专利名称:采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置制造方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置，该装置包括带有上盖且呈圆形的培养皿。所述培养皿内通过平行的有机玻璃条Ⅰ、有机玻璃条Ⅱ将其分隔成菌丝室、菌根室、营养补充室；所述有机玻璃条Ⅰ、所述有机玻璃条Ⅱ上均粘贴有尼龙网；所述菌丝室、菌根室、营养补充室内均放置固体培养基；所述菌根室内的所述固体培养基上放置Ri？T-DNA转化胡萝卜根；所述营养补充室内的所述固体培养基上放置蘸有蔗糖溶液的棉花棒。本实用新型结构简单、高效，可有效排除宿主植物根系及其它外源微生物对菌丝的干扰。
【专利说明】采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及特殊土壤微生物的培养【技术领域】，尤其涉及采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置。
【背景技术】
[0002]丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizae, AM)真菌是陆地生态系统中广泛分布的一类与植物根系共生的有益微生物。地球上80%以上的陆生高等植物均能与其建立共生关系，形成特定的“菌根”结构。菌根共生体的形成能够改善宿主植物的营养状况，促进宿主植物提高对土壤中P、N、K、Zn、Mn、Fe、Cu、Ca等矿质元素的吸收，提高植物的生物量生产，增强宿主植物对非生物胁迫，如干旱、盐溃、重金属污染等的耐受能力。AM真菌是植物根际内分布最普遍、生物量最大、作用最显著的有益真菌类群，对植物生长的促进作用已经得到充分的证明，在生态系统中具有重要的功能，但由于人类的干扰和环境的影响，这些潜在的巨大作用尚没有充分发挥。
[0003]早在1842年，Nageli在观察鸢尾时，就首次发现根细胞中具有明显的泡囊和菌丝结构。其后，Holle (1875)和Mollberg (1884)在蕨类植物和百合科植物的根系中也相继发现具有类似的泡囊和菌丝。法国微生物学家Dangeard (1896)详细研究了杨树根系中的AM真菌，并精确绘制了杨树根系中AM菌根的泡囊和丛枝特征，以及菌丝中的油滴等形态结构，同时对AM真菌的种类进行了鉴定。但是，由于AM真菌的分离培养技术尚很欠缺，所以长期以来，一直难以对它们进行深入地研究。直到1955年，Gerdemann发明了湿筛-倾析法，人类才能够从土壤中直接筛选出AM真菌的各种孢子，AM真菌的研究才取得较大的发展。
[0004]AM真菌是一类专性活体营养微生物，虽然可以进行无性繁殖或有性繁殖，但只能依赖与活体宿主植物共生完成其生活史，迄今为止尚不能对其进行人工离体纯培养，因此，AM真菌的无菌培养已经成为当前菌根学领域研究的瓶颈，也是开展AM真菌分类鉴定、菌剂生产和应用推广的一个重要限制因素。
[0005]在自然条件下，AM真菌与植物根系共生生长，相互缠绕在一起，很难区分植物根系和AM真菌菌丝体对矿质营养吸收作用的差异。1973年，Hattingh等首次建立了隔网分室培养系统，广泛应用于菌根生理、生态功能等方面的研究。该方法为研究菌丝及其菌丝际的生理生化功能提供了一条有效的途径。我国在AM真菌的培养和扩繁领域，先后有数个专利获得授权，在专利号为CN1354252A的“以玻璃珠为培养基质的AM真菌的培养”中，主要涉及一种使用特定培养装置及培养介质的AM真菌的分室培养方法,该方法表明对于产孢能力强的AM真菌地表球囊霉(67OfiMAs在真菌生长室中可以获得多至20 mg干重的菌体，每盆获得的孢子数以万计。但是该培养系统成本高，操作复杂，仅可用于科学研究和小规模接种剂的生产使用，同时由于菌根和分支菌丝均为向地性生长，所以该装置会限制菌根真菌和分支菌丝的生长，且该装置为开放式培养系统，易受到其他微生物的污染。在专利号为ZL201420440445.7的“复合式丛枝菌根真菌分室培养装置”中，主要涉及特殊微生物的培养【技术领域】，将AM真菌的传统基质培养与无土培养完美结合，提供一种可用于研究AM真菌培养和生理机制的复合式丛枝菌根真菌分室培养装置。但是该培养系统仍处于一个开放的操作环境，所采用的培养基质必然携带其他外源微生物，导致培养出来的AM真菌并非纯净的单一微生物。
[0006]综上所述，以上专利所设计的培养装置均存在一个共同的不足之处，即采用粗河沙、土壤、玻璃珠等基质作为主要培养介质，且均采用活体植物作为宿主材料，因此无法获得纯净的、单一的AM真菌繁殖体(孢子、菌丝等)，进而限制了 AM真菌在分子生物学、遗传学等领域的研究和发展，以及在实际应用中的扩繁和推广。
实用新型内容
[0007]本实用新型所要解决的技术问题是提供一种结构简单、高效的采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置。
[0008]为解决上述问题，本实用新型所述的采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置，其特征在于:该装置包括带有上盖且呈圆形的培养皿；所述培养皿内通过平行的有机玻璃条1、有机玻璃条II将其分隔成菌丝室、菌根室、营养补充室；所述有机玻璃条1、所述有机玻璃条II上均粘贴有尼龙网；所述菌丝室、菌根室、营养补充室内均放置固体培养基；所述菌根室内的所述固体培养基上放置Ri T-DNA转化胡萝卜根；所述营养补充室内的所述固体培养基上放置蘸有蔗糖溶液的棉花棒。
[0009]所述培养皿的直径为12cm。
[0010]所述有机玻璃条I的厚度为0.3cm、长度为12cm、高为0.5cm。
[0011]所述有机玻璃条II的厚度为0.3cm、长度为7cm、高为0.5cm。
[0012]所述尼龙网的孔径为40 μ m0
[0013]本实用新型与现有技术相比具有以下优点:
[0014]1、由于本实用新型中培养皿内通过平行的有机玻璃条1、有机玻璃条II将其分隔成菌丝室、菌根室、营养补充室，因此，有效隔开了三室中的培养基，防止不同分室的培养基之间进行物质交换。
[0015]2、本实用新型有机玻璃条1、有机玻璃条II上均粘贴有尼龙网，因此，菌丝只有穿过有机玻璃条1、有机玻璃条II上部的40 μ m尼龙网才能进入菌丝室和营养补充室，但植物根系(直径>50 μ m)不能穿过尼龙网，所以只有菌丝可以穿过尼龙网吸收营养物质(C源、P元素等)并在菌丝室中扩繁。
[0016]3、本实用新型中培养基分室培养系统中使用的宿主材料为Ri T-DNA转化胡萝卜根，是基于发根农杆菌ATCC11325的Ri质粒上的T-DNA转移到胡萝卜肉质根细胞中后，可以使胡萝卜根产生正常植株所没有的冠瘿碱，在无激素培养基上形成多分支并旺盛生长的毛状根，毛状根具有主根不明显，侧根丰富，负向地性生长特征，其转化根生长速度快，培养条件简单，与AM真菌菌丝接种面大，可以大规模培养生产，是菌根研究的理想材料。
[0017]4、本实用新型中培养基分室培养系统中菌根共生培养一个月后，就可以形成大量的营养孢子和成熟孢子，进而完成自身的生活周期。同时，为进一步进行无菌的菌丝体培养提供了大量的接种源。
[0018]5、本实用新型中的营养补充室可以为菌根室中菌丝的生长补充足够的碳源，而且本实用新型中设有蘸有蔗糖溶液的棉花棒，因此，易于添加和更换，同时可以提供均一的碳源物质，也可以避免外源污染。
[0019]6、本实用新型可以根据菌丝的负向地性人为的调节培养皿位置，诱导菌丝更高效地穿过尼龙网，进入菌丝室快速形成纯净的菌丝和孢子等繁殖体。
[0020]7、本实用新型排除了宿主植物根系及其它外源微生物对菌丝的干扰，在原位可以观察菌丝的伸长、分枝及产孢过程，也可以观察到菌丝室中大量的菌丝分枝布满整个菌丝室，从而形成无菌的菌丝际环境，为进一步研究菌丝的生理生化特性、分子生物学和遗传机制等提供了可能。
[0021]8、本实用新型将特定培养基和隔网系统相结合，在菌丝室获得纯净的密集的菌丝面，可以用于研究菌丝的分泌物、菌丝对难溶性磷的利用、菌丝对矿质营养的运输速度及不同矿质元素对其生长的影响。
[0022]9、本实用新型所使用的材料价格便宜，构造简单，容器为常规实验仪器，易于获得，且可以多次使用，达到节约环保的目的。同时实验药品均为常规实验药品，可以从市场直接购买。
[0023]10、本实用新型占地空间小，便于大批量培养，也方便统一管理。
【附图说明】
[0024]下面结合附图对本实用新型的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0025]图1为本实用新型的立体结构示意图。
[0026]图2为本实用新型的平面结构示意图。
[0027]图3为本实用新型的截面结构示意图。
[0028]图中:1 一菌丝2—尼龙网3—有机玻璃条I 4一Ri T-DNA转化胡萝卜根5—培养皿6—有机玻璃条II 7—棉花棒8—孢子9一固体培养基10—菌丝室11 一菌根室12—营养补充室。
【具体实施方式】
[0029]如图1~3所示，采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置，该装置包括带有上盖且呈圆形的培养皿5。培养皿5内通过平行的有机玻璃条I 3、有机玻璃条II 6将其分隔成菌丝室10、菌根室11、营养补充室12 ;有机玻璃条I 3、有机玻璃条II 6上均粘贴有尼龙网2 ;菌丝室10、菌根室11、营养补充室12内均放置固体培养基9 ;菌根室11内的固体培养基9上放置Ri T-DNA转化胡萝卜根4 ;营养补充室12内的固体培养基9上放置蘸有蔗糖溶液的棉花棒7。
[0030]其中:培养皿5的直径为12cm。
[0031]有机玻璃条I 3的厚度为0.3cm、长度为12cm、高为0.5cm。
[0032]有机玻璃条II 6的厚度为0.3cm、长度为7cm、高为0.5cm。
[0033]尼龙网2的孔径为40 μ m。
[0034]应用实例:
[0035]I)基本材料准备
[0036]A)宿主植物为Ri T-DNA转化胡萝卜根。其中发根农杆菌采用冠缨碱性菌株ATCC11325，购买自北京市北纳创联生物技术研究院(北京市朝阳区北三环东路，邮编:102228,电话:010-58851390, E-mail:1nfoObnb1.com,网址:http://www.bnb1.com);胡萝卜肉质根选用‘七寸红’品种，购买自甘肃省武威市千乡农业发展有限公司。
[0037]Ri T-DNA转化胡萝卜根的获得方法:将_80°C保存的发根农杆菌ATCCl 1325用平板划线法在LB固体培养基上划线，置于28°C的恒温箱黑暗倒置培养，使其活化；挑取培养2d的单菌落，接种到不加琼脂的LB液体培养基中，于28°C条件下在摇床上震荡培养。将田间种植3个月后的胡萝卜新鲜肉质根洗净后，先在75%的乙醇中表面消毒lmin，后浸在0.l%HgCl2中消毒15min,最后用无菌水冲洗3次,晾干,横切成厚约5mm的薄片,浸入培养14h后的菌液中15min，无菌滤纸铺垫在外植体与发根农杆菌共培养的培养基表面，胡萝卜根切片置于共培养培养基的滤纸上，25°C培养，培养至第5天，发根农杆菌菌落长满滤纸后，采用M液体培养基(不加琼脂)清洗胡萝卜根切片3~5次，无菌滤纸吸干胡萝卜根切片表面的液体，移至除菌培养基，反复培养，除去多余的农杆菌，待胡萝卜根切片及培养基表面没有发根农杆菌菌落时，将胡萝卜根切片转移至M固体培养基中继代培养，即得到无菌的转化毛状根。
[0038]B)培养基配方如下:
[0039]LB 培养基配方(IL) =NaCl lOOOmg，胰蛋白胨 lOOOmg，酵母膏 500mg，琼脂 1500mg，pH=7.4 ；
[0040]M 固体培养基配方为(1L) =MgSO4.7H20 731mg, KNO3 80mg, KCl 65mg, KH2PO4 4.8mg,Ca (NO3) 2.4H20 288mg, NaFeEDTA 8mg, KI 0.75mg, MnCl2.4H20 6mg, ZnSO4.7H20 2.65mg, H3BO31.5mg, CuSO4.5H20 0.13mg, Na2MoO4.H2O 0.0024mg,甘氨酸 3mg,盐酸硫胺素 0.lmg,盐酸批咯醇0.lmg，烟酸0.5mg,肌醇50mg,鹿糖lOOOmg,琼脂10000 mg, pH 5.5 ;注:以上M固体培养基的配方中添加蔗糖，即为正常培养基。
[0041]M液体培养基:配方中不添加琼脂，其余元素成分和用量与M固体培养基相同；
[0042]含鹿糖M固体培养基为正常培养基,配方同上；
[0043]不含蔗糖M固体培养基配方中不添加蔗糖，其余元素、成分和用量与M固体培养基相同；
[0044]外植体与发根农杆菌共培养的培养基配方为(IL) =KNO3 190mg, NH4NO3 165mg，KH2PO4 170mg，MgSO4.7H20 37mg, CaCl2.2H20 44mg (以上为大量元素)，Na2-EDTA 3725mg,FeSO4.7H20 2785mg，MnSO4.4H20 2230mg，ZnSO4.7H20 860mg，CoCl2.6H20 2.5mg，H3BO3620mg，KI 83mg，NaMoO4.2H20 25mg，CuSO4.5H20 2.5mg，肌醇 100mg，维生素 B1 10mg，维生素B6Img,烟酸lmg,乙酰丁香酮0.02mg ；
[0045]除菌培养基:即除去胡萝卜根切片表面多余的发根农杆菌，其配方为外植体与发根农杆菌共培养培养基大量元素的5倍，不添加乙酰丁香酮，其余元素成分和用量不变，另添加抗生素羧苄青霉素钠250mg，头孢霉素250mg。
[0046]C)直径为 12cm,高为 2.5cm 的培养皿；0.3cm 厚、12cm 长、0.5cm 高和 0.3cm 厚、7cm长、0.5cm高的有机玻璃条；40 μ m尼龙网；
[0047]将购买的通过湿筛-倾析法获得的孢子进行表面消毒，即浸泡在2%的氯胺T和200mg/L链霉素溶液中15min，然后用无菌水冲洗3次;M固体培养基预先装入锥形瓶1/3，在121°C下高压蒸汽灭菌15 min ;培养容器、有机玻璃条、尼龙网、打孔器均需在121°C下高压蒸汽灭菌15 min。
[0048])培养系统的建立
[0049]分别将含蔗糖M的固体培养基、不含蔗糖的培养基装入菌根室11、菌丝室10和营养补充室12。将Ri T-DNA转化胡萝卜根4预先培养在M固体培养基9中，然后将表面灭菌后发芽的地表球囊霉单个孢子接种到菌根室11中Ri T-DNA转化胡萝卜根4器官旁进行分室培养,让AM真菌菌丝侵染根形成共生体系并产生孢子。
[0050]A)培养基质:M固体培养基(含蔗糖和不含蔗糖)9 ；
[0051]B)培养装置:本实用新型(见图1)。
[0052]C) AM真菌菌种:地表球囊霉(Glomus versiforme),本实施例中采用的AM真菌接种剂购买自北京市农科院植物营养与资源研究所菌根学研究课题组(北京市海淀区板井曙光花园中路9号，邮编:100097，电话:010-51503324，联系人:王幼珊、张淑彬，E-mail:am5150il26.com)。
[0053]将购买的菌根接种剂通过湿筛-倾析法获得单一孢子，操作如下:称取10g样品，清水浸泡20~30min,使土壤分散；将50 μ m、100 μ m、250 μ m、750 μ m孔径的土壤筛按孔径大小依次叠加，最小孔径筛在最底层，并使筛面适当倾斜；玻璃棒搅拌上述土壤浸泡液，停放3min，后将上层的土壤悬浊液缓缓倒入叠加的筛网中；清水反复冲洗，分别将各筛面上的筛出物轻轻洗入洁净的单独培养皿内；镜检，用毛细管分别将相同形态特征的孢子，逐个挑选于单独培养皿中。挑选出的孢子表面均需消毒，即浸泡在2%的氯胺T和200mg/L链霉素溶液中15min，然后用无菌水冲洗3次；M培养基预先装入锥形瓶的1/3，在121°C条件下高压蒸汽灭菌15min ;培养容器、有机玻璃条、尼龙网均需在121°C条件下高压蒸汽灭菌15min。
[0054])培养过程
[0055]预先将灭菌后的培养装置、打孔器放置在超净工作台(SW-CJ-1BU，苏州净化设备有限公司)上，打开杀菌开关，用紫外线灭菌灯杀菌消毒30min-60min，后关闭杀菌开关，启动风机，用蘸有75%酒精的棉花擦洗台面及手，挥发干后点燃酒精灯，在酒精灯旁，将1mlM培养基缓缓倒入菌根室11，营养补充室12中倒入5 ml不含蔗糖的M培养基，同时在菌丝室10中也缓缓倒入15 ml不含蔗糖的M培养基，目的是保证三室内培养基的厚度达到一致(0.5cm)，且与有机玻璃条的高度持平，以便于菌丝进入菌丝室10和营养补充室12。轻轻地将加入培养基的培养皿5静置于超净工作台，待完全凝固后，截取预先在M培养基上培养的Ri T-DNA转化胡萝卜根4的根尖5~8 cm长置于菌根室11中，接种已经表面消毒的地表球囊霉孢子于Ri T-DNA转化胡萝卜根4旁进行分室培养。
[0056]本实验采用单孢子接种，接种方法如下:同上无菌操作过程，用经过高压灭菌的直径为9 mm的打孔器在菌根室11的Ri T-DNA转化胡萝卜根4旁打孔，移走培养基。其后，再用该打孔器以预先培养于M培养基的地表球囊霉孢子为中心打孔，将孢子移入根旁的空白处，因为菌丝具有负向地性，这样便于培养基中的菌丝由培养基底部延伸到培养基表面生长，并充分吸收培养基中所需营养物质(见图3)。此外，由于孢子直径小，每个培养容器中需移进约10~20个孢子。最后，盖上培养皿I上盖，并用ParafilnfM封口膜(型号PM-996)对培养皿进行封口，保证无菌培养，将本实用新型放置在28°C的恒温箱中进行黑暗培养7天，即可观察到地表球囊霉孢子的萌发。
【权利要求】
1.采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置，其特征在于:该装置包括带有上盖且呈圆形的培养皿(5);所述培养皿(5)内通过平行的有机玻璃条I (3)、有机玻璃条II (6)将其分隔成菌丝室(10)、菌根室(11)、营养补充室(12);所述有机玻璃条I(3)、所述有机玻璃条II (6)上均粘贴有尼龙网(2);所述菌丝室(10)、菌根室(11)、营养补充室(12)内均放置固体培养基(9);所述菌根室(11)内的所述固体培养基(9)上放置RiT-DNA转化胡萝卜根(4);所述营养补充室(12)内的所述固体培养基(9)上放置蘸有蔗糖溶液的棉花棒(7)。2.如权利要求1所述的采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置，其特征在于:所述培养皿(5)的直径为12cm。3.如权利要求1所述的采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置，其特征在于:所述有机玻璃条1(3)的厚度为0.3cm、长度为12cm、高为0.5cm。4.如权利要求1所述的采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置，其特征在于:所述有机玻璃条II (6)的厚度为0.3cm、长度为7cm、高为0.5cm。5.如权利要求1所述的采用人工培养基开展丛枝菌根真菌纯培养的分室培养装置，其特征在于:所述尼龙网(2)的孔径为40 μπι。
【文档编号】C12R1-645GK204291868SQ201420763337
【发明者】王强, 王晓娟, 王茜, 张亮, 金樑 [申请人]兰州大学