组质粒，命名为pPMICL6。
图3显示烟草表达载体pGAMICL6，该质粒是质粒pGA643和本实验室构建的含有完整的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D基因)的质粒pTMICL6构建而成的。质粒pGA643经XbaI和BglII双酶切后，电泳回收纯化大片段；以pTMICL6质粒为模板，PCR获得5′端带XbaI位点，3′端带BglII位点的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，用XbaI和BglII双酶切，电泳回收纯化D6D基因片段，将上述两个片段经T4DNALigase连接后，转化大肠杆菌DH5α，筛选并鉴定出重组质粒，命名为pGAMICL6。质粒pGA643源自文献GynheungAN，Paul R.Ebert，Amitava Mitra and Sam HA.(1988)Binary rectors.Plant MolecularBiology Manual，A31-19。
图4显示大豆表达载体pBMICL6，该质粒的构建过程见实施例2。质粒pBI121源自文献Jefferson RA.Tony AK，Michael WB.(1987a).Gus fusionsβ-glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J.，6(13)1301-1307。
根据已发表文献中不同物种Δ6-脂肪酸脱氢酶核苷酸序列比较，大都具有电子传递功能的细胞色素b5区(Cytb5)、和组氨酸(His)保守区I、II、III区的保守序列。我们根据Cytb5区(HPGG)和His保守区III(QIEHHLFP)的氨基酸序列设计克隆深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶核苷酸序列的部分引物和全长引物部分引物(依据结构基因的两个保守区Cytb5和HisIII)上游引物5，-TTTGTCCCTGATCATCCCGGTGG-3，下游引物5，-AGGGAACAAGTGGTGGTCAATCTG-3，全长引物(依据结构基因的起始和终止区核苷酸序列)上游引物5’>TAGGCTGAATTCATGGCTGCTGCTCCCAGTGTGAGGACG<3’下游引物5’>AACTGCCTCGAGTTACTGCGCCTTACCCATCTTGGAGGC<3’于下面的反应体系中进行PCR扩增反应PCR反应体系(25ul)，于0.2ml薄壁管内进行
按如下PCR反应程序进行
程序1(cycle1) 94℃ 2min程序2(cycle2～36) 94℃ 1min，46℃ 100s，72℃ 100s程序3(cycle37) 72℃ 15min使用部分引物在cDNA上进行的PCR产生一条大小约1.0kb的特异带，经测序该核苷酸长度为1071bp。经比较发现该核苷酸序列含有Cytb5和HisI、II、III区，证明克隆的cDNA片段为Δ6-脂肪酸脱氢酶核苷酸序列的一部分。
使用全长引物在cDNA上进行的PCR产生一条大小约1.4kb的片段，经测序和比较该核苷酸序列，发现含有Cytb5和HisI、II、III区，证明克隆的cDNA片段为Δ6-脂肪酸脱氢酶核苷酸序列。测序结果表明深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶结构基因全长为1374个核苷酸，共编码457个氨基酸，膜脱氢酶所共有的三个组氨酸保守区，分别在氨基酸序列的172～176，209～213，395～402处，推导出的氨基酸序列与已知的蓝细菌(Reddy A S.et al.，Plant Mol.Biol.1993，27293～300)、植物琉璃苣(Sayanova O.etal.Proc.Natl.Acad Sci.USA1997，944211～4216)、线虫(Napier J A.et al.Biochem.J.1998，330611～614)的Δ6-脂肪酸脱氢酶相似，与高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶的核苷酸序列的最大同源性为94％，与植物琉璃苣为53％，与线虫为55％。正如其它物种Δ6-脂肪酸脱氢酶一样，在氨基酸序列的N末端同样含有类似于细胞色素b5区域的蛋白序列HPGG。该序列即为Δ6-脂肪酸脱氢酶结构基因SEQ ID NO1(Genbank接受号为AF306634)。实施例2 深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆转化中表达载体的构建本实例只限于pBMICL6的构建从质粒pTMICL6上PCR获得5′端带XbaI位点，3′端带SacI位点的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因，用XbaI和SacI酶切，将PCR产物中的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因片段替换GUS基因而克隆进pBI221质粒中。形成新的质粒pBI221MICL6，使该基因处于CaMV35S启动子(或β-伴球蛋白种子启动子)的控制下，然后通过HindIII和EcoRI限制位点将含有CaMV35S启动子的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的DNA片段克隆进另外一个含有卡那霉素选择性标记的载体pBI121质粒中，构建出含Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的质粒pBMICL6(见图4)。通过电转化技术，将该表达载体质粒引入根癌农杆菌LBA4404中，以此菌对植物进行转化试验。实施例3 农杆菌介导的大豆遗传转化(1)农杆菌的培养及制备从4℃保存的平板上挑取含有表达载体的农杆菌单菌落接入含有50mg/LKan，25mg/L Rif，25mg/L Str的YEP培养基，28℃，160r/min振荡培养18-20h左右至对数期，然后用MS(.Mtuashige T，Skoog F.Physiol Plant，1962，21473-479)液体培养基将菌液稀释5-10倍，作为农杆菌转化的工程菌液。
(2)无菌苗的培养挑取无病斑，种皮完好的大豆种子，经清水浸泡过夜后，70％乙醇消毒1min，10-15％次氯酸钙消毒15min，无菌水冲洗3-4次，去种皮，置于1/2MS固体培养基，25-30℃培养，几天后获得无菌苗。
(3)农杆菌介导的大豆遗传转化直接诱导再生植株和愈伤组织的诱导，所用各种添加不同生长激素6BA+IBA(6-苄基氨基嘌呤+吲哚丁酸)的MS培养基。
切取无菌苗的子叶、子叶节、胚轴、真叶，分别采用多点注射和浸泡的方法感染。接种于相应的MS培养基中，共培养2-3d，转入含有50mg/L Kan和500mg//L Cef(头胞霉素) 的MS培养基中，二周继代一次，在创口处长出丛生芽，丛生芽逐渐长大形成再生植株。由于大豆基因型、取材部位的不同，出芽率和转化率有差异(见表1)。
表1不同大豆品种和不同外植体对诱导丛生芽的影响Table 1 The affection of adventitious bud on soybean genetype and explant品种 外植体 接种数 出芽数 出芽率卡那抗性 转化率CultivarsExplantInfectionNumber ofRate of Kan resistanceRate ofnumber adventitious adventitioustransformationbud bud吉育43 子叶 86 00 0 0Jiyu43 子叶节 84 179 213 1517.9胚轴 86 162 188 1112.8真叶 86 00 0 0黑农36 子叶 20 00 0 0heinong36子叶节 20 38 190 2 10.0胚轴 19 31 163 1 5.3真叶 20 00 0 0黑农37 子叶 119 00 0 0heinong37子叶节 120 230 192 1613.3胚轴 120 207 173 9 7.5真叶 120 00 0 0从表1可以看出，子叶节易于诱导丛生芽，丛生芽数目最高达7个之多，胚轴也易于诱导丛生芽，但子叶和真叶分化丛生芽困难。从子叶节和胚轴诱导出丛生芽的时间大致相似，丛生芽的数目前者高于后者，后者再生植株多细小。从表1中还可以看出，不同基因型的大豆诱导丛生芽数差异明显，吉育43出芽率较高。因此，采用子叶节和胚轴诱导丛生芽是最佳选择。
从子叶节和胚轴诱导出丛生芽长到2cm时，将丛生芽切下其基部采用生根粉浸润，转入诱导生根培养基〔MS+VB6(1mg/L)+烟酸(1mg/L)+硫胺素(10mg/L)+肌醇(100mg/L)+Cef(500mg/L)+IBA(1.5mg/L)pH5.8)。待丛生芽长出主根后将再生苗转入生根培养基(混合的富营养土)中培养。实施例4 卡那霉素对大豆选择压力的试验本实验所用大豆品种为吉林43、黑农36和黑农37，表达载体为pBMICL6，植物筛选标记基因为卡那霉素抗性基因，配制浓度分别为0mg/L，5mg/L，25mg/L，50mg/L，75mg/L，100mg/L的卡那霉素，在遗传转化中进行大豆愈伤组织生长和分化再生芽的选择压力试验。接种生长发育基本一致的胚性愈伤10个/皿(设5个重复)，在加有不同浓度Kan的分化培养基上连续培养四周。接种分化再生芽3个/瓶(设10个重复)，在加有不同浓度Kan的分化培养基上连续培养四周。25-30℃培养，12h光照培养，观察愈伤生长和分化再生芽的变化情况(见图5)。
图5表明25-50mg/L的Kan浓度对大豆胚性愈伤组织和分化再生芽均达到50％的抑制作用，特别是在Kan浓度为50mg/L时，再生芽的生存率低于15％。所以，本转化研究中，开始所用的Kan筛选浓度为50mg/L，待再生芽长至2cm高时，在生根培养基中将Kan完全去除。实施例5 转基因大豆的分子生物学检测(1)转基因大豆的PCR检测取卡那霉素筛选过的抗性愈伤和再生植株，用CTAB法(.傅荣昭，孙勇如，贾士荣主编，植物遗传转化技术手册，中国科学技术出版社，1994)提取总DNA，用于PCR技术扩增Δ6-脂肪酸脱氢酶的基因。
两个引物序列是5′-GGCTTCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGT-3′和5′-CTGCGAGCTCTTACTGCGCCTTACC-3′。PCR反应条件是95℃变性5min，然后在94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min的条件下进行35个循环，最后72℃再延伸10min。电泳结果见图6。
(2)转基因大豆植株的southern检测大量提取PCR反应阳性大豆转基因苗的总DNA，HindIII充分酶切后，经过电泳、转膜等步骤，与地高辛标记的Δ6-脂肪酸脱氢酶的基因探针杂交，具体试验步骤见试剂盒使用说明书。杂交结果见图7和8。
(3)转基因大豆黑农37T0代种子的气相色谱(GC)分析转基因大豆种子经去离子水洗涤三次，50℃烘干。研碎后，加入5％的KOH-CH3OH溶液，70℃反应3h，再加入14％BF3-CH30H，70℃反应1.5h，形成脂肪酸甲酯。用1∶4的氯仿己烷抽提两次，合并提取液。加入适量无水Na2SO4干燥提取液，静置1h，去掉Na2SO4，用氮气吹干。用少许正己烷回溶，备用。以Sigma公司生产的GLA甲酯为标准品，正己烷为溶剂测定样品。仪器为岛津GC-7A，柱子DEGS 0.25mm×25m，分流比100∶1，柱温180℃，尾吹50ml/min，气化室温度250℃，检测器氢火焰离子化检测。
测定结果见附图9。根据截面积计算黑农37大豆T0代种子中r一亚麻酸含量为多不饱和脂肪酸的18.2％。
权利要求
1.一种在缺陷或缺乏γ-亚麻酸的生物体产生γ-亚麻酸的方法，其特征在于它包括用一种从真菌中分离的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因并转化到缺陷或缺乏γ-亚麻酸的生物体中表达和增加γ-亚麻酸含量，所述的真菌为深黄被孢霉M6-22(Mortierella isabellina M6-22)，其中Δ6-脂肪酸脱氢酶基因结构为SEQ ID NO1(Genbank接受号为AF306634)。
2.根据权利要求1所述的在缺陷或缺乏γ-亚麻酸的生物体产生γ-亚麻酸的方法，其特征在于所述的生物体是低等真核生物的酵母菌、高等植物中的烟草、大豆和油菜。
3.根据权利要求2所述的在缺陷或缺乏γ-亚麻酸的生物体产生γ-亚麻酸的方法，其特征在于所述的酵母菌为酿酒酵母INVSCl(Saccharomycescereviciae INVScl)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)，表达载体分别为pYMICL6和pPMICL6(见
图1，2)。
4.根据权利要求2所述的在缺陷或缺乏γ-亚麻酸的生物体产生γ-亚麻酸的方法，其特征在于所述的烟草为Nicotiana tabacum cv.xanthi和N.tabacumcv.YN(云南大金元)，表达载体分别为pGAMICL6和pBMICL6(见图3，4)；所述的大豆为吉林35、吉林37和吉林43大豆、黑农37和绥农10，表达载体为pBMICL6，所述的表达载体的启动子为CaMV35S或β-伴球蛋白大豆种子启动子，将带有Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的重组的表达载体通过农杆菌介导法感染大豆的子叶节和胚轴诱导出丛生芽和再生植株；所述的油菜为甘蓝型油菜(Brassicanapus)99F045C、99F044C和99F057C三系杂交组合的恢复系，用农杆菌介导法对恢复系子叶柄进行遗传转化获得再生植株。
5.一种产生高γ-亚麻酸含量的大豆的方法，其特征在于1)用一种表达载体转化大豆细胞，所述的表达载体含有SEQ ID NO1(Genbank接受号为AF306634)的Δ6-脂肪酸脱氢酶结构基因，所述的表达载体为双元载体pBMICL6(见图4)，启动子为组成型的CaMV35S或特异性大豆β一伴球蛋白种子启动子，选择标记为卡那霉素或潮霉素；2)将带有Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的重组的表达载体通过农杆菌介导法感染大豆的子叶节和幼胚诱导出丛生芽和再生植株。
6.根据权利要求5所述的产生高γ-亚麻酸含量的大豆的方法，其特征在于所述的转化方法是从子叶节和胚轴诱导出的丛生芽，在50mg/L Kan筛选培养基中连续筛选，再生芽的生存率为15％，待丛生芽生长至2cm高时转至生根培养基中，降低Kan浓度为25％或完全去除。
7.根据权利要求6所述的产生高γ-亚麻酸含量的大豆的方法，其特征在于所述的转化方法是将再生苗转入生根培养基之前，先将其基部切去采用生根粉浸润，再放入不含卡那霉素的生根培养基中培养，待再生苗在生根培养基中长出主根后，转入蛭石或土壤中。
8.根据权利要求5所述的产生高γ-亚麻酸含量的大豆的方法，其特征在于所述的大豆为吉林35、吉林43、吉林47、黑农37和绥农10大豆品种。
9.权利要求5所述的产生高γ-亚麻酸含量的大豆的方法，其特征在于所述的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因是通过RT-PCR方法获得的全长结构基因，其核苷酸长度为1374bp，编码457个氨基酸。
全文摘要
本发明涉及在缺陷或缺乏γ－亚麻酸的生物体产生γ－亚麻酸的方法。从真菌－深黄被孢霉M
文档编号A01H1/00GK1415754SQ0215559
公开日2003年5月7日 申请日期2002年12月13日 优先权日2002年12月13日
发明者李明春, 邢来君, 胡国武, 卜云萍, 财音青格乐, 王广科 申请人:南开大学