体外筛选2′－取代核酸的方法

专利名称：体外筛选2′－取代核酸的方法
技术领域：
本发明涉及核酸领域，更具体地讲，本发明涉及适体、以及筛选嵌入修饰核苷酸适体的方法。本发明还涉及酶促生成含有修饰核苷酸的随机低核苷酸库的材料与方法，例如从上述库中筛选出对应特定靶的适体。
背景技术：
适体是通过相互作用而不是经典的沃森-克里克碱基配对、对于分子具有特异性结合亲合性的核酸分子。
适体，如噬菌体展示或者单克隆抗体(MAbs)生成的胎，能够特异性结合选择靶，并且通过结合阻止靶自身作用的发挥。采用从随机序列低核苷酸库中(


图1)生命体外筛选方法，已经生成了对应超过100种蛋白的适体，其中包括生长因子、转录因子、酶、免疫球蛋白、和受体。常规的适体尺寸在10-15KDa(30-45个核苷酸)，利用亚纳摩尔亲合性结合靶，并排斥相近的靶(例如，通常不与相同基因族的其它蛋白结合)。一系列的结构研究显示，适体可以利用在抗体-抗原复合体中产生亲合性与特异性的相同类型结合的相互作用(氢键结合、静电互补、疏水性连接、空间排斥等)。
作为治疗剂(和诊断剂)使用时，适体具有许多令人满意的特性，其中包括强特异性与亲合性，生物学效能、和优秀的药物方法制备适体，允许迅速生成初始(治疗)前导物。生命体外筛选允许紧密控制适体的特异性与亲合性，并且允许产生对应毒性靶和非致免疫靶的前导物。
(1)毒性与免疫原性经证实，作为一类物质适体具有微弱的毒性或者免疫原性、或者不具有毒性动力学特性。此外，与抗体与其它蛋白生物制剂相比适体提供了特异性竞争优势，例如(2)速度与控制可以采用完全生命体外与免疫原性。使用高含量的适体慢性给药鼠或者旱獭(每天10毫克/千克，持续90天)，采用任何临床、细胞、或者生化方法，未能观察出毒性。鉴于许多单克隆抗体的效能严格受限于对应自身抗体的免疫响应，因此对应适体引发抗体是极困难的(最大可能是因为由T细胞通过主要组织相容性复合体不能产生适体，并且通常免疫响应不能受训识别核酸片段)。
(3)给药鉴于当前批准的所有抗体治疗剂都是由静脉内注射给药(通常相隔2-4小时)，然而，适体可以皮下注射给药。这种差别主要是由于相对低的可溶性，因此大部分治疗性的单克隆抗体需要大体积。由于具有良好的可溶性(＞150毫克/毫升)和相对低的分子量(适体10-50kDa；抗体150kDa)，通过注射给药的每周剂量体积小于0.5毫升。在猴子的研究中，通过皮下给药的适体生物药效率大于80％(Tucker等人，期刊《色谱法》1999年第B.732期第203-212页)。此外，适体的小尺寸可以使其渗入抗体与抗体片段无法渗入的构象收缩区域，由此展现适体治疗剂或者预防剂的另一个优点。
(4)规模化与成本可以化学合成治疗性的适体，因此很容易地按照需求规模化生产。鉴于当前规模化生产中的困难限制了一些生物制剂的可用性，并且大型蛋白生产设备资本成本巨大，然而，一台大型合成机可以每年生产100多公斤低核苷酸，并且需要相对适中的初始投资。据估算，与最佳抗体的成本相比，在千克规模下当前适体合成产品成本是500美元/克。经过5年生产方法的连续改进，预计产品的生产成本会降至100美元/克以下。
(5)稳定性治疗性的适体具有化学稳定性。经过暴露在加热与变性剂等环境后，适体可以内在地恢复活性，并可以在室温下以冻干粉末的形式超长储存(大于一年)。相反的是，抗体必须冷冻保存。
适体作为治疗剂的上述优点一定有益于获得延长或者增加适体治疗剂在生命体外稳定性的材料与方法。本发明提供了满足上述需求与其它需求的材料与方法。
附图简述
图1是从随机序列低核苷酸库生命体外筛选适体(SELEXTM)过程的示意图。
图2展示了2’-氧-甲基(2’-OMe)修饰核苷酸，其中“B”是嘌呤碱、或者嘧啶碱。
图3A是三种2’-氧甲基血管内皮生长因子适体结合血管内皮生长因子的图形ARC224，ARC245和ARC259；图3B展示了上述适体的序列和推定的第二结构。
图4是ARC224的各种2’-羟基G变异体与ARC225结合血管内皮因子的图形。
图5是在HUVEC中ARC224结合VEGF的图形。
图6是在含有与不含有EDTA的条件下热压处理前、后ARC224结合血管内皮因子的图形。
图7A和7B分别是，当在37℃鼠血浆培养时，展示ARC224和ARC226稳定性的图形。
图8是展示与免疫球蛋白E结合的dRmY SELEXTM第6次循环序列的图形。
图9是展示与凝血因子结合的dRmY SELEXTM第6次循环序列的图形。
图10是展示与血管内皮生长因子结合的dRmY SELEXTM第6次循环序列的图形。
图11A是在37℃下95％鼠血浆(柠檬酸化)中所有带有3’-idT的2’-氧甲基低核苷酸的降解图，
图11B是在37℃下95％鼠血浆中对应dRmY低核苷酸的降解图。
图12是rGmH h-免疫球蛋白E结合克隆(第6次循环)的图形。
图13A是对于rRmY库PDGF-BB筛选第12次循环库的图形，
图13B是对于rGmH库PDGF-BB筛选第10次循环库的图形。
图14是与IL-23结合dRmY SELEXTM第6、7、8次循环和未经筛选序列的图形。
图15是与PDGF-BB结合dRmY SELEXTM第6、7次循环和未经筛选序列的图形。
发明概述本发明提供了通过在促使修饰核苷酸嵌入低核苷酸的特定条件下转录生成增加稳定性低核苷酸的材料与方法。这些修饰的低核苷酸可以是，例如适体、反义分子、RNAi分子，siRNA分子、或者核糖酶。优选的是，低核苷酸是适体。
在一实施方案中，本发明提供了使用嵌入修饰核苷酸的低核苷酸随机库的改进SELEXTM方法(“2’-氧甲基SELEXTM”)，由上述库中可以筛选出对应特定靶的适体。
在一实施方案中，本发明提供了在特定转录条件下使用修饰酶将修饰核苷酸嵌入低核苷酸的方法。
在一实施方案中，本发明提供了使用变异聚合酶的方法。在一实施方案中，变异聚合酶是T7 RNA聚合酶。在一实施方案中，各种转录反应条件下使用在639位置(从酪氨酸残基变成苯丙氨酸残基“Y639E”)和784位置(从组氨酸残基变成丙氨酸残基“H784A”)发生变异的修饰T7 RNA聚合酶，从而造成修饰的核苷酸嵌入本发明的低核苷酸。
在另一实施方案中，各种转录反应条件下使用在639位置(从酪氨酸残基变成苯丙氨酸残基)发生变异的修饰T7 RNA聚合酶，从而造成修饰的核苷酸嵌入本发明的低核苷酸。
在另一实施方案中，各种转录反应条件下使用在784位置(从组氨酸残基变成丙氨酸残基)发生变异的修饰T7 RNA聚合酶，从而造成修饰的核苷酸嵌入本发明的适体。
在一实施方案中，本发明提供了通过本发明修饰酶增强修饰核苷酸嵌入的各种转录反应混合物。
在一实施方案中，向转录反应混合物加入锰离子，通过本发明修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。
在另一实施方案中，向转录反应混合物加入2’-羟基三磷酸鸟苷，通过本发明修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。
在另一实施方案中，向转录反应混合物加入聚乙二醇(PEG)，通过本发明修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。
在另一实施方案中，向转录反应混合物加入鸟苷酸(或者任何取代的鸟苷)，通过本发明修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。
在另一实施方案中，使用在模板低核苷酸5’固定区域(优选的是长度为20-25个核苷酸)的5’末端嵌入的前导序列，通过本发明修饰酶增强修饰核苷酸的嵌入。优选的是，前导序列的长度大于大约10个核苷酸。
在一实施方案中，使用由达到100％(包含)嘌呤核苷酸构成的前导序列。
在另一实施方案中，使用长度为至少6个核苷酸、由达到100％(包含)嘌呤核苷酸构成的前导序列。
在另一实施方案中，使用长度为至少8个核苷酸、由达到100％(包含)嘌呤核苷酸构成的前导序列。
在另一实施方案中，使用长度为至少10个核苷酸、由达到100％(包含)嘌呤核苷酸构成的前导序列。
在另一实施方案中，使用长度为至少12个核苷酸、由达到100％(包含)嘌呤核苷酸构成的前导序列。
在另一实施方案中，使用长度为至少14个核苷酸、由达到100％(包含)嘌呤核苷酸构成的前导序列。
在一实施方案中，本发明提供了在其序列中嵌入修饰核苷酸的适体治疗剂。
在一实施方案中，本发明提供了其序列中嵌入修饰核苷酸适体治疗剂的应用。
在一实施方案中，本发明提供了用于转录的各种核苷酸组合物，从而使用SELEXTM法筛选适体。在一实施方案中，本发明提供了三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷、三磷酸胸苷、三磷酸尿苷核苷酸的2’-羟基、2’-氟、2’-脱氧、2’-氧甲基的修饰组合。在一实施方案中，本发明提供了三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷、三磷酸胸苷、三磷酸尿苷核苷酸的2’-羟基、2’-氟、2’-脱氧、2’-氧甲基、2’-NH2、和2’-甲氧基乙基修饰的56个组合。
本发明涉及对应靶分子识别核酸配体的方法，其中配体含有修饰的核苷酸，包括下列步骤a)制备转录反应混合物，其中包括变异聚合酶、一种或者多种2’-修饰三磷酸核苷(NTPs)、镁离子、和一种或者多种低核苷酸转录模板；b)通过在一定条件下转录一种或者多种低核苷酸转录模板，制备单链核酸的候选混合物，由此变异聚合酶将至少一种或者多种核苷酸嵌入所述候选混合物的每一种核酸，其中所述候选混合物的每种核酸包括选自2’-位置修饰嘧啶与2’-位置修饰嘌呤的2’-修饰核苷酸；c)将候选混合物与所述的靶分子相接触；d)从剩余的候选混合物分离出相对于候选混合物与靶分子亲合性增强的核酸；e)在生命体外扩增亲合性增强的核酸，产生富含配体的核酸混合物。
2’-位置修饰的嘧啶和2’-位置修饰的嘌呤包括2’-羟基、2’-脱氧、2’-氧—甲基、2’-NH2、2’-氟、和2’-甲氧基乙基的修饰。优选的是，2’-修饰核苷酸是2’-氧—甲基或者2’-氟核苷酸。
在一些实施方案中，变异的聚合酶是变异的T7 RNA聚合酶，例如在639位置从酪氨酸残基变异为苯丙氨酸残基的T7 RNA聚合酶(Y639F)、在748位置从组氨酸残基变异为丙氨酸残基的T7 RNA聚合酶(H784A)、在639位置从酪氨酸残基变异为苯丙氨酸残基并且在748位置从组氨酸残基变异为丙氨酸残基的T7 RNA聚合酶(Y639F/H784A)。
在一些实施方案中，低核苷酸转录模板包括嵌入其5’端固定区域5’端的前导序列。例如，前导序列是全嘌呤的前导序列。例如，前导序列的长度可以是至少6个核苷酸、至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、或者至少14个核苷酸。
在一些实施方案中，转录反应混合物还包括锰离子。例如，镁离子浓度是锰离子浓度的3.0-3.5倍。
在转录反应混合物的一些实施方案中，每种三磷酸核苷浓度为0.5mM，镁离子浓度为5.0mM，锰离子浓度为1.5mM。在转录反应混合物的另一些实施方案中，每种三磷酸核苷浓度为1.0mM，镁离子浓度为6.5mM，锰离子浓度为2.0mM。在转录反应混合物的另一些实施方案中，每种三磷酸核苷浓度为2.0mM，镁离子浓度为9.6mM，锰离子浓度为2.9mM。
在一些实施方案中，转录反应混合物还包括2’-羟基三磷酸鸟苷。
在一些实施方案中，转录反应混合物还包括聚亚烷基二醇。例如，聚亚烷基二醇可以是聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，转录反应混合物还包括鸟苷酸。
在一些实施方案中，对应靶分子识别核酸配体的方法还包括重复步骤(d)从剩余的候选混合物分离出相对于候选混合物与靶分子亲合性增强的核酸；(e)在生命体外扩增亲合性增强的核酸，产生富含配体的核酸混合物。
在一些方面，本发明涉及按照本发明方法识别对应凝血酶的核酸配体。
在一些方面，本发明涉及按照本发明方法识别对应血管内皮生长因子(VEGF)的核酸配体。
在一些方面，本发明涉及按照本发明方法识别对应免疫球蛋白E的核酸配体。
在一些方面，本发明涉及按照本发明方法识别对应IL-23的核酸配体。
在一些方面，本发明涉及按照本发明方法识别对应血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)的核酸配体。
在一些实施方案中，转录反应混合物包括2’-羟基三磷酸腺苷(ATP)、2’-羟基三磷酸鸟苷(GTP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)和2’-氧-甲基-三磷酸尿苷(UTP)。
在一些实施方案中，转录反应混合物包括2’-脱氧三磷酸嘌呤核苷酸和2’-氧-甲基三磷酸嘧啶核苷酸。
在一些实施方案中，转录反应混合物包括2’-氧-甲基三磷酸腺苷(ATP)、2’-羟基三磷酸鸟苷(GTP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)和2’-氧-甲基-三磷酸尿苷(UTP)。
在一些实施方案中，转录反应混合物包括2’-氧-甲基三磷酸腺苷(ATP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)、2’-氧-甲基三磷酸尿苷(UTP)和2’-氧-甲基-三磷酸鸟苷(GTP)和脱氧三磷酸鸟苷(GTP)，其中脱氧三磷酸鸟苷至多占到三磷酸鸟苷总量的10％。
在一些实施方案中，转录反应混合物包括2’-氧-甲基三磷酸腺苷(ATP)、2’-氟三磷酸鸟苷(GTP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)和2’-氧-甲基-三磷酸尿苷(UTP)。
在一些实施方案中，转录反应混合物包括2’-脱氧三磷酸腺苷(ATP)、2’-氧-甲基三磷酸鸟苷(GTP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)和2’-氧-甲基-三磷酸尿苷(UTP)。
本发明还涉及一种制备含有一种或者多种修饰核苷酸的核酸的方法，其中包括制备转录反应混合物，其中包括变异聚合酶、一种或者多种2’-修饰的三磷酸核苷(NTPs)、镁离子和一种或者多种低核苷酸转录模板；在一定条件下将一种或者多种低核苷酸转录模板与变异的聚合酶相接触，由此变异聚合酶将一种或者多种2’-修饰核苷酸嵌入核酸转录产物。
2’-位置修饰嘧啶和2’-位置修饰嘌呤包括2’-羟基、2’-脱氧、2’-氧-甲基、2’-NH2、2’-氟、和2’-甲氧基乙基修饰。优选的是，2’-修饰核苷酸是2’-氧-甲基核苷酸，或者是2’-氟核苷酸。
在一些实施方案中，变异聚合酶是变异的T7 RNA聚合酶，例如在639位置从酪氨酸残基变异为苯丙氨酸残基的T7 RNA聚合酶(Y639E)、在784位置从组氨酸残基变异为丙氨酸残基的T7 RNA聚合酶(H784A)、在639位置从酪氨酸残基变异为苯丙氨酸残基并且在784位置从组氨酸残基变异为丙氨酸残基的T7RNA聚合酶(Y639E/H784A)。
在一些实施方案中，低核苷酸转录模板包括嵌入其5’末端固定区域5’末端的前导序列。例如，前导序列是全嘌呤的前导序列。例如，全嘌呤前导序列的长度可以是至少6个核苷酸、至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、或者至少14个核苷酸。
在一些实施方案中，转录反应混合物还包括锰离子。例如，镁离子浓度是锰离子浓度的3.0-3.5倍。
在转录反应混合物的一些实施方案中，每种三磷酸核苷浓度为0.5mM，镁离子浓度为5.0mM，锰离子浓度为1.5mM。在转录反应混合物的另一些实施方案中，每种三磷酸核苷浓度为1.0mM，镁离子浓度为6.5mM，锰离子浓度为2.0mM。在转录反应混合物的另一些实施方案中，每种三磷酸核苷浓度为2.0mM，镁离子浓度为9.6mM，锰离子浓度为2.9mM。
在一些实施方案中，转录反应混合物还包括2’-羟基三磷酸鸟苷。
在一些实施方案中，转录反应混合物还包括聚亚烷基二醇。例如，聚亚烷基二醇可以是聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，转录反应混合物还包括鸟苷酸。
本发明还涉及含有序列的适体组合物，其中所有腺苷核苷酸基本上是2’-羟基腺苷，所有的鸟苷核苷酸基本是2’-羟基鸟苷，所有的胞苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基胞苷，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷。在一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸都是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷。
本发明还涉及含有序列的适体组合物，其中所有嘌呤核苷酸基本上是2’-脱氧嘌呤，所有的嘧啶核苷酸基本上是2’-氧-甲基嘧啶。在一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有嘌呤核苷酸的至少80％是2’-脱氧嘌呤，所有嘧啶核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基嘧啶。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有嘌呤核苷酸的至少90％是2’-脱氧嘌呤，所有嘧啶核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基嘧啶。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有嘌呤核苷酸都是2’-脱氧嘌呤，所有嘧啶核苷酸都是2’-氧-甲基嘧啶。
本发明还涉及含有序列的适体组合物，其中所有鸟苷核苷酸基本上是2’-羟基鸟苷，所有的胞苷核苷酸基本是2’-氧-甲基胞苷，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷，所有的腺苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基腺苷。在一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷，所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基腺苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷，所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基腺苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有鸟苷核苷酸都是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷，所有腺苷核苷酸都是2’-氧-甲基腺苷。
本发明还涉及含有序列的适体组合物，其中所有的腺苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基腺苷，所有的胞苷核苷酸基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基鸟苷或者脱氧鸟苷，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷，其中脱氧鸟苷含量小于10％鸟苷核苷酸。在一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基腺苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷，并且脱氧鸟苷不超过鸟苷核苷酸总量的10％。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基腺苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷，并且脱氧鸟苷不超过鸟苷核苷酸总量的10％。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸都是2’-氧-甲基腺苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的90％是2’-氧-甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷，并且脱氧鸟苷不超过鸟苷核苷酸总量的10％。
本发明还涉及含有序列的适体组合物，其中所有的腺苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基腺苷，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷，所有的胞苷核苷酸基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸基本上是2’-氟鸟苷序列。在一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基腺苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-氟鸟苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基腺苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-氟鸟苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸都是2’-氧-甲基腺苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-氟鸟苷。
本发明还涉及含有序列的适体组合物，其中所有的腺苷核苷酸基本上是2’-脱氧腺苷，所有的胞苷核苷酸基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基鸟苷序列，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷。在一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-脱氧腺苷，所有胞苷核苷酸的至少80％基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基鸟苷序列，所有的尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-脱氧腺苷，所有胞苷核苷酸的至少90％基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基鸟苷序列，所有的尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸都是2’-脱氧腺苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-氧-甲基鸟苷序列，所有的尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷。
本发明还涉及含有序列的适体组合物，其中所有的腺苷核苷酸基本上是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸基本上是2’-羟基鸟苷，所有的胞苷核苷酸基本是2’-羟基胞苷，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-羟基尿苷。在一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-羟基腺苷，所有胞苷核苷酸的至少80％基本是2’-羟基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-羟基鸟苷，所有的尿苷核苷酸的至少80％是2’-羟基尿苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-羟基腺苷，所有胞苷核苷酸的至少90％基本是2’-羟基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-羟基鸟苷序列，所有的尿苷核苷酸的至少90％是2’-羟基尿苷。在另一实施方案中，适体含有序列组合物，其中所有腺苷核苷酸都是2’-羟基腺苷，所有胞苷核苷酸都是2’-羟基胞苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-羟基鸟苷，所有的尿苷核苷酸都是2’-羟基尿苷。
发明详述在下述说明中将会详细阐述本发明的一个或者多个实施方案。尽管在实施或者检验本发明过程中可以使用与文中所述相同或者相似的任何方法与材料，但是下文将描述优选的方法与材料。参照说明书，本发明的其它特点、目的和优点将显而易见。在说明书中除非文中有明确的表示，否则单数形式也包括复数的情况。除非另有说明，文中所用的所有技术与科学名词具有与本领域普通技术人员普遍理解相同的含义。在发生冲突的情况下以本说明书为准。
修饰核苷酸转录本发明提供了产生稳定低核苷酸(包括，例如适体)的材料与方法，该低核苷酸含有修饰的核苷酸(例如在2’位置上具有修饰的核苷酸)，从而使低核苷酸比未经修饰的低核苷酸更具稳定性。对于酶促降解和化学降解、热降解和物理降解，由本发明材料与方法产生稳定的低核苷酸也更加稳定。
为了使适体可以用做治疗剂，优选的是，此适体可以廉价地合成，并且在体内安全稳定。通常，由于易受核酸酶的降解，野生型RNA和DNA适体在生命体内不稳定。通过在2’位置嵌入修饰基团，可以显著增加适体的抗核酸酶降解特性。人们已经成功地将氟和氨基基团嵌入低核苷酸库，然后，从上述库筛选出适体。然而，这些修饰显著增加了合成所得适体的成本；因为存在下述可能性，又引发了安全问题修饰的核苷酸可以循环进入宿主的DNA，通过降解修饰的低核苷酸，随后，利用修饰的核苷酸为底物合成DNA。
含有2’-氧—甲基(2’-OMe)核苷酸的适体克服了上述缺点。含有2’-氧—甲基核苷酸的低核苷酸具有抗核酸酶特性，并且可以廉价合成。尽管2’-氧—甲基核苷酸普遍存在于生物系统中，但是在生理条件下天然聚合酶不能接受2’-氧—甲基三磷酸核苷做为底物，因此，就不存在2’-氧—甲基核苷酸循环进入宿主DNA的安全问题。2’-氧—甲基核苷酸的通式展示在图2中。
在文献中出现了含有2’-氧—甲基适体的多个实例，例如参见Green等人，《当代生物学》第1995年第2期第683-695页。通过从修饰转录产物库生命体外筛选产生适体，在库中C和U残基发生2’-氟取代，A和G残基发生2’-羟基取代。一旦识别出官能序列，然后，就测定每个A和G残基是否允许发生2’-氧甲基取代，最后，重新合成适体，使其所有的A和G残基都允许发生2’-氧甲基取代，成为2’-氧甲基残基。采用上述两个步骤方法生成的大部分A和G残基适体都允许发生2’-氧甲基残基取代，但是平均大约20％未能发生取代。因此，利用上述方法生成的适体趋向于含有二—四个2’-羟基残基，结果，适体的稳定性与合成成本就只能折衷了。通过将修饰的核苷酸嵌入转录反应，生成用于低核苷酸库的稳定低核苷酸，采用SELEXTM法(和/或SELEXTM法的任何变化与改进，包括下文所述的方法)从上述库中筛选并浓缩适体；本发明方法消除了稳定筛选的适体低核苷酸的必要(例如，通过重新合成含有修饰核苷酸的适体低核苷酸)。
此外，在完成筛选过程后，可以进一步稳定本发明的修饰低核苷酸(参见下文“SELEXTM后修饰”，包括截去、删除、和修饰)。
SELEXTM方法一种适合生成适体的方法采用了称为“指数富集系统发育配体”(“SELEXTM”)的工艺，并在
图1中有概括描述。SELEXTM工艺是一种在生命体外发育与靶分子强特异性结合核酸分子的方法，例如记载在1990年1月11日提交、现已放弃的美国专利申请07/536,428，标题为“核酸配体”的美国专利5,475,096，标题为“核酸配体”的美国专利5,270,163(也可以参见WO91/19813)。每一个SELEXTM识别的核酸配体都是对应特定靶化合物或者分子的特效配体。SELEXTM工艺是基于独特的识别力，该识别力使核酸具有形成各种二维和三维结构的充足能力；SELEXTM工艺还基于核酸单体内提供的充足化学多能性，该多能性使核酸单体对应任何实际的化学复合物，不管是单体或者聚合体，都可以充当配体(形成特效结合对)。任何尺寸的分子或者组合物都可以作为靶。
SELEXTM工艺需要一个大型单链低核苷酸模板库作为起点，该模板含有在DNA合成机上化学合成产生的随机序列。在一些实例中，筛选100％随机低核苷酸的群体。在另一些实例中，在群体中的每个低核苷酸包括一个随机序列以及在其3’和/或5’末端至少一个固定序列，该固定序列包括低核苷酸群体中所有分子共享的序列。固定序列包括多种序列，例如对应PCR引子的杂交位点，对应RNA聚合酶的启动子序列(例如T3、T4、T7、SP6等)，限制位点，或者同聚物序列、例如聚A或者聚T段，催化核心，选择性结合亲合层析柱的位点，有利于克隆和/或排序重要低核苷酸的其它序列。
低核苷酸的随机序列部分可以是任何长度，可以包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，并且可以包括修饰的或者非天然的核苷酸或者核苷酸类似物。参见，例如美国专利5,958,691；5,660,985；5,958,691；5,817,635；和5,672,695,和PCT文献WO92/07065。使用本领域公知的固相低核苷酸合成技术，由磷酸二酯—连接的核苷酸合成随机的低核苷酸(Froehler等人，《核酸研究》1986年第14期第5399-5467页；Froehler等人，《Tet.Lett》1986年第27期第5575-5578页)。使用液相法，例如三酯合成法(Sood等人，《核酸研究》1977年第4期第2557页；Hirose等人，《Tet.Lett》1978年第28期第2449页)，也可以合成低核苷酸。在自动DNA合成装置上实施的常规合成生成了1015-1017个分子。在序列设计中随机序列的充足空间增加了每个合成分子代表一种独特序列的可能性。
为了合成随机序列，在合成过程每个核苷酸的增加步骤中，加入所有四种核苷酸的混合物，从而实现核苷酸的随机嵌入。在一实施方案中，随机低核苷酸包括整个随机序列；然而，在另一实施方案中，随机的低核苷酸可以包括非随机或者部分随机序列的范围。部分随机序列可以通过在每一增加步骤中以不同摩尔比率添加四种核苷酸制备而成的。
通常，模板含有固定的5’和3’末端序列，该末端序列侧面保护着30-50个随机核苷酸的内部区域。标准规模(1微摩尔)的合成会产生1015-1016单个模板分子，足以满足最大的SELEXTM实验。利用重组的T7 RNA聚合酶，由初始库生命体外转录生成RNA库。然后，在有利于结合的条件下将所得的库与靶混合，再按照相同的总筛选方案，逐步重复结合、分离、扩增步骤，从而达到结合亲合性与选择性的实际所需标准。从核酸混合物开始，优选包括随机序列的片段，SELEXTM方法包括下列步骤先在有利于结合的条件下将上述混合物与靶分子接触，然后，从已经与靶分子特异性结合的核酸分子中将尚未结合的核酸分子分离出去，接着，分解核酸—靶分子的复合体，然后，扩增从核酸—靶分子复合体分解出的核酸，生成富含配体的核酸混合物，接着，重复结合步骤、分离步骤、分解步骤、扩增步骤，按照需要经过多次循环，产生对应靶分子的强特异性、强亲合性的核酸配体。
在含有大量可能序列与结构的核酸混合物中，对于特定靶分子存在范围广阔的结合亲合性。例如，仅含有天然未修饰核苷酸的片段由20种核苷酸随机排列，包括此片段的核酸可以具有420种候选物可能性。具有恒定强亲合性的核酸分子最可能与靶分子结合。经过分离、分解与扩增步骤，产生了富集更强结合亲合性候选物的第二核酸混合物。多轮筛选循环渐进性地筛选出最佳配体，直到所得的核酸混合物主要由单一或者几个序列构成。然后，这些序列可以经过克隆、排序，作为纯态配体逐一测定结合亲合性。
重复筛选与扩增循环，直至达到所需的目标。在最普通的情况下，连续进行筛选与扩增，直到重复循环中结合力没有显著的改善为止。此方法可以用于大约1018个不同核酸种类的样品。实验混合物的核酸优选包括随机序列部分以及有效扩增所需的保守序列。可以采用多种方法生成核酸序列变体，其中包括合成随机核酸序列，按照尺寸筛选随机断裂的细胞核酸。可变序列部分可以包括完全随机序列或者部分随机序列；还可以包括嵌入随机序列保守序列的子部分。在重复筛选与扩增以前或者过程中，可以通过诱发突变引导或者增加实验核酸中的序列变体。
在SELEXTM的一实施方案中，在离析最强结合所选靶分子的核酸配体方面，筛选方法非常有效，以致只需要筛选与扩增的一次循环。例如，这类有效筛选可以出现在色谱类型的方法中，由于核酸与固定在色谱柱上靶分子的结合能力以此方式发挥作用，因此色谱柱能够有效地分离并离析最强亲合性的核酸配体。
在一些情况下，没有必要重复SELEXTM步骤，直到识别出单一的核酸配体。靶特异性核酸配体溶液可以包括核酸结构或者基序的族，该核酸结构或者基序含有大量保守序列和经取代或者添加不显著影响核酸配体与靶分子亲合性的大量序列。在完成前终止SELEXTM方法，有可能确定出核酸配体溶液族的大量序列。
众所周知存在各种核酸的第一、第二和第三结构。最普通表现为不涉及沃森—克里克类型相互作用的结构或者基序被称为发夹环、对称和非对称的凸出、假结体和相同的无数组合。这些基序的绝大部分公知情况说明，它们以不超过30个核苷酸的核酸序列构成。基于此原因通常优选的是，使用连接随机片段的SELEXTM方法以含有大约20-50个核苷酸随机片段的核酸序列引发。
核心SELEXTM方法经过修改，可以达到多种特殊目的。例如，美国专利5,707,796公开了使用SELEXTM方法结合凝胶电泳，筛选带有特定结构特征的核酸分子，例如转折DNA。美国专利5,763,177公开了筛选含有光敏基团核苷酸配体的SELEXTM方法，该光敏基团能够结合靶分子、和/或与靶分子光致交联、和/或光灭活靶分子。美国专利5,567,588和1997年1月31日提交、标题为“流槽SELEXTM法”的美国申请08/792,075公开了一种在对应靶分子具有强和弱亲合性的低核苷酸之间实现高效分离的SELEXTM法。美国专利5,496,938公开了，在实施SELEXTM方法后获得改进核酸配体的方法。美国专利5,705,337公开了将配体与其靶分子共价连接的方法。
SELEXTM法还可以用于获得与靶分子多个位点结合的核酸配体，还可以获得包括与靶分子上特定位点结合的非核酸种类的核酸配体。SELEXTM法提供了离析并识别与任何可预见靶结合核酸配体的方法，包括大型和小型生物分子，其中包括蛋白(包括核酸结合蛋白和作为其部分生理功能结合核酸的非公知蛋白)、辅助因子和其它小分子。例如，参见美国专利5,580,737，该专利公开了由SELEXTM法识别的核酸序列，该核酸序列能够与咖啡因以及紧密相关的类似物茶碱强亲合性结合。
反-SELEXTM法是一种通过消除与一种或者多种非靶分子交叉反应的核酸配体序列改进核酸配体对应靶分子特异性的方法。反-SELEXTM法是由下列步骤构成(a)制备核酸候选混合物；(b)将候选混合物与靶分子接触，从候选混合物中分离出对应靶分子具有更强亲合性的核酸分子；(c)从候选混合物的剩余物中分离亲合性更强的核酸分子；(d)将亲合性更强的核酸与一种或者多种非靶分子接触，从而去除对于非靶分子具有特效亲合性的核酸配体；(e)扩增对应靶分子具有特效亲合性的核酸，从而产生富含对于结合靶分子具有相对更强亲合性与特异性核酸序列的核酸混合物。
使用核酸做为治疗剂和疫苗面临的一个问题是，未显现所需的效果以前体液中磷酸二酯形式的低核苷酸可以被细胞内酶、和/或细胞外酶迅速降解，例如核酸内切酶和核酸外切酶。因此，SELEXTM法完成强亲合性核酸配体的识别，该核酸配体经过筛选后，需要改变以含有赋予配体改进特性的修饰核苷酸，例如改进的生命体内稳定性或者改进的输送特性。核酸配体修饰不限于此地包括提供其它化学基团的修饰，该化学基团将附加电荷、极化率、疏水性、氢键结合、静电相互作用以及流动性一同嵌入核酸配体碱基，或者与核酸配体溶为一体。修饰包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置的化学取代，例如2’-位置糖修饰、5-位置嘧啶修饰、8-位置嘌呤修饰、环外氨基基团的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或者5-碘代—尿嘧啶的取代；主链修饰，磷硫酰或者烷基磷酸修饰，甲基化，非常规碱基对组合，例如异碱基异胞啶与异胍等。修饰还可以包括3’和5’修饰，例如加帽。
在含有修饰糖基团的低核苷酸中，例如，一个或者多个羟基基团被卤素、脂肪族基团取代，或者官能化为醚或者氨基基团。在呋喃糖残基2’-位置的取代实例包括氧—烷基(例如，氧—甲基)、氧—烯丙基、硫—烷基、硫—烯丙基、或者卤素基团。合成2’-修饰糖的方法参见Sproat等人，《核酸研究)》1991年第19期第733-738页；Cotton等人，《核酸研究》1991年第19期第2629-2635页；Hobbs等人，《生物化学》1973年第12期第5138-5145页。其它修饰对于本领域普通技术人员众所周知。
筛选后合成含有修饰核苷酸的SELEXTM-识别核苷酸配体记载在美国专利5,660,985中，该专利公开了含有在嘧啶5’和2’位置上化学修饰核苷酸衍生物的低核苷酸。此外，美国专利5,756,703公开了含有各种2’-修饰嘧啶的低核苷酸；美国专利5,580,737公开了含有一种或者多种由2’-氨基(2’-NH2)、2’-氟(2’-F)、和/或2’-氧—甲基(2’-OMe)取代修饰核苷酸的强特异性核酸配体。
如美国专利5,637,459和美国专利5,683,867所述，SELEXTM方法包括将所选的低核苷酸与其它所选的低核苷酸、非低核苷酸的官能单元合并。如美国专利6,011,020所述，SELEXTM方法还包括，在诊断或者治疗复合体中将所选的核酸配体与亲脂或者非致免疫性的大分子量化合物结合。美国专利5,859,228公开了，在诊断或者治疗复合体中与亲脂化合物(例如，二酰基甘油、或者二烷基甘油)结合的血管内皮生长因子核酸配体。
美国专利6,051,698也公开了，与亲脂化合物(例如，甘油脂)结合的、或者与非致免疫的大分子量化合物(例如，聚亚烷基二醇)结合的血管内皮生长因子核酸配体。与非致免疫的大分子量化合物、或者亲脂化合物结合的血管内皮生长因子核酸配体还记载在PCT申请WO98/18480中。这些专利与申请公开了，一大批低核苷酸的有效扩增与复制特性、其它特性、形状与其它分子令人满意特性的组合。
利用SELEXTM方法还已经开发了核酸配体对小型多变肽的识别。小型肽具有多变的结构，通常以多种构象的平衡状态存在于溶液中，因此，人们最初认为，基于与多变肽结合，结合亲合性受到构象熵损失的限制。然而，美国专利5,648,214证实了溶液中核酸配体识别小型肽的可行性。在此专利中，高亲合性RNA核酸配体识别出P物质和11种氨基酸肽。
为了产生抗核酸酶与水解的低核苷酸群体，可以使用修饰的低核苷酸，该修饰的核苷酸可以包括一种或者多种取代的核苷酸问连接、修改的糖、修改的碱基、或者其组合。在一实施方案中，提供了低核苷酸，其中P(O)O基团被下列基团取代P(O)S(“硫化”)、P(S)S(“二硫化”)、P(O)NR2(“酰胺化”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或者CH2(“甲缩醛”)或者3’-氨基(-NH-CH2-CH2-)，其中R或者R’独立地是氢、或者取代或未经取代的烷基。通过-O-、-N-、或者-S-连接可以将连接基团附着在相邻的核苷酸上。在低核苷酸中不需要所有的连接都相同。
通常，在5-20次循环过程中筛选核酸适体分子。在一实施方案中，仅在初始筛选阶段引发异质性问题，而不会在整个重复过程中出现。
通过在DNA合成机上自动化学合成，产生了初始的DNA序列库。使用T7 RNA聚合酶或者修饰的T7 RNA聚合酶，将序列库在生命体外转录为RNA，再提纯。在一实例中，5’-固定随机3’-固定序列包括30-50个核苷酸的随机序列。
将修饰的核苷酸嵌入本发明的适体可以在筛选方法以前完成(例如“SELEXTM方法前修饰”)。任选的是，通过SELEXTM方法前修饰嵌入修饰核苷酸的本发明适体还可以在SELEXTM方法后进一步修饰(即SELEXTM方法前修饰后进行SELEXTM方法后修饰)。SELEXTM方法前修饰产生了对于SELEXTM靶具有特异性、还具有改进生命体内稳定性的修饰核酸配体。在对由SELEXTM方法前修饰嵌入核苷酸的核酸配体结合能力不产生副作用的条件下，SELEXTM方法后修饰(例如，修饰前已识别的由SELEXTM方法前修饰嵌入核苷酸的配体)可以进一步改善生命体内稳定性。
修饰的聚合酶在639位置从酪氨酸残基变为苯丙氨酸的单一变异T7聚合酶(Y639F)可以使用2’脱氧、2’氨基-、和2’氟-三磷酸核苷(NTPs)做为底物，并且已经广泛应用于合成各种用途的修饰RNA。然而，据报道，这种变异的T7聚合酶不能使用(例如，嵌入)带有更庞大2’-取代基的三磷酸核苷，例如2’-氧—甲基(2’-OMe)或者2’-叠氮基(2’-N3)取代基。为了嵌入庞大的2’取代基，双T7聚合酶变异体(Y639F/H784A)已经被公开，并且已经用于嵌入修饰嘧啶的三磷酸核苷，该双T7聚合酶变异体除了含有Y639F外，在784位置上组氨酸变为丙氨酸、或者其它小型氨基酸。还公开了在784位置上组氨酸变为丙氨酸的单变异T7聚合酶(H784A)(Padilla等人，《核酸研究》2002年第30期第138页)。在Y639F/H784A双变异和H784A单变异T7聚合酶中，更小氨基酸残基的变化允许更庞大核苷酸底物的嵌入，例如2’-氧甲基取代的核苷酸。
本发明提供了使用这些与其它修饰T7聚合酶的方法与条件；与野生型聚合酶相比，该修饰T7聚合酶对于在呋喃糖2’位置带有庞大取代基的修饰核苷酸具有更高嵌入率。通常，据发现，在文中公开的条件下，除了三磷酸鸟苷外Y693F单变异体可以用于嵌入所有的2’-氧甲基取代的三磷酸核苷，Y693F/H784A双变异体可以用于嵌入所有的2’-氧甲基取代的三磷酸核苷，其中包括三磷酸鸟苷。据认为，在文中所述条件下使用时H784A单变异体具有相似的特性。
本发明提供了修饰T7聚合酶将修饰的核苷酸酶促嵌入低核苷酸的方法与条件。此低核苷酸可以完全由修饰的核苷酸合成，或者带有修饰核苷酸的子集。修饰可以相同或者不同。所有核苷酸可以都得到修饰，并且所有核苷酸都含有相同的修饰。所有核苷酸可以都得到修饰，但是含有不同的修饰；例如，含有相同碱基的所有核苷酸可以含有一种类型的修饰，而含有其它碱基的核苷酸得到不同类型的修饰。所有嘌呤核苷酸可以含有一种类型的修饰(或者未经修饰)，而所有嘧啶核苷酸含有另一种不同类型的修饰(或者未经修饰)。以此方法，可以利用任何修饰组合生成转录产物、或者转录产物库，例如核糖核苷酸(2’-羟基，“rN”)、脱氧核糖核苷酸(2’-脱氧)、2’-氟、和2’-氧甲基核苷酸。含有2’-氧甲基C、U和2’-羟基A、G的混合物被称为“rRmY”；含有2’-脱氧A、G和2’-氧甲基U、C的混合物被称为“dRmY”；含有2’-氧甲基A、C、U和2’-羟基G的混合物被称为“rGmH”；交替含有2’-氧甲基A、C、U、G和2’-氧甲基A、U、C和2’-氟G的混合物被称为“toggle”；含有2’-氧甲基A、U、C、G的混合物被称为“r/mGmH”，其中达到10％的鸟苷核苷酸是脱氧鸟苷；含有2’-氧甲基A、U、C和2’-氟G的混合物被称为“fGmH”；含有脱氧A和2’-氧甲基C、G、U的混合物被称为“dAmB”。
优选的实施方案包括2’-羟基、2’-脱氧和2’-氧甲基核苷酸的任意组合。更优选的实施方案包括2’-脱氧和2’-氧甲基核苷酸的任意组合。更优选的实施方案使用了2’-脱氧和2’-氧甲基核苷酸的任意组合，其中嘧啶是2’-氧甲基(例如dRmY、rN、或者dGmH)。
2’-修饰的SELEXTM方法本发明提供了在聚合酶接受2’-修饰三磷酸核苷的条件下产生2’-修饰(例如，2’-氧甲基)RNA转录产物库的方法。优选的是，聚合酶是Y693F/H784A双变异体或者Y693F单变异体。其它聚合酶，特别是对于庞大2’-取代基表现出强耐受性的聚合酶，也可以应用于本发明。通过测定在文中所述的转录条件下聚合酶嵌入修饰核苷酸的能力，能够以效率为基准筛选上述聚合酶。已经确定了对于本发明方法所用转录条件至关重要的多种因素。例如，当将前导序列嵌入DNA转录模板5’末端固定序列的5’末端时，以致所得转录产物的至少大约前六个残基全部是嘌呤，那么就观察到修饰转录产物的产量大幅增加。
获得嵌入修饰核苷酸转录产物的另一个重要因素是2’-羟基三磷酸鸟苷的存在或者浓度。转录可以分为两个阶段第一个阶段是引发阶段，在此过程中将三磷酸核苷加入三磷酸鸟苷的3’-羟基末端(或者另一个取代鸟苷)，生成了二核苷酸，接着，扩展到大约10-12个核苷酸；第二个阶段是延伸阶段，在此过程中转录继续进行并且超出了第一阶段大约10-12个核苷酸。据发现，向含有过量2’-氧甲基三磷酸鸟苷的转录混合物加入少量的2’-羟基三磷酸鸟苷，利用2’-羟基三磷酸鸟苷可以有效地促使聚合酶引发转录；但是，一旦转录进入延伸阶段，在2’-氧甲基和2’-羟基三磷酸鸟苷之间的辨别力降低，超过2’-羟基三磷酸鸟苷的过量2’-氧甲基三磷酸鸟苷造成了主要为2’-氧甲基三磷酸鸟苷的嵌入。
将2’-氧甲基嵌入转录产物的另一个重要因素是在转录混合物中使用二价镁和锰。据发现，氯化镁和氯化锰的不同浓度组合可以影响2’-氧—甲基化转录产物的产量，氯化镁和氯化锰的最佳浓度取决于在复合二价金属离子的三磷酸核苷转录反应混合物中的浓度。为了获得最大化2’-取代氧甲基化转录产物(即，全部A、C和U，和大约90％G核苷酸)的最大产量，当每种三磷酸核苷的浓度为0.5mM时，优选的是大约5mM氯化镁和1.5mM氯化锰。当每种三磷酸核苷的浓度为1.0mM时，优选的是大约6.5mM氯化镁和2.0mM氯化锰。当每种三磷酸核苷的浓度为2.0mM时，优选的是大约9.6mM氯化镁和2.9mM氯化锰。在任何情况下，两种浓度达到2倍以上的偏差可以产生含量显著的修饰转录产物。
使用磷酸鸟苷或者鸟苷启动转录也是很重要的。这种效果来源于聚合酶对于引发核苷酸的特异性。因此，由此方式生成的任何转录产物5’-末端核苷酸有可能是2’-羟基鸟苷。磷酸鸟苷(或者鸟苷)优选的浓度是0.5mM，更优选的是1mM。另据发现，在转录反应中使用聚乙二醇(PEG)、优选的是PEG-8000，可以使修饰核苷酸的嵌入最大化。
为了将2’-氧甲基三磷酸腺苷(100％)、三磷酸尿苷(100％)、三磷酸胞苷(100％)、三磷酸鸟苷(大约90％)(“r/mGmH”)最大化地嵌入转录产物，优选采用下述条件HEPES缓冲液200mM、DTT 40mM、亚精胺2mM、PEG-8000 10％(重量/体积)、Triton X-100 0.01％(重量/体积)、二氯化镁5mM(当每种2’-氧甲基三磷酸核苷浓度为1.0mM时6.5mM)、二氯化锰1.5mM(当每种2’-氧甲基三磷酸核苷浓度为1.0mM时2.0mM)、2’-氧甲基三磷酸核苷(每种)500μM(更优选的是1.0mM)、2’-羟基三磷酸鸟苷30μM、2’-羟基磷酸鸟苷500μM、PH7.5的Y639F/H794A T7 RNA聚合酶15单位/毫升、无机焦磷酸酶5单位/毫升，并且全嘌呤前导序列长度至少8个核苷酸。如文中所用，一个单位的Y639F/H794A T7 RNA聚合酶(或者文中所述的任何其它变异T7 RNA聚合酶)定义为，在r/mGmH条件下将1毫摩尔2’-氧甲基三磷酸核苷嵌入转录产物所需的酶用量。如文中所用，1单位无机焦磷酸酶定义为，在PH7.2和25℃下每分钟释放1摩尔无机正磷酸所需的酶用量。
为了将2’-氧甲基三磷酸腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸胞苷(“rGmH”)最大化地嵌入(100％)转录产物，优选采用下述条件HEPES缓冲液200mM、DTT 40mM、亚精胺2mM、PEG-800010％(重量/体积)、Triton X-100 0.01％(重量/体积)、二氯化镁5mM(当每种2’-氧甲基三磷酸核苷浓度为2.0mM时9.6mM)、二氯化锰1.5mM(当每种2’-氧甲基三磷酸核苷浓度为2.0mM时2.9mM)、2’-氧甲基三磷酸核苷(每种)500μM(更优选的是2.0mM)、PH7.5的Y639F/H794A T7 RNA聚合酶15单位/毫升、无机焦磷酸酶5单位/毫升，并且全嘌呤前导序列长度为至少8个核苷酸。
为了将2’-氧甲基三磷酸尿苷、三磷酸胞苷(“rRmY”)最大化地嵌入(100％)转录产物，优选采用下述条件HEPES缓冲液200mM、DTT 40mM、亚精胺2mM、PEG-8000 10％(重量/体积)、Triton X-100 0.01％(重量/体积)、二氯化镁5mM(当每种2’-氧甲基三磷酸核苷浓度为2.0mM时9.6mM)、二氯化锰1.5mM(当每种2’-氧甲基三磷酸核苷浓度为2.0mM时2.9mM)、2’-氧甲基三磷酸核苷(每种)500μM(更优选的是2.0mM)、PH7.5的Y639F/H794A T7 RNA聚合酶15单位/毫升、无机焦磷酸酶5单位/毫升，并且全嘌呤前导序列长度为至少8个核苷酸。
为了将脱氧的三磷酸腺苷和三磷酸鸟苷、2’-氧甲基三磷酸尿苷、三磷酸胞苷(“dRmY”)最大化地嵌入(100％)转录产物，优选采用下述条件HEPES缓冲液200mM、DTT 40mM、亚精胺2mM、PEG-8000 10％(重量/体积)、Triton X-100 0.01％(重量/体积)、二氯化镁9.6mM、二氯化锰2.9mM、2’-氧甲基三磷酸核苷(每种)2.0mM、PH7.5的Y639F T7 RNA聚合酶15单位/毫升、无机焦磷酸酶5单位/毫升，并且全嘌呤前导序列长度为至少8个核苷酸。
为了将2’-氧甲基三磷酸腺苷、三磷酸尿苷、三磷酸胞苷、以及2’-氟三磷酸鸟苷(“fGmH”)最大化地嵌入(100％)转录产物，优选采用下述条件HEPES缓冲液200mM、DTT 40mM、亚精胺2mM、PEG-8000 10％(重量/体积)、Triton X-100 0.01％(重量/体积)、二氯化镁9.6mM、二氯化锰2.9mM、2’-氧甲基三磷酸核苷(每种)2.0mM、PH7.5的Y639F T7 RNA聚合酶15单位/毫升、无机焦磷酸酶5单位/毫升，并且全嘌呤前导序列长度为至少8个核苷酸。
为了将脱氧的三磷酸腺苷、以及2’-氧甲基三磷酸尿苷、三磷酸鸟苷、三磷酸胞苷(“dAmB”)最大化地嵌入(100％)转录产物，优选采用下述条件HEPES缓冲液200mM、DTT 40mM、亚精胺2mM、PEG-8000 10％(重量/体积)、Triton X-100 0.01％(重量/体积)、二氯化镁9.6mM、二氯化锰2.9mM、2’-氧甲基三磷酸核苷(每种)2.0mM、PH7.5的Y639F T7 RNA聚合酶15单位/毫升、无机焦磷酸酶5单位/毫升，并且全嘌呤前导序列长度为至少8个核苷酸。
在上述的各种情况下，(1)优选在30-45℃下进行转录，并持续至少2个小时；(2)使用50-300nM的双链DNA转录模板(对于第1循环使用200nM模板，以增加多样性(300nM模板用于dRmY转录)；并且在后续循环文中所述的条件下使用大约50nM，最佳PCR反应稀释为1/10)。最佳的DNA转录模板如下文所示(其中ARC254和ARC256在全2’-氧甲基条件下转录，ARC255在rRmY条件下转录)。
ARC2545’-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’(序列NO1)ARC2555’-CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’(序列NO2)ARC2565’-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’(序列NO453)在本发明的rN转录条件下，转录反应混合物包括2’-羟基三磷酸腺苷(ATP)、2’-羟基三磷酸鸟苷(GTP)、2’-羟基三磷酸胞苷(CTP)、2’-羟基三磷酸尿苷(UTP)。利用本发明rN转录混合物制备的修饰低核苷酸基本上含有全部的2’-羟基腺苷、2’-羟基鸟苷、2’-羟基胞苷、2’-羟基尿苷。在rN转录的优选实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-羟基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-羟基尿苷。在rN转录的更优选实施方案中，本发明所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-羟基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-羟基尿苷。在rN转录的最优选实施方案中，本发明修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸都是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸都是2’-羟基胞苷，所有尿苷核苷酸都是2’-羟基尿苷。
在本发明的rRmY转录条件下，转录反应混合物包括2’-羟基三磷酸腺苷、2’-羟基三磷酸鸟苷、2’-氧甲基三磷酸胞苷、2’-氧甲基三磷酸尿苷。利用本发明rRmY转录混合物制备的修饰低核苷酸基本上含有全部的2’-羟基腺苷、2’-羟基鸟苷、2’-氧甲基胞苷、2’-氧甲基尿苷。在优选实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基尿苷。在更优选的实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基尿苷。在最优选的实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸都是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧—甲基胞苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧—甲基尿苷。
在本发明的dRmY转录条件下，转录反应混合物包括2’-脱氧三磷酸嘌呤、2’-氧—甲基三磷酸嘧啶。利用本发明dRmY转录条件制备的修饰低核苷酸基本上含有全部的2’-脱氧三磷酸嘌呤、2’-氧—甲基三磷酸嘧啶。在优选实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有嘌呤核苷酸的至少80％是2’-脱氧嘌呤，所有嘧啶核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基嘧啶。在更优选的实施方案中，所得的本发明修饰低核苷酸含有序列，其中所有嘌呤核苷酸的至少90％是2’-脱氧嘌呤，所有嘧啶核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基嘧啶。在最优选的实施方案中，所得的本发明修饰低核苷酸含有序列，其中所有嘌呤核苷酸都是2’-脱氧嘌呤，所有嘧啶核苷酸都是2’-氧—甲基嘧啶。
在本发明的rGmH转录条件下，转录反应混合物包括2’-羟基三磷酸鸟苷、2’-氧—甲基三磷酸胞苷、2’-氧—甲基三磷酸尿苷、2’-氧—甲基三磷酸腺苷。利用本发明rGmH转录混合物制备的修饰低核苷酸基本上含有全部的2’-羟基鸟苷、2’-氧—甲基胞苷、2’-氧—甲基尿苷、2’-氧—甲基腺苷。在优选实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基尿苷，所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基腺苷。在更优选的实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基尿苷，所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基腺苷。在最优选的实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有鸟苷核苷酸都是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧—甲基胞苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧—甲基尿苷，所有腺苷核苷酸都是2’-氧—甲基腺苷。
在本发明的r/mGmH转录条件下，转录反应混合物包括2’-氧—甲基三磷酸腺苷、2’-氧甲基三磷酸胞苷、2’-氧—甲基三磷酸鸟苷、2’-氧—甲基三磷酸尿苷、脱氧的三磷酸鸟苷。利用本发明r/mGmH转录混合物制备的修饰低核苷酸基本上含有全部的2’-氧—甲基腺苷、2’-氧—甲基胞苷、2’-氧—甲基鸟苷、2’-氧—甲基尿苷，其中鸟苷核苷酸群体至多含有大约10％脱氧鸟苷。在优选实施方案中，所得的本发明r/mGmH修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基腺苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基尿苷，并且不超过10％的所有鸟苷核苷酸是脱氧鸟苷。在更优选的实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基腺苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基尿苷，并且不超过10％的所有鸟苷核苷酸是脱氧鸟苷。在最优选的实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸都是2’-氧—甲基腺苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧—甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的90％是2’-氧—甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧—甲基尿苷，并且不超过10％的所有鸟苷核苷酸是脱氧鸟苷。
在本发明的fGmH转录条件下，转录反应混合物包括2’-氧—甲基三磷酸腺苷(ATP)、2’-氧—甲基三磷酸尿苷(UTP)、2’-氧—甲基三磷酸胞苷(CTP)、2’-氟三磷酸鸟苷。利用本发明fGmH转录条件制备的修饰低核苷酸基本上含有全部的2’-氧—甲基腺苷、2’-氧—甲基尿苷(UTP)、2’-氧—甲基胞苷、2’-氟鸟苷。在优选实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基腺苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基尿苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-氟鸟苷。在更优选的实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基腺苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基尿苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-氟鸟苷。在最优选的实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸都是2’-氧—甲基腺苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧—甲基尿苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧—甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-氟鸟苷。
在本发明的dAmB转录条件下，转录反应混合物包括2’-脱氧三磷酸腺苷(dATP)、2’-氧—甲基三磷酸胞苷(CTP)、2’-氧—甲基三磷酸鸟苷(GTP)、2’-氧—甲基三磷酸尿苷(UTP)。利用本发明dAmB转录混合物制备的修饰低核苷酸基本上含有全部的2’-脱氧腺苷、2’-氧—甲基胞苷、2’-氧—甲基鸟苷、2’-氧—甲基尿苷。在优选实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-脱氧腺苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧—甲基尿苷。在更优选实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-脱氧腺苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧—甲基尿苷。在最优选实施方案中，所得的修饰低核苷酸含有序列，其中所有腺苷核苷酸都是2’-脱氧腺苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧—甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-氧—甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧—甲基尿苷。
在每种情况下，转录产物可以用做SELEXTM方法中识别适体、和/或确定对于特定靶具有结合特异性序列保守基序的库。如果所得序列已经获得稳定化处理，那么就可以从方法中消除获得稳定化适体序列的步骤，结果得到更强稳定性的适体。2’-氧—甲基SELEXTM方法的另一个优点是，所得的序列可能含有序列所需更少量的2’-羟基核苷酸，且有可能不含有2’-羟基核苷酸。
如下文所述，在上述最佳条件以外的情况下可以获得低量但仍然是有效产量的完全嵌入2’-氧—甲基取代核苷酸。例如，上述转录条件的变化包括HEPES缓冲液浓度范围在0-1M。本发明还计划使用pKa值在5-10的其它缓冲液，例如在未做限制的情况下使用三(羟甲基)胺甲烷。
DTT的浓度范围可以在0-400mM。本发明方法还提供了使用其它还原剂，例如在未做限制的情况下使用巯基乙醇。
亚精胺和/或精胺的浓度范围可以在0-20mM。
PEG-8000的浓度范围可以在0-50％(重量/体积)。本发明方法还提供了使用其它亲水性聚合物，例如在未做限制的情况下使用其它分子量的聚乙二醇或者其它聚亚烷基二醇。
Triton X-100的浓度范围可以在0-0.1％(重量/体积)。本发明方法还提供了使用其它非离子清洁剂，例如在未做限制的情况下使用其它清洁剂，包括其它Triton-X清洁剂。
二氯化镁浓度范围可以在0.5-50mM。二氯化锰浓度范围可以在0.15-15mM。二氯化镁和二氯化锰都必须符合上述范围，在优选实施方案中二氯化镁与二氯化锰的比率大约是10∶3，优选的比率是大约3-5，更优选的比率是大约3-4。
2’-氧—甲基三磷酸核苷浓度(每种三磷酸核苷)范围可以在5μM-5mM。
2’-羟基三磷酸鸟苷范围可以在0-300μM。
2’-羟基磷酸鸟苷范围可以在0-5mM。
PH值范围可以在6-9。在嵌入修饰核苷酸的大部分聚合酶具有活性的PH值范围内可以实施本发明方法。
此外，本发明方法提供了在转录反应条件下任选使用螯合剂，例如在未做限制的情况下使用EDTA、EGTA、DTT。
药用组合物本发明还包括含有文中所述适体分子的药用组合物。在一些实施方案中，该组合物适合体内应用，并且单独含有有效用量的本发明药理活性化合物，或者含有与一种或者多种药用可接受载体的组合。如果该化合物具有任何毒性，当特别应用时其含量很低。
本发明的组合物可以应用于治疗或者预防病状，例如疾病或者病症，或者减轻了患者此类疾病或者病症的症状。本发明的组合物可以用于给药患有疾病或者病症的病体、或者易受此疾病或者病症感染的病体，该疾病或者病症与适体特异性结合的靶有关，或者来源于与适体特异性结合的靶。
例如，上述的靶是涉及病理的蛋白，例如靶蛋白产生了病状。
本发明组合物可以用于治疗患有病状的病体。该方法涉及将含有与涉及病理靶(例如，蛋白)结合适体的组合物给药病体，以致该组合物与靶结合，从而改变靶的生理功能，由此治疗了病状。
患有病状的病体，例如由本发明方法治疗的病体可以是哺乳动物，或者更具体的是人类。
实际上，该化合物或者其药用可接受盐按照足以发挥其所预期生理活性的用量给药。
如对于口服片剂或胶囊(如凝胶胶囊)，药物的活性成分可与口服无毒性药物可接受惰性载体相结合，如乙醇，丙三醇，水等。并且，当需要时或必要时，适当的结合剂，润滑剂，崩解剂和着色剂也可加入到混合物中，适当的结合剂包括，淀粉，硅酸镁铝，淀粉糊，凝胶，甲基纤维素，羧基甲基纤维素钠和/或聚乙烯pyrrolidone，天然糖如葡萄糖或β乳糖，谷物甜味素，天然和合成的胶如，洋槐树胶，特拉加康斯树胶，或alginate钠，聚乙二醇，蜡等等。使用在这些剂型中的润滑剂包括，油酸钠，硬脂酸钠，硬脂酸镁，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，二氧化硅，滑石，硬脂酸，其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇等等。崩解剂不限于此地包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶淀粉与琼脂、褐藻酸、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、和/或甘氨酸，稀释剂包括，如乳糖，右旋糖，蔗糖，manntitol，sorbitol，纤维素和/或甘氨酸。
可注射组合物优选的是等渗水溶液或者悬浊液，栓剂优选由脂肪乳液或者悬液制备而成。该组合物可以经过稳定化处理，和/或含有辅助剂，例如防腐剂、湿润剂或者乳化剂、溶液助催化剂、调节渗透压力的盐和/或缓冲液。此外，该组合物还可以含有其它具有治疗价值的物质。分别按照常规混合、造粒、或者涂布方法制备组合物，并且该组合物含有大约0.1-75％的活性成分，优选的是大约1-50％。
本发明组合物还可以口服形式给药，采用随时间释放和持续释放的片剂或者胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、悬浮液、糖浆剂、乳浊液。
例如，通过溶解、分散等过程可以制备液体组合物、特别是可注射的组合物。将活性化合物溶解在药用纯溶剂中，或者与药用纯溶剂混合，例如水、盐水、水性葡萄糖、甘油、乙醇等，由此生成可注射的溶液或者悬液。此外，可以制备成适合在注射前溶解到液体中的固体形式。可注射的组合物优选的是等渗的水溶液或者悬液。该组合物可以经过稳定化处理，和/或含有辅助剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂或者乳化剂、溶液助催化剂、调节渗透压力的盐和/或缓冲液。此外，该组合物还可以含有其它具有治疗价值的物质。本发明的化合物可以静脉内(推注和输注)、腹膜内、皮下或者肌肉内形式给药，所有应用形式对于药学领域的普通技术人员众所周知。可以常规形式制备血管注射剂，可以是液体溶液或者悬液。
通常，非肠道注射给药用于皮下、肌肉内或者静脉内注射与输注。此外，根据美国专利3710795，一种非肠道给药的方法利用了缓慢释放或者持续释放系统的移植，该系统确保了维持药剂的恒定含量；上述专利的内容通过引述合并于此。
此外，通过局部使用适合鼻内的赋形剂，本发明优选的化合物可以采用鼻内线路给药；或者采用经皮线路，使用本领域普通技术人员公知的经皮皮肤贴形式给药。为了以经皮传输系统形式给药，在整个给药方案的过程中药剂给药理所应当是连续进行，而不是间断进行。其它优选的局部制剂包括乳膏、软膏、洗剂、喷雾剂、凝胶，其中活性成分的浓度范围在0.01-15％(重量/重量或者重量/体积)。
对于固态组合物，可以使用的赋形剂包括药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。上述的活性化合物还可以制备成栓剂，例如使用聚亚烷基二醇、例如丙二醇做为载体。在一些实施方案中，栓剂优选由脂肪乳液或者悬液制备而成。
本发明的化合物还能够以脂质体传输系统形式给药，例如小型单层泡囊、大型单层泡囊、多层泡囊。脂质体可以由多种磷脂构成，包括胆固醇、硬脂酰胺、或者磷酸卵磷脂。在一些实施方案中，如美国专利5,262,564所述，脂质成分的薄层与药物水溶液水合，形成包裹药物的脂质层。例如，采用与本领域公知方法制备的亲脂性化合物或者非致免疫的高分子量化合物结合的复合体，提供文中所述的适体分子。在美国专利6,011,020中提供了与核酸结合复合体的实例。
本发明化合物还可以与作为靶向药物载体的可溶性聚合物结合。这类聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟丙基—甲丙烯酰胺—苯酚、多羟乙基天冬酰胺苯酚、或者由棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外，本发明化合物还可以与控制药物释放的一类可生物降解聚合物结合，例如聚乳酸、聚E-己内酯、多羟丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二羟吡喃、聚氰丙烯酸酯、交联的水凝胶、或者中性成块的水凝胶共聚物。
如果需要，给药的药用组合物还可以含有少量的无毒辅助材料，例如湿润剂或者乳化剂、PH值缓冲剂，以及其它材料，例如乙酸钠、三乙醇胺、油酸等。
根据多种因素，选择使用本发明化合物的给药方案，其中包括病人的类型、人种、年龄、体重、性别和身体状况；待治疗病症的严重程度；给药线路；病人的肝肾功能；使用的特定化合物及其盐。普通的医生或者兽医可以很容易地确定或者诊断，阻止、阻遏、抑制病状发展所需药物的有效用量。
当达到明显效果时，本发明的口服药剂范围在0.05-1000毫克/天。优选的是，以含有0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0和1000.0毫克活性成分的带刻痕片剂形式，提供本发明的组合物。本发明化合物有效血液含量范围在0.002-50毫克/千克体重.天。
本发明化合物可以一天单次给药，或者一整天剂量可以分两次、三次或者四次给药。
文中所述的所有文献与专利文件通过在此引述合并于此，就好象每一个文献或者专利都单独具体地合并于此。对文献与专利文件的引用不视为与现有技术有关的任何认可，也不构成对相同内容与相同时间的认可。
本发明已经由书面说明的方式加以描述，本领域普通技术人员可以认定，本发明能够以各种实施方案加以实施，上文的说明与下文的实例目的在于说明，并非对后续的权利要求加以限制。
实施方案实施例1 2’-氧甲基SELEXTM对应凝血酶素和VEGF靶按照下文所述，合成大约3×1014个唯一转录模板库，其中每种模板含有30个邻接核苷酸的随机区域；然后，再PCR扩增。克隆并排序上述库显示，在上述库中随机区域的构成是大约25％的每种核苷酸。通过凝胶过滤与乙醇沉淀从未结合的脱氧三磷酸核苷提纯DNA库。接着，从含有四种2’-氧甲基三磷酸核苷的任一种500uM、30uM 2’-羟基三磷酸鸟苷的混合物(“r/mGmH”)制备修饰的转录产物。此外，从含有部分修饰的核苷酸和部分核糖核苷酸、或者全部核糖核苷酸的混合物制备修饰的转录产物，即含有全部2’-羟基核苷酸的混合物(rN)；含有2’-氧甲基C和U、和2’-羟基A和G的混合物(rRmY)；含有2’-氧甲基A、C和U、和2’-羟基G的混合物(rGmY)；交替含有2’-氧甲基A、C、U、G和2’-氧甲基A、U、C和2’-氟G的混合物(toggle)。然后，将这些修饰的转录产物应用到对应靶—例如血管内皮生长因子和凝血酶的SELEXTM方法中。
通常，经过凝胶提纯和脱氧核糖核酸酶处理后，将这些修饰的转录产物溶解到培养血管内皮生长因子的PBS溶液、和培养凝血酶的1倍ASB溶液(150mM氯化钾、20mM HEPES、10mM二氯化镁、1mM DTT、0.05％ Tween 20，PH7.4)中；然后，在疏水性多孔平板的空孔中培养1个小时，去除与塑料结合的序列。接着，将上清液转移到以前室温下在PBS溶液培养血管内皮生长因子1小时以及在ASBND溶液(150mM氯化钾、20mM HEPES、10mM二氯化镁、1mM DTT、0.05％ Tween 20，PH7.4)培养凝血酶1小时的孔中。经过1个小时培养后清洗孔，并且使用thermoscript反转录酶(Invitrogen)在65℃下原位反转录结合序列1小时。然后，PCR扩增所得的cDNA，再通过凝胶过滤从脱氧三磷酸核苷分离，从而产生进入下一循环筛选的修饰转录产物。在筛选与扩增的10次循环后，通过斑点印迹法分析所得库结合血管内皮生长因子或者凝血酶的能力。此时，克隆并排序库，然后，分析每个克隆结合血管内皮生长因子或者凝血酶的能力。利用序列与克隆结合数据的组合，识别序列的基序。
识别出一种血管内皮生长因子适体的基序，以ARC224表示，该基序通用于r/mGmH和toggle筛选，并且应用于设计经分析与血管内皮生长因子结合的更小型合成结构，从而使血管内皮生长因子适体最小化；ARC245和ARC259的长度都是23个核苷酸。还识别出另一个血管内皮生长因子适体的基序，以ARC226表示，该基序通用于2’-氧甲基筛选。由本发明方法制备的ARC224适体含有下列序列5′-mCmGmAmUmAmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmG mCmAmUmUmCmG-3T(序列NO.184)其中″m″代表2′-氧-甲基取代基。
ARC226适体含有下列序列5’-mGmAmUmCmAmUmGmCmAmUGmUmGmGmAmUmCmGmCmGmGmAmUmC-[3T]-3′(序列No.186)ARC245适体含有下列序列5′-mAmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmAmU-[3T]-3′(序列No.187)ARC259适体含有下列序列5′-mAmCmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmGMu-[3T]-3′(序列No.188)图3A是ARC224、ARC245和ARC259结合血管内皮生长因子的图形。这些适体的第二结构示意图显示在图3B中。
ARC224、ARC226和ARC245中所有残基都是2’-氧甲基，并且通过固相化学合成生成所有的结构(最初由SELEXTM法识别)。由PBS中使用斑点印迹法确定的适体KD值展示如下ARC224 3.9nM，ARC245 2.1nM，ARC259 1.4nM。
试剂除了另有说明外所有试剂来源于Sigma(St.Louis，MO)。
低核苷酸的合成按照标准方案，使用Expedite 8909 DNA合成仪(AppliedBiosystems，Foster City，CA)，进行DNA合成。在上述研究中使用的DNA库含有下述序列ARC2545′-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′(序列NO.1)，其中每个N对于四种核苷酸的每一种核苷酸具有相等的可能性。按照标准方案，使用3900 DNA合成仪(AppliedBiosystems，Foster City，CA)，进行2’-氧甲基RNA合成，其中包括含有2’-羟基核苷酸的RNA。通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳法提纯除PCR和RT引子外的所有低核苷酸。
2’-氧甲基库的生成在标准条件下使用下列引子，通过PCR扩增合成的DNA库(1.5毫摩)3′-引子5′-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCC-3′(序列NO454)和5′-primer 5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAAACGTTCTCG-3′(序列NO455)。沉淀所得的双链转录模板库，接着，利用凝胶过滤从未结合的核苷酸分离出来。毫无问题所得库可以经受热处理变性，或者暴露在低盐条件下变性。在下述制备第一循环筛选模板的条件下进行r/mGmH转录双链DNA模板200nM、HEPES200mM、DTT 40mM、TritonX-100 0.01％、亚精胺2mM、2’-氧—甲基ATP、CTP、GTP和UTP每种500uM、2’-羟基GTP 30uM、GMP 500uM、二氯化镁5.0mM、二氯化锰1.5mM、无机焦磷酸酶0.5单位每100uL反应物、Y639F/H784A T7 RNA聚合酶1.5单位每100uL PH值7.5的反应物、10％重量/体积PEG，然后在37℃下过夜培养。先采用变性的10％聚丙烯酰胺凝胶电泳法提纯所得的转录产物，然后，从凝胶中洗脱，接着，使用RQ1脱氧核糖核酸酶(Promega，Madison WI)培养，再使用苯酚提取，接着，使用氯仿提取，最后，在PBS中沉淀并获得产物。为了引发筛选，还可以通过直接化学合成2’-氧甲基RNA，生成转录产物，然后，采用变性的10％聚，丙烯酰胺凝胶电泳法提纯所得的转录产物，接着，从凝胶中洗脱，最后在PBS中获得产物。
对于rN、rRmY和rGmH转录，转录条件如下所述，其中1倍的Tc缓冲液是200mM HEPES，40mM DTT，2mM亚精胺，0.01％ TritonX-100，PH7.5。
当使用2’-羟基A、C、U和G(rN)条件时，转录反应条件是，二氯化镁25mM，每种三磷酸核苷5mM，1倍Tc缓冲液，10％重量/体积PEG，T7 RNA聚合酶1.5单位，和50-200nM的双链模板(200nM模板用于第1循环，以增加多样性；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)。
当使用2’-氧甲基C、U和2’-羟基A、G(rRmY)条件时，转录反应条件是，1倍Tc缓冲液，50-200nM的双链模板(200nM模板用于第1循环，以增加多样性；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)，5.0mM二氯化镁，1.5mM二氯化锰，0.5mM每种碱基，10％PEG-8000，0.25单位无机焦磷酸酶，1.5单位Y639F/H784A T7 RNA聚合酶。
当使用2’-氧甲基A、C、U和2’-羟基G(rGmH)条件时，转录反应条件是，在100uL体积中含有1倍Tc缓冲液，50-200nM的双链DNA模板(200nM模板用于第1循环，以增加多样性；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)，5.0mM二氯化镁，1.5mM二氯化锰，0.5mM每种碱基，10％PEG-8000，0.25单位无机焦磷酸酶，1.5单位Y639F单变异T7 RNA聚合酶。
当使用2’-氧甲基A、C、U和2’-氟G的条件时，除了使用0.5mM 2’-氟GTP替换2’-羟基GTP外，转录反应条件与rGmH相同。
反转录在SELEXTM过程中反转录条件如下所述(100uL反应物体积)1倍Thermo缓冲液(Invitrogen)，4uM引子，10mM DTT，0.2mM每种dNTP，200uM钒酸盐核苷酸抑制因子，10ug/mltRNA，Thermoscript反转录酶1.5单位(Invitrogen)。反转录酶反应产量比2’-氧甲基模板低。PCR反应条件如下所述1倍ThermoPol缓冲液(NEB)，0.5uM 5’引子，0.5uM 3’引子，0.2mM每种DHTP，嗜热水生菌DNA聚合酶5单位(NEB)。
2’-氧甲基SELEXTM方案如上所述，在总共10次筛选中使用5种转录产物，实施SELEXTM方法，使修饰的转录产物与两种靶(血管内皮生长因子和凝血酶)的任一种结合。五种转录产物是“rN”(所有的2’-羟基)、“rRmY”(2’-羟基A、G，2’-氧甲基C、U)、“rGmH”(2’-羟基G，2’-氧甲基C、U、A)、“r/mGmH”(2’-氧甲基A、U、G、C 500uM，2’-羟基G 30uM)、“toggle”(交替含有“r/mGmH”和2’-氧甲基A、U、C，2’-氟G)。
对应血管内皮生长因子的所有筛选都产生了血管内皮生长因子适体，而对应凝血酶的筛选只有rN和rRmY产生了凝血酶特异性适体。这些筛选中识别的适体序列展示在下文的表1-5(血管内皮生长因子)和表6-10(凝血酶)中。
除了来自第5次循环对应凝血酶的“rGmH”、“r/mGmH”和“toggle”、和来自第10次循环对应血管内皮生长因子的“r/mGmH”、以及来自第8次循环对应血管内皮生长因子的“toggle”外，所有序列都来自第11次循环。
筛选按照如下步骤进行先由“NUNC MAXY”板疏水吸收固定蛋白，然后，清洗掉未经固定的蛋白，接着，将2’-氧甲基取代的转录产物库与固定蛋白共同培养，清洗掉未经结合的转录产物，然后，在板上直接进行反转录反应，接着，再进行PCR扩增，随后，在适当的转录条件下转录所得的双链DNA模板。
在硅烷化孔中以不同浓度的蛋白培养示踪32P-主体—标记的转录产物进行结合测定，然后，将培养物通过夹有尼龙膜的多层硝基纤维素膜。蛋白结合的RNA显现在硝基纤维素膜上，未结合的RNA显现在尼龙膜上。随后，根据结合比率计算亲合性(参见图4、5、6)。例如，ARC224(全部2-氧甲基)各种2’-羟基G变异体的结合特性展示在图4中。“mGXG”命名表明，从5’末端按顺序计算在第“X”位置2’-羟基替换2’-氧甲基的取代。因此，mG7G ARC224是第7位置带有2’-羟基的ARC224。ARC225是在第7、10、14、16、19、22和24位置发生2’-氧甲基变为2’-羟基取代的ARC224。所有结构都是通过固相化学合成制备而成的(最初由SELEXTM识别)。在PBS中采用斑点印迹法，获得这些数据。与所研究的任何2’-羟基取代变异体相比，全2’-氧甲基适体、ARC224具有更优秀的结合血管内皮生长因子特性。
图5是ARC224和ARC225结合血管内皮生长因子的图示。此图示说明，ARC224以抑制血管内皮生长因子生理功能的方式与血管内皮生长因子结合。将125I-标记的血管内皮生长因子与适体共同培养，然后，将混合物与人脐带血管内皮细胞(HUVEC)共同培养。去除上清液，清洗细胞，在闪烁记数器中计数结合的血管内皮生长因子。ARC225具有与ARC224相同的序列，并且从5’末端计算在第7、10、14、16、19、22和24位置上2’-氧甲基变换成2’-羟基取代基。这些数据显示，ARC224的IC50是大约2nM。
图6是在含有或者不含有EDTA条件下、在自断裂之前和之后ARC224结合血管内皮生长因子的结合曲线图。图6显示了功能性适体的比率，以及在125℃峰值温度下在25分钟自断裂前、后与血管内皮生长因子结合的IC50。通过使用未经标记的ARC224，抑制在PBS溶液中5’-标记的ARC224与1nM血管内皮生长因子的结合，如PBS溶液中斑点印迹所测，确定这些数据。所有结构都是通过固相化学合成制备而成的(最初由SELEXTM识别)。在此测定范围内未发现ARC224的降解。
降解研究表明，在37℃血浆中培养4天导致微量的降解，以致不可能测出半衰期，起码至少超过4天(参见例如图7)。图7A和7B分别是，当在37℃鼠血浆中培养时ARC224和ARC226稳定性的图示。如图所示，在鼠血浆中培养4天后，ARC224和ARC226没有表现出可检测的降解。在这些实验中，在37℃鼠血浆中培养5’-标记的ARC224和ARC226，然后，采用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳法，进行分析。所有结构都是通过固相化学合成制备而成的(最初由SELEXTM识别)。半衰期表现为超过100个小时。
下文表1-10展现出，对应从各种库、即所述的rN、rRmY、rGmH、和r/mGmH离析出转录适体的适体DNA序列。在所示的DNA序列中，适体序列含有替代胸腺嘧啶核苷残基的尿苷残基。表11展示了由本发明方法获得的稳定适体序列。如文中所用，“3T”指的是在5’位置上附着低核苷酸磷酸二酯主链的转化胸腺嘧啶核苷，因此，所得含有两个5’-羟基末端的低核苷酸耐受3’核酸酶。
除非另做说明，各个表中所列的单个序列代表在特定SELEX条件下所筛选适体的cDNA克隆。本发明提供的真实适体是对应含有如文中所述rN、mN、rRmY、rGmH、r/mGmH、dRmY和toggle残基组合序列的适体。
2’-氧甲基SELEXTM的结果表1.-血管内皮生长因子适体序列—全2’-羟基(rN)的对应cDNAsSEQ ID No.3 ＞PB.97.126.F_43-H1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAAATGATGCATGTTCGTAAAATGGCAGTATTGGATCGTTACAACTAGCATCGATGSEQ ID No.4 ＞PB.97.126.F_43-A2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGCCGAGGTCCGGAACCTTGATGATTGGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.5 ＞PB.97.126.F_48-A1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCATTTGGGCTAGTTGTGAAATGGCAGTATTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.6 ＞PB.97.126.F_48-B1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAATCGTAGATAGTCGTGAAATGGCAGTATTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.7 ＞PB.97.126.F_48-C1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTTCTAGTCGGTACGATATGTTGACGAATCCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.8 ＞PB.97.126.F_48-D1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTTTGATGAGGCGGACATAATCCGTGCCGAGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.9 ＞PB.97.126.F_48-E1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAAGGAAAAGAGTTTAGTATTGGCCGTCCGTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.10 ＞PB.97.126.F_48-F1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGCCGAGGTCCGGAACCTTGATGATTGGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.11 ＞PB.97.126.F_48-G1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTACGGTCCATTGAGTTTGAGATGTCGCCATGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.12 ＞PB.97.126.F_48-B2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGTTAGTGGTAACTGATATGTTGAATTGTCCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.13 ＞PB.97.126.F_48-C2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCACGGATGGCGAGAACAGAGATTGCTAGGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.14 ＞PB.97.126.F_48-D2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGNTANCGNTNCGCCNTGCTAACGCNTANTTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.15 ＞PB.97.126.F_48-E2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAAGATGAGTTTTGTCGTGAAATGGCAGTATTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.16 ＞PB.97.126.F_48-F2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGATGCCGGATTGATTTCTGATGGGTACTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.17 ＞PB.97.126.F_48-G2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAATGGAATGCATGTCCATCGCTAGCATTTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.18 ＞PB.97.126.F_48-H2
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGCTGAGGTCCGGAACCTTGATGATTGGCGGGATCGTTNCNACTAGCATCGATGSEQ ID No.19 ＞PB.97.126.F_48-A3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCTAATTGCTGAGTCGTGAAGTGGCAGTATTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.20 ＞PB.97.126.F_48-B3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTAACGATGTCCGGGGCGAAAGGCTAGCATGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.21 ＞PB.97.126.F_48-C3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGATGCGATTGTCGAGATTTGTAAGATAGCTGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATG表2.-血管内皮生长因子适体序列-2’-羟基AG、2’-氧甲基CU(rRmY)的对应cDNAsSEQ ID No.22 ＞PB.97.126.G_43-D3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCAGAAAACATCTTTGCGGTTGAATACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.23 ＞PB.97.126.G_43-G3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAAAAAAGANANCNNCCTTCNGAATACATGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.24 ＞PB.97.126.G_48-E3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGAGTGATTCGATGCTTCANGAATACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.25 ＞PB.97.126.G_48-F3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGACANNNCNTNGCTNGGTTGANTACATGTGNNTNTCNNNANCNNTNNTCTNTNANAGGGGSEQ ID No.26 ＞PB.97.126.G_48-H3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAAGAAGGAAAGCTGCAAGTCGAATACACGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.27 ＞PB.97.126.G_48-A4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCAAAAACATCGATTACAGTTGAGTACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.28 ＞PB.97.126.G_48-B4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGACATCATTGCTCGTTGAATACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.29 ＞PB.97.126.G_48-C4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCCAAAGTAGCTTCGACAGTCGAATACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.30 ＞PB.97.126.G_48-D4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAAAATCAGTACTGTGCAGTCGAATACATGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.31 ＞PB.97.126.G_48-E4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTAATGACATCAATGCTTCTTGAATACAGGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.32 ＞PB.97.126.G_48-F4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGAAAAACGATCTGTGACGTGTAATCCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.33 ＞PB.97.126.G_48-G4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCAACAAACGTCGACGCTTCTGAATACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
SEQ ID No.34 ＞PB.97.126.G_48-H4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGATCATAGAAATGCTAGCTGAATACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.35 ＞PB.97.126.G_48-A5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCAGCGTAAAATGCTTTTCGAAGTACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.36 SEQ ID No. ＞PB.97.126.G_48-B5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCCAAGAATCAATCGCTTGTCGAATACATGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.37 ＞PB.97.126.G_48-C5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGATCATAGAAATGCTAGCTGAGTACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.38 ＞PB.97.126.G_48-D5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCAGAAAACATCTTTGCGGTTGAATACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.39 ＞PB.97.126.G_48-E5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGNAAACANNCATCTATTGNAGTTGAATACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.40 ＞PB.97.126.G_48-F5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCTAAAGATTCGCTGCTTGCCGAATACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATG表3.-血管内皮生长因子适体序列-2’-羟基G、2’-氧甲基CUA(rGmH)的对应cDNAsSEQ ID No.41 ＞PB.97.126.H_43-H6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGTTTTGTCTGCGTTTGTGCGTTGAACCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.42 ＞PB.97.126.H_43-F7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGATTACGTGATGAGGATCCGCGTTTTCTCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.43 ＞PB.97.126.H_43-H7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTTAGTGAAAACGATCATGCATGTGGATCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.44 ＞PB.97.126.H_48-H5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGTTCATTCGTTTGCTTATCGTTGCATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.45 ＞PB.97.126.H_48-A6AGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGCAGAGTGTGATGTGCATCCGCACGTGCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.46 ＞PB.97.126.H_48-B6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTTAGTAAATACGATCGTGCATGTGGATCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.47 ＞PB.97.126.H_48-C6GGGAGAGGAGAGAACGCCCCCCTGATTNCGTGAAGAGGATCCGCANTTTCNCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.48 ＞PB.97.126.H_48-D6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGGcTTTGGAACGGGTACGGATTTGGCACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.49 ＞PB.97.126.H_48-E6
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGATTACGTGATGAGGATCCGCGTTTTCTCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.50 ＞PB.97.126.H_48-F6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCATTGGTGACNGCGTTGCATGTGGATCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.51 ＞PB.97.126.H_48-G6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGNTGGTNNAANGCTTTTGTNGGGNTANNTGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.52 SEQ ID No. ＞PB.97.126.H_48-A7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGGCTTTGGAACGAATTCGGATTTGGCACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.53 ＞PB.97.126.H_48-B7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGCGATGTCGTGGATTTCCGTTTCGCAAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.54 ＞PB.97.126.H_48-C7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGAAGCAGATGTCGTTGGCGACTTAGAGGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.55 ＞PB.97.126.H_48-D7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGATTTCGTGATGAGGATCCGCGTTTTCTCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.56 ＞PB.97.126.H_48-E7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCTAGTAACGATGACTTGATGAGCATCCGAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.57 ＞PB.97.126.H_48-G7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCATAAGTAACGACGTTGCATGTGGATCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.58 ＞PB.97.126.H_48-A8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCAAGGAGATGGTTGCTAGCTGAGTACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
表4.-血管内皮生长因子适体序列-2’-氧甲基AUGC(r/mGmH，每个G具有90％可能性，含有与其结合的2’-氧甲基基团)的对应cDNAsGGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGATTACGTGATGAGGATCCGCGTTTTCTCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.50 ＞PB.97.126.H_48-F6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCATTGGTGACNGCGTTGCATGTGGATCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.51 ＞PB.97.126.H_48-G6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGNTGGTNNAANGCTTTTGTNGGGNTANNTGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.52 SEQ ID No. ＞PB.97.126.H_48-A7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGGCTTTGGAACGAATTCGGATTTGGCACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.53 ＞PB.97.126.H_48-B7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGCGATGTCGTGGATTTCCGTTTCGCAAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.54 ＞PB.97.126.H_48-C7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGAAGCAGATGTCGTTGGCGACTTAGAGGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.55 ＞PB.97.126.H_48-D7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGATTTCGTGATGAGGATCCGCGTTTTCTCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.56 ＞PB.97.126.H_48-E7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCTAGTAACGATGACTTGATGAGCATCCGAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.57 ＞PB.97.126.H_48-G7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCATAAGTAACGACGTTGCATGTGGATCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.58 ＞PB.97.126.H_48-A8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCAAGGAGATGGTTGCTAGCTGAGTACATGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGATAAGCAGTTGAGATGTCGCGCTTTGACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.65 ＞PB.97.126.I_48-H8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGATGANCANTTTGAGAAGTCGCGCTTGTCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.66 ＞PB.97.126.I_48-A9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGTAATGCAGTGGAAGTCGCGCATTACCTGGGATCGTTACGACTAGCATCATGSEQ ID No.67 ＞PB.97.126.I_48-B9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGATATGCAGTTTGAGAAGTCGCGCATTCGGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.68 ＞PB.97.126.I_48-C9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGATNCAGTTGANAAGTCNCGCATACAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.69 ＞PB.97.126.I_48-D9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGTAATGCTGTGGAAGTCGCGCATTTCCTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.70 ＞PB.97.126.I_48-D8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGCATTGCAGTTGATAGGTCGCGCAGTGCTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.71 ＞PB.97.126.I_48-F9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGATATGCAGTTTGGGAAGTCGCGCATTCGAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.72 ＞PB.97.126.I_48-G9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCNATATGCTGTTTGANAANTCGCGCATTCGGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.73 ＞PB.97.126.I_48-H9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGTAGATTGGGCTGAATGGGATATCTTTAGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.74 ＞PB.97.126.I_48-B10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGATATGCAGTTTGAGAAGTCGCGCTTTCGAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.75 ＞PB.97.126.I_48-D10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCAATCTGATGTAGCCTCACGTGGGCGGAGTCGGATCGTTACGACTAGCATCGATG表5.-血管内皮生长因子适体序列—交替含有“r/mGmH”和2’-氧甲基AUC、2’-氟G(toggle)的对应cDNAsSEQ ID No.76 ＞PB.97.126.J_48-F10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.77 ＞PB.97.126.J_48-G10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.78 ＞PB.97.126.J_48-H10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGTGGTGTTGCTGAACTGTCGCGTTTCGCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.79 ＞PB.97.126.J_48-A11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCGCGATTGCATATTTTCCGCCTTGCTGTGAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.80 ＞PB.97.126.J_48-B11
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGATTTGCAGTTTGAGATGTCGCGCATTCGAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.81 ＞PB.97.126.J_48-C11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGATATGCAGTTTGAGAAGTCGCGCATTCGGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.82 ＞PB.97.126.J_48-D11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTTGGTGCAGTTTGAGATGTCGCGCACCTTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.83 ＞PB.97.126.J_48-E11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGTATTGGTTCCATTAAGCTGGACACTCTGCTCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.84 ＞PB.97.126.J_48-F11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTTGGTGCAGTTTGAGATGTCGCGCGCCTTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.85 ＞PB.97.126.J_48-G11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGATATGCAGTTTGAGAAGTCGCGCATTCGAGGGATCGTTACNACTAGCATCGATGSEQ ID No.86 ＞PB.97.126.J_48-A12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGATATGCAGTTTGAGAAGTCGCGCATTCGGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.87 ＞PB.97.126.J_48-B12GGGAGAGGAGAGAACGCTCTCGGGGACNNAAANNCGAATTGNCGCGTGNGTCCGGGGGAGCGCCCGACTAGTCATCGATGSEQ ID No.88 ＞PB.97.126.J_48-C12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGATATGNANTTTGAGAAGTCGCGCATTCGGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.89 ＞PB.97.126.J_48-D12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGTGTACAGCTTGAGATGTCGCGTACTCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.90 ＞PB.97.126.J_48-E12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGATATGCAGTTTGAGAAGTCGCGCATTCGGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.91 ＞PB.97.126.J_48-F12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGTAAGAAAGCTGAATGGTCGCACTTCTCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.92 ＞PB.97.126.J_48-G12AGGGAGAGGAAGAACGTTCTCGCGATGTGCAGTTTGAGAAGTCGCGCATTCGAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.93 ＞PB.97.126.J_48-H12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAAAGAATCAGCATGCGGATCGCGGCTTTCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATG表6.-凝血酶适体序列—全部的2’-羟基(rN)的对应cDNAsSEQ ID No.94 ＞PB.97.126.A_44-A1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGANTCCANTNTNCNTGGAGGAGTAAGTACCTGAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.95＞PB.97.126.A_44-B1
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGAAACAAGGAACTTAGAGTTANTTGACCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.96 ＞PB.97.126.A_44-C1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTACCATGCAAGGAACATAATAGTTAGCGTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.97 ＞PB.97.126.A_44-D1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGACACAAGGAACACAATAGTTAGTGTACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.98 ＞PB.97.126.A_44-E1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCTGCAAGGAACACAATAGTTAGCATTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.99 ＞PB.97.126.A_44-F1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGCCAACAAAGCTGGAGTACTTAGAGCGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.100 ＞PB.97.126.A_44-G1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGATTGCAAAATAGCTGTAGAACTAAGCAATCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.101 ＞PB.97.126.A_44-H1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGAGATGACTATGTTAAGATGACGCTGTTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.102 ＞PB.97.126.A_44-A2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGANACAAGGAACNCAATATTTAGTGAACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.103 ＞PB.97.126.A_44-B2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCCAAGGAACACAATAGTTAGGTGAGAATCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.104 ＞PB.97.126.A_44-C2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGTACAAGGAACACAATAGTTAGTGCCGTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.105 ＞PB.97.126.A_44-D2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGATTCAACGGTCCAAAAAAGCTGTAGTACTTAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.106 ＞PB.97.126.A_44-E2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCAATGCAAGGAACACAATAGTTAGCAGCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.107 ＞PB.97.126.A_44-F2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAAAGGAGAAAGCTGAAGTACTTACTATGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.108 ＞PB.97.126.A_44-G2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCACAAGGAACACAATAGTTAGTGCAAGACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.109 ＞PB.97.126.A_44-A3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCACAAGGAACTACGAGTTAGTGTGGGAGTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.110 ＞PB.97.126.A_44-B3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCACAAGGAACACAATAGTTAGTGCAAGACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATASEQ ID No.111 ＞PB.97.126.A_44-C3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGCGGGAAAATAGCTGTAGTACTAACCCACGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
表7.-凝血酶适体序列-2’-羟基AG、2’-氧甲基CU(rRmY)的对应cDNAsSEQ ID No.112 ＞PB.97.126.B_44-E3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGCCTCAAGGAAAAGAAAATTTAGAGGCCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.113 ＞PB.97.126.B_44-F3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACAAGATAGCTGAAGGACTAAGTTTACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.114 ＞PB.97.126.B_44-G3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACAAGATAGCTGAAGGACTAAGTTTACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.115 ＞PB.97.126.B_44-H3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAGCCAAGGAAACGAAGATTTAGGCTCATTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.116 ＞PB.97.126.B_44-A4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGATCACAAGAAATGTGGGANGGTAGTGATNCNNNTCGTTNCGACTAGCATCGATGSEQ ID No.117 ＞PB.97.126.B_44-B4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCGAAAGGGAGCTTTGTCTCGGGACAGAACGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.118 ＞PB.97.126.B_44-C4GGGAGAGGAGAGAACGNTCTCGTGCAAAGATAGCTGGAGGACTAATGCGGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.119 ＞PB.97.126.B_44-D4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCGAAAGGGAGCTTTGTCTCGGGACAGAACGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.120 ＞PB.97.126.B_44-E4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGNCNAAGGNGAGCTTTGTCCCNGGACANAANGNATCGTTACAACTAGCATCGATGSEQ ID No.121 ＞PB.97.126.B_44-F4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACAAGATAGCTGAAGGACTAAGTTTACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.122 ＞PB.97.126.B_44-G4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACAAGATAGCTGAAGGACTAAGTTTACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.123 ＞PB.97.126.B_44-H4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGCGCAAAAAAAGCTGGAGTACTTAGTGTCGAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.124 ＞PB.97.126.B_44-A5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCGAAAGGGAGCTTTGTCTCGGGACAGAACGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.125 ＞PB.97.126.B_44-B5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGACACAAGAAAGCTGCAGAACTTAGGGTCGTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.126 ＞PB.97.126.B_44-C5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACNGGATTGTTGAAGGACTAANTTTACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.127 ＞PB.97.126.B_44-D5
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGCCTCAAGGGAAAGAAAATTTAGAGGCCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.128 ＞PB.97.126.B_44-E5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAAACAAGCTTAGAAATTCGCACCCTTGCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.129 ＞PB.97.126.B_44-F5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAAAGAAAAAAGCTGGAGAACTTACTTCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.130 ＞PB.97.126.B_44-G5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGTGATTGTACTCACATAGAAATGGCAACACTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATG表8.-凝血酶适体序列-2’-羟基G、2’-氧甲基CUA(rGmH)的对应cDNAsSEQ ID No.131 ＞PB.97.126.C_44-H5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGTTCAAGGAACATGATAGTTAGAACCCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.132 ＞PB.97.126.C_44-A6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTTCCGAAAGGAACACAATAGTTATCGGATTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.133 ＞PB.97.126.C_44-B6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCTGCAAGGAACACAATAGTTAGCATTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.134 ＞PB.97.126.C_44-C6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGTACAAGGAACACAATAGTTAGTGCCGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.135 ＞PB.97.126.C_44-D6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACTCAGAGATCCTATGTGGACCAGAGAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.136 ＞PB.97.126.C_44-E6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCTGAGCAAGGAACGTAATAGTTAGCCTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.137 ＞PB.97.126.C_44-F6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGNANNNATAAATGATGGATCNCTTATTGTNNAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.138 ＞PB.97.126.C_44-G6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGCTTGGAAAAATAGCTTTTGGGCATCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.139 ＞PB.97.126.C_44-H6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGTTCAAGGAACATGATAGCTAGAACCCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.140 ＞PB.97.126.C_44-A7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGTTCAAGGAACATGATAGTTAGAACCCGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.141 ＞PB.97.126.C_44-B7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGGGCAGGGAACACAATAGTTAGCCTACGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.142 ＞PB.97.126.C_44-C7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGTGAAAGGAACACAATAGTTATCGTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.143 ＞PB.97.126.C_44-D7
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGAGGTTTATCCTAGACGACTAACCGCCTGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.144 ＞PB.97.126.C_44-F7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCTGCTAGGAACACAATAGTTAGCATTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.145 ＞PB.97.126.C_44-G7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCACAAGGAACTACGAGTTAGTGTGGGAGTGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.146 ＞PB.97.126.C_44-H7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGACACGAGGAACTTAGAGTTAGTAGCACGAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.147 ＞PB.97.126.C_44-A8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGCGGCGAAGGAACACAATAGTTACGTCCCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.148 ＞PB.97.126.C_44-B8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGCCCAAAAAAGCTGAAGTACTTTGGGCAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATG表9.-凝血酶适体序列-2’-氧甲基AUGC(r/mGmH，每个G具有90％可能性，含有与其结合的2’-氧甲基基团)的对应cDNAsSEQ ID No.149 ＞PB.97.126.D_44-D8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGTACAAGGAACACAATAGTTAGTGCCGTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.150 ＞PB.97.126.D_44-E8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.151 ＞PB.97.126.D_44-G8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGCGCAAGGAACACAATAGTTAGGGCGCGAGGATCGTTACGACTAGCATTGATGSEQ ID No.152 ＞PB.97.126.D_44-H8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAATGGAAGGAACACAATAGTTACCAGACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.153 ＞PB.97.126.D_44-A9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCTGCAAGGAACACAATAGTTAGCATTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.154 ＞PB.97.126.D_44-B9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGACAAGACAGCTGGAGGACTAAGTCACGAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.155 ＞PB.97.126.D_44-C9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGATGCCCGCAAAGGAACACGATAGTTATGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.156 ＞PB.97.126.D_44-D9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCTGNNAGGAACACAATATTTAGCATTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.157 ＞PB.97.126.D_44-E9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAATGTGCGGAGCAGTATTGGTACACTTTCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.158 ＞PB.97.126.D_44-F9
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCCAAGGAACACAATAGTTAGGT GAGAATCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.159 ＞PB.97.126.D_44-G9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCCAAGGAACACAATAGTTAGGTGAGAATCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.160 ＞PB.97.126.D_44-H9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGAAGCAAGGAACTTAGAGTTAGTTGACCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.161 ＞PB.97.126.D_44-A10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTGGGCAAGGAACACAATAGTTAGCCTACGCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.162 ＞PB.97.126.D_44-B10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCGGGCATGGAACACAATAGTTAGACCGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.163 ＞PB.97.126.D_44-C10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGTCGCAAGGAACATAATAGTTAGCGGAGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.164 ＞PB.97.126.D_44-D10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCTGCAAGGAACACAATAGTTAGCATTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.165 ＞PB.97.126.D_44-E10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCCGACAATCAGCTCGGATCGTGTGCTACGCTGGATCGTTACGACTAGCATCGATG表10.-凝血酶适体序列—交替含有“r/mGmH”和2’-氧甲基AUC、2’-氟G(toggle)的对应cDNAsSEQ ID No.166 ＞PB.97.126.E_44-F10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGAGACAAGATAGCTGAAGGACTAAGTCACGAGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.167 ＞PB.97.126.E_44-G10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACAAGATAGCTGAAGGACTAAGTTTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.168 ＞PB.97.126.E_44-H10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAGNCAAGGAAACNAATATTTAGGCTCANTGGNNNCNTTNCANCTAGCNNCNNTASEQ ID No.169 ＞PB.97.126.E_44-A11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCTGCAAGGAACACAATAGTTAGCATTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.170＞PB.97.126.E_44-B11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACAAGATAGCTGAAGGACTAAGTTTACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.171 ＞PB.97.126.E_44-C11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.172 ＞PB.97.126.E_44-D11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGTGATAGTACTCACATAGAAATGGCTACACTGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.173 ＞PB.97.126.E_44-E11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCCTGGGCAAGGAACAGAAAAGTTAGCGCCAGGATCGTTACGACTAGCATCGATG
SEQ ID No.174 ＞PB.97.126.E_44-F11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTAACGGACAAAAGGAACCGGGAAGTTATCTGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.175 ＞PB.97.126.E_44-G11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGCACAAGATAGAGAAGACTAAGTCCGCGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.176 ＞PB.97.126.E_44-H11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGCACAAGATAGAGAAGACTAAGTTCGCGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.177 ＞PB.97.126.E_44-A12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCGCCAATAAAGCTGGAGTACTTAGAGCGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.178 ＞PB.97.126.E_44-B12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGGAAACAAGGAACTTAGAGTTAGTTGACCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.179 ＞PB.97.126.E_44-C12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGCTAGCAAGATAGGTGGGACTAAGCTAGTGAGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.180 ＞PB.97.126.E_44-D12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGTCGAAGGGGAGCTTTGTCTCGGGACAGAACGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.181 ＞PB.97.126.E_44-E12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACAAGATAGCTGAAGGACTAAGTTTACGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.182 ＞PB.97.126.E_44-G12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTCGGAACAAGATAGCTGAAGGACTAAGTTTGCGGGATCGTTACGACTAGCATCGATGSEQ ID No.183 ＞PB.97.126.E_44-H12GGGAGAGGAGANNTCCCCNCNCGGAAAAANAAAAAAGAAGAANTANGTTNGGGGGATCGTTACGACTAGCATCGATG表11-稳定的适体序列(每个G具有90％被2’-氧甲基基团取代的可能性，“3T”指的是在5’位置上附着磷酸二酯主链的转化胸腺嘧啶核苷，因此，所得含有两个5’-羟基末端的低核苷酸耐受3’核酸酶)。
SEQ ID No.184 ARC224-Stabilized VEGF Aptamer5′mCmGmAmUmAmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmAmUmUmCmG-3TSEQ ID No.185 ARC225-Stabilized VEGF Aptamer5′mCmGmAmUmAmUGmCmAGmUmUmUGmAGmAmAGmUmCGmCGmCmAmUmUmCmG-3TSEQ ID No.186 ARC226 Single-hydroxy VEGF aptamer5′mGmAmUmCmAmUmGmCmAmUGmUmGmGmAmUmCmGmCmGmGmAmUmC-3TSEQ ID No.187 ARC245 VEGF Aptamer5′mAmUmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmAmU-3TSEQ ID No，188 ARC259 hVEGF Aptamer-C-G base pair swap of ARC245(2ndbase pair in)which has improved binding over ARC245.
5′mAmCmGmCmAmGmUmUmUmGmAmGmAmAmGmUmCmGmCmGmCmGmU-3′
实施例2 2’-氧甲基SELEXTM在各种转录条件下使用转录模板库，生成含有2’-氧—甲基三磷酸核苷的RNA低核苷酸。对于rRmY(序列No456)、rGmH(序列No462)、r/mGmH(序列No463)、和dRmY(序列No464)，转录模板(ARC256)和转录条件如下文所述。非修饰的RNA转录产物由序列No468表示。
ARC256DNA转录模板5’-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’(序列No453)ARC256RNA转录产物是5′-GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG-3′(序列NO468)如下文所示转录条件各不相同，其中1倍Tc缓冲液是200mMHEPES、40mM DTT、2mM亚精胺、0.01％ Triton X-100，PH7.5。
当使用2’-氧甲基C、U和2’-羟基A、G(rRmY)条件时，转录反应条件是1倍Tc缓冲液、50-200nM双链模板(200nM模板用于第1循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)，9.6mM二氯化镁，2.9mM二氯化锰，2mM每种碱基，10％PEG-8000，0.25单位无机焦磷酸酶，1.5单位Y639F/H784A T7 RNA聚合酶。一个单位的Y639F/H794A T7 RNA聚合酶定义为，在r/mGmH条件下将1毫摩尔2’-氧甲基三磷酸核苷嵌入转录产物所需的酶用量。1单位无机焦磷酸酶定义为，在PH7.2和25℃下每分钟释放1摩尔无机正磷酸所需的酶用量。
当使用2’-氧甲基A、C、U和2’-羟基G(rGmH)条件时，转录反应条件是1倍Tc缓冲液、50-200nM双链DNA模板(200nM模板用于第1循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)，9.6mM二氯化镁，2.9mM二氯化锰，2mM每种碱基，10％PEG-8000，0.25单位无机焦磷酸酶，1.5单位Y639F单变异T7 RNA聚合酶。一个单位的Y639F变异T7 RNA聚合酶定义为，在r/mGmH条件下将1毫摩尔2’-氧甲基三磷酸核苷嵌入转录产物所需的酶用量。
当使用全2’-氧甲基核苷酸(r/mGmH)条件时，转录反应条件是1倍Tc缓冲液、50-200nM双链模板(200nM模板用于第1次循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)，6.5mM二氯化镁，2mM二氯化锰，30uM GTP，1mM GMP，10％PEG-8000，0.25单位无机焦磷酸酶，1.5单位Y639F/H784A T7 RNA聚合酶。
当使用脱氧嘌呤、A和G和2’-氧甲基嘧啶(dRmY)条件时，转录反应条件是1倍Tc缓冲液、50-300nM双链模板(300nM模板用于第1次循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)，9.6mM二氯化镁，2.9mM二氯化锰，每种碱基2mM，30uM GTP，2mM精胺，10％PEG-8000，0.25单位无机焦磷酸酶，1.5单位Y639F单变异RNA聚合酶。
在SELEXTM方法中使用上述库，对应下述靶筛选适体免疫球蛋白E、IL-23、PDGF-BB、凝血酶、血管内皮生长因子。与靶IL-23结合的dRmY第6、7、8循环与未经筛选序列的图形展示在
图14中，与靶PDGF-BB结合的dRmY第6、7循环与未经筛选序列的图形也展示在
图14中。
实施例3 对应免疫球蛋白E的dRmY SELEXTM适体由于全部由2’-氧甲基取代的低核苷酸是最稳定的修饰适体，因此，由脱氧嘌呤取代嘌呤的核苷酸也就产生了稳定的转录产物。当使用dRmY(脱氧嘌呤A和G，和2’-氧甲基嘧啶)转录条件时，所得的产物具有抗脱氧核糖核酸酶特性，并且用做稳定的治疗剂。由于dRmY转录组合物含有大约50％DNA，众所周知地易受到脱氧核糖核酸酶的降解，因此上述结果是令人吃惊的。此外，当使用dRmY转录条件时，不需要嵌入2’-羟基GTP。研究表明，产生了产量大致相同的掺杂2’-羟基GTP与不带有2’-羟基GTP的修饰核苷酸dRmY转录产物。相应地，在dRmY转录条件下，任选搀杂2’-羟基GTP。在各种转录条件下使用转录模板库，生成嵌入2’-氧甲基嘧啶三磷酸核苷(U和C)和脱氧嘌呤(A和G)三磷酸核苷的低核苷酸库。转录模板(ARC256)和转录条件如下文对dRmY所述。
ARC256DNA转录模板5′-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′(序列NO453)ARC256 dRmY RNA转录产物5′-GGGAGAGGAGAGAACGWCUACMNNNNNNNCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG-3′(序列NO464)
当使用脱氧嘌呤A和G和2’-氧甲基嘧啶(dRmY)条件时，转录反应条件是1倍Tc缓冲液、50-300nM双链模板(300nM模板用于第1次循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)，9.6mM二氯化镁，2.9mM二氯化锰，每种碱基2mM，30uM GTP，2mM精胺，10％PEG-8000，0.25单位无机焦磷酸酶，1.5单位Y639F单变异RNA聚合酶。
然后，在SELEXTM方法中使用上述库，以免疫球蛋白E做为靶筛选适体。如上所述在SELEXTM方法中第6次循环后获得的序列汇集在下文表12中。在图8中展示了与浓度递增靶免疫球蛋白E结合的第6次循环序列图形。
表12-以免疫球蛋白E做靶、dRmY SELEXTM第6次循环序列的对应cDNAsSEQ ID No.190 IgE A5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGCAGTTCTGGGGACCCATGGGGGAAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.191 IgE A6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATTAGCAGGGAGGGAGAGTGCGAAGAGGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.192 IgE A7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACACTCTGGGGACCCGTGGGGGAGTGCAGCAACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.193 IgE A8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAGCAGTTCTGGGGACCCATGGGGGAAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.194 IgE B5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAGGTGAGGGTCTACAATGGAGGGATGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGGATG
SEQ ID No.195 IgE B6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCCGCAGCATAGCCTGNGGACCCATGNGGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.196 IgE B7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGGGGGGCGTGTTCATTAGCAGCGTCGTGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.197 IgE B8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGCAGTTCTGGGGACCCATGGGGGAAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.198 IgE C5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGCAGCGCATCTGGGGACCCAAGAGGGGATTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.199 IgE C6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGCAGTTCTGGGGACCCATGGGGGAAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.200 IgE C7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGATGGGTAGTTGGATGGAAATGGGAACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.201 IgE C8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAGGTGTAGGGATAGAGGGGTGTAGGTAACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.202 IgE D5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGAGTGGAGCTACAGAGAGGGTTAGGGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.203 IgE D6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGATGTTGGGAGTGATAGAAGGAAGGGGAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.204 IgE D7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGCAGTTCTGGGGACCCATGGGGGAAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.205 IgE D8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGCAGTTCTGGGGACCCATGGGGGAAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.206 IgE E5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGCAGTTCTGGGGACCCATGGGGGAAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.207 IgE E6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTGGGGTGGAAGGAGTAAGGGAGGTGCTGATCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.208 IgE E7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTATTAGGGGGGAAGGGGAGGAATAGATCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.209 IgE E8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGGAGAGAGTGTTGAGTGAAGAGGAGGAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.210 IgE F5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATTGTGCTCCTGGGGCCCAGTGGGGAGCCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.211 IgE F6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAGCAGCCCTGGGGCCCGGAGGGGGATGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.212 IgE F7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGCAGTTCTGGGGACCCATGGGGGAAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.213 IgE F8
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCAACGGCATCCTGGGCCCCACAGGGGATGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.214 IgE G5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAGTGGATAGGGAAGAAGGGGAGTAGTCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.215 IgE G6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCCGCAGCATAGCCTGGGGACCCATGGGGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.216 IgE G7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGTCGCGTGTGGGGGACGGATGGGTATTGGTCGCTGTCNATCGATCGATCNATGSEQ ID No.217 IgE G8GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCCGCAGCATAGCCTGGGGACCCATGGGGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.218 IgE H5GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCCGCAGCATAGCCTGGGGACCCATGGGGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.219 IgE H6GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGGTTACGTCGCACGATACATGCATTCATCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.220 IgE H7GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTAGCGAGGAGGGGTTTTCTATTTTTGCGATCGCTGTCGATCGATCGATCGATG实施例4 对应凝血酶的dRmY SELEXTM适体由于全部由2’-氧甲基取代的低核苷酸是最稳定的修饰适体，因此，由脱氧嘌呤取代嘌呤的核苷酸也就产生了稳定的转录产物。当使用dRmY(脱氧嘌呤A和G，和2’-氧甲基嘧啶)转录条件时，所得的产物具有抗脱氧核糖核酸酶特性，并且用做稳定的治疗剂。由于dRmY转录组合物含有大约50％DNA，众所周知地易受到脱氧核糖核酸酶的降解，因此上述结果是令人吃惊的。此外，当使用dRmY转录条件时，不需要嵌入2’-羟基GTP。在各种转录条件下使用转录模板库，生成嵌入2’-氧甲基嘧啶三磷酸核苷(U和C)和脱氧嘌呤(A和G)三磷酸核苷的低核苷酸库。转录模板(ARC256)和转录条件如下文对dRmY所述。
ARC256DNA转录模板5′-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′
(序列NO453)ARC256 dRmY RNA转录产物5′-GGGAGAGGAGAGAACGWCUACMNNNNNNNCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG-3′(序列NO464)当使用脱氧嘌呤A和G和2’-氧甲基嘧啶(dRmY)条件时，转录反应条件是1倍Tc缓冲液、50-300nM双链模板(300nM模板用于第1次循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)，9.6mM二氯化镁，2.9mM二氯化锰，每种碱基2mM，30uM GTP，2mM精胺，10％PEG-8000，0.25单位无机焦磷酸酶，1.5单位Y639F单变异RNA聚合酶。
然后，在SELEXTM方法中使用上述库，以凝血酶做为靶筛选适体。如上所述在SELEXTM方法中第6次循环后获得的序列汇集在下文表13中。在图9中展示了与靶凝血酶结合的第6次循环序列图形。
表13-以凝血酶做靶、dRmY SELEXTM第6次循环序列的对应cDNAsSEQ ID No.221 Thrombin A1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTGTGATGGGGTGAGAGGATGAGTTAGTGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.222 Thrombin A2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAATGGGAGGGTAATAGTGATGAGGAGAGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.223 Thrombin A3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.224 Thrombin A4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.225 Thrombin B1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGTAGCGTGAGGGGGTGTTAATAGAGGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.226 Thrombin B2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATAGGATGGGTGGGACAGGAGAGGGAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.227 Thrombin B3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCAGTGAGGGCAGTGTCAGATTGAGAGGAGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.228 Thrombin B4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTTGCCTAACAGGAGGTGGAGTATTGGACCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.229 Thrombin C1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTTGCCTAACAGGAGGTGGAGTATTGGACCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.230 Thrombin C2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTCGTGAGTAATGGCTCGTAGATGAGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATG
SEQ ID No.231 Thrombin C3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGATTAAGAGGGGAGAGGAGCAGTTGAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.232 Thrombin C4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTCCGGTTGGGGTATCAGGTCTACGGACTGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.233 Thrombin D1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.234 Thrombin D2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.235 Thrombin D3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATGACAAGAGGGGGTTGTGTGGGATGGCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.236 Thrombin D4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACACAGGGAGGGGAGCGGAGAGGAGAGAGGGTACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.237 Thrombin E1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.238 Thrombin E2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTCGTGAGTAATGGCTCGTAGATGAGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.239 Thrombin E4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.240 Thrombin F1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.241 Thrombin F2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTTGCCTAACAGGAGGTGGAGTATTGGACCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.242 Thrombin F3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGCTATGCGTCGTGAGTCAATGGCCCGCATCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.243 Thrombin F4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAGTGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.244 Thrombin G1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.245 Thrombin G2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.246 Thrombin G3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTTGTCTAACAGGAGGTGGAGTATTGGACCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.247 Thrombin G4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGACTTTGAGGGTGGTGAGAGTGGAAGAGAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.248 Thrombin H1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGTAGGGTATGACCAGGGAGGTATTGGAGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATG
SEQ ID No.249 Thrombin H2GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.250 Thrombin H3GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCGTGAGATAATGGCTCCCGTATTCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.251 Thrombin H4GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTTATGCATGTGGAGAGTGAGAGAGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATG实施例5 对应血管内皮生长因子的dRmY SELEXTM适体由于全部由2’-氧甲基取代的低核苷酸是最稳定的修饰适体，因此，由脱氧嘌呤取代嘌呤的核苷酸也就产生了稳定的转录产物。当使用dRmY(脱氧嘌呤A和G，和2’-氧甲基嘧啶)转录条件时，所得的产物具有抗脱氧核糖核酸酶特性，并且用做稳定的治疗剂。由于dRmY转录组合物含有大约50％DNA，众所周知地易受到脱氧核糖核酸酶的降解，因此上述结果是令人吃惊的。此外，当使用dRmY转录条件时，不需要嵌入2’-羟基GTP。在各种转录条件下使用转录模板库，生成嵌入2’-氧甲基嘧啶三磷酸核苷(U和C)和脱氧嘌呤(A和G)三磷酸核苷的低核苷酸库。转录模板(ARC256)和转录条件如下文对dRmY所述。
ARC256DNA转录模板5′-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′(序列NO453)ARC256 dRmY RNA转录产物5′-GGGAGAGGAGAGAACGWCUACMNNNNNNNCGCUGUCGAUCGAUCGAUCGAUG-3′(序列NO464)
当使用脱氧嘌呤A和G和2’-氧甲基嘧啶(dRmY)条件时，转录反应条件是1倍Tc缓冲液、50-300nM双链模板(300nM模板用于第1次循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)，9.6mM二氯化镁，2.9mM二氯化锰，每种碱基2mM，30uM GTP，2mM精胺，10％PEG-8000，0.25单位无机焦磷酸酶，1.5单位Y639F单变异RNA聚合酶。
然后，在SELEXTM方法中使用上述库，以血管内皮生长因子做为靶筛选适体。如上所述在SELEXTM方法中第6次循环后获得的序列汇集在下文表14中。在
图10中展示了与靶血管内皮生长因子结合的第6次循环序列图形。
表14-以血管内皮生长因子做靶、dRmY SELEXTM第6次循环序列的对应cDNAsSEQ ID No.252 VEGF A9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCATGTCTGCGGGAGGTGAGTAGTGATCCTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.253 VEGF A10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGAGTGGGAGGGATGTGTGACACAGGTAGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.254 VEGF A11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGCTCCATGACAGTGAGGTGAGTAGTGATCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.255 VEGF A12GGGAGAGGAGAGAACGTTCT CGATGCTGACAGGGTGTGTTCAGTAATGGCTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.256 VEGF B9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCAGCAAACAGGGTCAGGTGAGTAGTGATGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.257 VEGF B10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGACAAGCCGGGGGTGTTCAGTAGTGGCAACCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.258 VEGF B11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATATGGCGCTGGAGGTGAGTAATGATCGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.259 VEGF B12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGGCGATAGCGTTCAGTAGTGGCGCCGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.260 VEGF C9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATAGCGGACTGGGTGCATGGAGCGGCGCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.261 VEGF C10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGGTCAACAGGGGCGTTCAGTAGTGGCGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.262 VEGF C11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGCATGCGAGCTGAGGTGAGTAGTGATCAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.263 VEGF C12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATGCGACAGGGGAGTGTTCAGTAGTGGCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.264 VEGF D9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCCCATCGTATGGAGTGCGGAACGGGGCATACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.265 VEGF D10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGTGAGGCGGGAGCGTTTCAGTAATGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.266 VEGF D12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACACAGCGTCGGGTGTTCAGTAATGGCGCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATG
SEQ ID No.267 VEGF E9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGTGTTCAGTAGTGGCACAGGAGGAAGGGATGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.268 VEGF E10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGTTCAGGCGTTAGGCATGGGTGTCGCTTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.269 VEGF E11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATGCGACATGCGAGTGTTCAGTAGCGGCAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.270 VEGF E12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTATGGCGTTACAGCGAGGTGAGTAGTGATCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.271 VEGF F9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCAGCCGATCCAGCCAGGCGTTCAGTAGTGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.272 VEGF F10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGCACAGGCACGGCGAGGTGAGTAATGATCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.273 VEGF G9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGTGGACAGCGGGAGTGCGGAACGGGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.274 VEGF G10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGATGCTGCGAGTGCATGGGGCAGGCGCTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.275 VEGF G11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGTACAATGGGAATGACAGTGATGGGTAGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.276 VEGF G12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATGGACAGCGAAGCATGGGGGAGGCGCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.277 VEGF H9GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGGGAGCGACAGTGAGCATGGGGTAGGCGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.278 VEGF H11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCGGCGAGCAGGTGTTCAGTAGTGGCTTTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGSEQ ID No.279 VEGF H12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATCAGTGAGGGAGTGCAGTAGTGGCTCGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATG实施例62’-氧甲基三磷酸核苷(mN)和dRmY低核苷酸的血液稳定性采用两种方案合成由聚乙二醇共聚物(PEG)连接的两种序列低核苷酸(1)带有全2’-氧甲基三磷酸核苷(mN)5′-GGAGCAGCACC-3′(序列NO457-[PEG]-GGUGCCAAGUCGUUGC
UCC-3′(序列N0458)和(2)带有2′-羟基嘌呤和2′-氧甲基嘧啶(dRmY)GGAGCAGCACC-3′(序列NO465)-[PEG]-GGUGCCAAGUCGUUGCUCC-3′(序列NO466)。评价上述低核苷酸的全长稳定性。
图11A展示了带有3’idT全2’-氧甲基低核苷酸的降解图，
图11B展示了dRmY低核苷酸的降解图。在37℃下50nM 95％鼠血浆中培养低核苷酸，每种低核苷酸都表现出超过48小时的血浆半衰期，因此，具有非常相似的血液稳定特性。
实施例7以人类IL-23为靶的rRmY和rGmH 2’-氧甲基SELEXTM进行筛选，识别含有2’-氧甲基C、U和2’-羟基G、A(rRmY)、2’-氧甲基A、C、U和2’-羟基G(rGmH)的适体。所有筛选是以固定在疏水板上的人类IL-23蛋白为靶的直接筛选。与首次用于实验未经筛选的库相比，筛选产生了明显富含人类IL-23结合的库。本文中记载了对应人类IL-23的单个克隆序列，但是单个克隆与人类IL-23的结合数据没有记载。
库制备使用ABI EXPEDITETMDNA合成机，合成带有序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCGCTGTCGATCGATCGATCGATG-3′(序列ID NO459)的DNA模板，接着，采用标准方法进行去保护处理。然后，使用引子PB.1 18.95.G5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3′(序列NO460)和STC.104.102.A(5′-CATCGATCGATCGATCGACAGC-3′(序列NO461)扩增模板，进而用做利用Y639F单变异T7 RNA聚合酶生命体外转录的模板(200nM模板用于第1次循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)。按照下述条件进行转录HEPES缓冲液200mM、DTT 40mM、亚精胺2mM、Triton X-100 0.01％、PEG-8000 10％、二氯化镁5mM、二氯化锰1.5mM、500μM三磷酸核苷(每种)、500μM磷酸鸟苷、0.01单位/微升无机焦磷酸酶、Y639F单变异T7聚合酶。使用两种不同的组合物进行rRmY和rGmH转录。
筛选通过室温下100μl的1倍Dulbecco’PBS溶液中在NuncMaxisorp疏水性培养板上固定20pmole人类IL-23两个小时，引发每次循环的筛选。然后，去除上清液，使用120μl清洗缓冲液(1倍DPBS、0.2％BSA、0.05％Tween-20)清洗孔四次。将RNA库加热到90℃并持续3分钟，再冷却至室温并放置10分钟，致使序列重折叠。在第一次循环中采用正向筛选步骤。简单地讲，将1×1014个分子(0.2毫摩尔)的RNA库培养在固定靶蛋白孔的100微升结合缓冲液(1倍DPBS和0.05％Tween-20)中1小时。去除上清液，然后用120微升清洗缓冲液清洗孔4次。在后续循环中包括负向的筛选步骤。在进行正向筛选步骤以前，在室温下空培养孔中培养RNA库30分钟，从库中去除任何塑料结合的序列。在第4次循环后增加清洗的次数以增加严格性。在所有情况下通过加入反转录混合物(3’引子，STC.104.102.A和ThermoscriptRT，Invitrogen)后，随后，在65℃下培养1个小时，直接在筛选培养板上反转录与固定人类IL-23结合的RNA库。所得的cDNA用做PCR扩增的模板(嗜热水生菌聚合酶，新英格兰生物实验室)。利用60℃退火温度结合的“热启动”PCR条件使引子—二聚体构成最小化。按照生产商建议的条件，使用Centrisep色谱柱对扩增的DNA模板库进行脱盐处理，并且利用扩增的DNA模板库为下一循环筛选设计RNA库的转录。每次循环中使用10％聚丙烯酰胺凝胶，凝胶提纯所得的转录库。表15展示了每次循环筛选所用的RNA库浓度。
表15每次循环筛选的RNA库浓度
利用夹层筛选结合仪监测筛选进程。在90℃下重折叠5’-32P-标记的RNA库3分钟，然后冷却至室温并放置10分钟。然后，在室温下将RNA库(微量浓度)与人类IL-23DPBS、0.1毫克/毫升tRNA共同培养30分钟，接着，施用到斑点印迹装置(Schleicher和Schuell)中硝基纤维素与尼龙的夹层过滤器。
大约每三次循环进行单点筛选(+/-250nM人类IL-23)，检测并计算与硝基纤维素结合RNA库的百分率。如上所述使用蛋白滴定与斑点印迹装置测定库KD值。
筛选与未经实验库相比四次循环后rRmY人类IL-23筛选富含人类IL-23的结合。筛选的严格性增加，并继续另八次循环的筛选。在第9次循环库KD值是大约500nM或者更高。利用TOPOTA克隆仪(Invitrogen)克隆库并用于排序。
图12展示了rGmH第10次循环库与rRmY第12次循环库与人类IL-23结合的数据。在此公式中试用数据，估算分解常数片段RNA结合＝amplitude*KD/(KD+[人类IL-23])。表16展示了rRmY筛选第12次循环的单个克隆序列。从48个克隆获得一组六复制序列和4对双复制序列。标记所有的48个克隆，并测定与200nM人类IL-23的结合。表17展示了rGmH筛选第10次循环的单个克隆序列。结合数据汇集在
图14中。
表16.rRmY筛选第12次循环单个克隆序列的对应cDNAsSEQ ID No.280 ARX34P2.G01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAATGAGAGCAGGCCGAAAAGGAGTCGCTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.281 ARX34P2.A06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAAGGATCAATCTTTCGGCGTATGTGTGAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.282 ARX34P2.E02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGTAAAGCAGGCTGACTGAAAGGTTGAAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.283 ARX34P2.H05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGTTAAAAGCAGGCTCAGGAATGGAAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.284 ARX34P2.G04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAACAAAGCAGGCTCATAGTAATATGGAAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.285 ARX34P2.G03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAAGAGAGCAGGCCGAAAAGGAGTCGCTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.286 ARX34P2.H06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAAAGGCAGGCTCAGGGGATCACTGGAAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.287 ARX34P2.B01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAAAAGCAGGCCGTATGGATATAAGGGAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.288 ARX34P2.B03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAAAGTGCAGGCTGCAGACATATGCGAAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.289 ARX34P2.D05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAAGGAGAGCAGGCCGAAAAGGAGTCGCTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.290 ARX34P2.C05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAGATATAATTAAGGATAAGTGCAAAGGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.291 ARX34P2.C04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGACAACAGCNAGAGGGAATCNCANACAAAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.292 ARX34P2.E06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGATTCTAAGCGCAGGAATAAGTCACCAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.293 ARX34P2.A01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAATGAGCATGGAAGTGGGAGTACGTGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.294 ARX34P2.C06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAAAGAGGCGCCGGAAGTGAGAGTAAGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.295 ARX34P2.B04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAGTGAGTTTCCGAAGTGAGAGTACGAAACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.296 ARX34P2.E04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAATGAGAGCAGGCCGAAAAGGAGTCGCTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.297 ARX34P2.H04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAGAGGCAAGAGAGAGTCGCATAAAAAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.298 ARX34P2.B06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGCAGGCTGTCGTAGACAAACGATGAAGTCGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.299 ARX34P2.F05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGAAAAAGATATGAAAGAAAGGATTAAGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.300 ARX34P2.H02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGAAGGNAACAANAGCACTGTTTGTGCAGGCGCTGTCGATCNATCNATCNATGAAGGGCGSEQ ID No.301 ARX34P2.C03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGAGCATANGGCNTGAAACTGAGANAGTAACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.302 ARX34P2.D01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAAAAGGATATGAGAGAAAGGATTAAGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.303 ARX34P2.A03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATACATAGGCGCCGCGAATGGGAAAGAAAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.304 ARX34P2.B02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTCATGAAGCCATGGTTGTAATTCTGTTTGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.305 ARX34P2.C01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTAATGCAGGCTCAGTTACTACTGGAAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.306 ARX34P2.D06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTTCATAGGCGGGATTATGGAGGAGTATTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.307 ARX34P2.G05AGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTAGAAGCAGGCTCGAATACAATTCGGAAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.308 ARX34P2.F06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTAGCGATGTCGGAAGAGAGAGTACGAGGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.309 ARX34P2.F02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTGCGAAGACCGTGGAAGAGGAGTACTGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.310 ARX34P2.B05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTTTGGTGAAGGTGTAAGAGTGGCACTACACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.311 ARX34P2.A05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCATCAGTTGTGGCGATTATGTGGGAGTATGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.312 ARX34P2.E03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACANAANAACATGCGATTAAAGATCATGAACAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.313 ARX34P2.F04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATAAGCAGGCTCCGATAGTATTCGGGAAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCG
表17.rGmH筛选第10次循环单个克隆序列的对应cDNAsSEQ ID No.314 ARX34P2.E10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTTCGGAATGCGATGGGGGTGATTCGTGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.315 ARX34P2.H09GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTGTTGAGGCTAAGTGGATGATTGAGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.316 ARX34P2.A07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTGGGTCGGTGCGATTGGAGATGTCGTTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.317 ARX34P2.A12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTGATGTCAGGTTGTTTGGAGATTATCTGACNCTGTCNATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.318 ARX34P2.A08GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTCGCGCGACGAGCGAATTTCCGGATGCGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.319 ARX34P2.D12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCATGAATGATTGCGATCGTTGTTCGTGTGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.320 ARX34P2.E11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTCCGACCACGCCTGGGTGATTCCTACNACGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.321 ARX34P2.E12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTACTTTTGGGGATTCACTCCGCGCTGATGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.322 ARX34P2.D08GGGAGAGGAGANAACGTTCTANTAGTGCTTGCGAGATAGTGTAGGATTATACTGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.323 ARX34P2.F07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTAGTGTCCTTCTCCACGTGGTTGTAATTGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.324 ARX34P2.B11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTATTGTGGCGCTTGTTGGACTAACTGACTACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.325 ARX34P2.F12GGGAGAGGAGAGAACGTCCTACTTCGATTGTGATCTTGTGGCGGCCTGTGAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.326 ARX34P2.A09GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTGGCGATGTCGGAAGAGAGAGTACGAGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.467 ARX34P2.B07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTGCTGTGACGGACGGGCTTGAGAGGCTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.327 ARX34P2.D07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTGAANCTGCGTGAATTGANAGTAACGAAGCGCTGTCAATCGATCNATCAATNAAGGGCGSEQ ID No.328 ARX34P2.H10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTCGAGAGGACATGTGGATCCGGTTCGCGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.329 ARX34P2.H07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGTGATGCGGTTTGCGTCGACCGGATTCGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.330 ARX34P2.F11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGTGTGATTGGGCGCATGTCGAGGCGACACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.331 ARX34P2.G07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGATTAAGATGCGCTGGTAGAGCGGTGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.332 ARX34P2.A10
GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGGTTAATTTGCATGCGCGANTAACNTGNTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.333 ARX34P2.G10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGGGAAGCGGTAACTTGGATTGACCGATCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.334 ARX34P2.E11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGTTACGGAGATGATGGGTTTGGCTGTTGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.335 ARX34P2.C07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTGTGGACTGAGATACGATTCGGAGCTGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.336 ARX34P2.E08GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTGTGAGTTTCCTTGGGCCTTGAGCGTGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.337 ARX34P2.A11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGTGATGTGAGCCGATTGTGAAGTTTTGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.338 ARX34P2.B08GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGCGGATGTTTGGGGGTGTGTGTTGGTTGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.339 ARX34P2.B09GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATGCGGTGGTGGTCTTCGATGGGTGGAAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.340 APX34P2.B12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATTGGAGGGGCGCATGTGGTCTGTTTGATGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.341 ARX34P2.F10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTGTTTCGCGGATTTGAAGAGGAGTAAAATCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.342 ARX34P2.B10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTGTGCGTGTTCGGGAAGGGAGAGTGCCGAGGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.343 ARX34P2.G08GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTGTGTGGTGTGCGATGCTTGGCTGTTTGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.344 ARX34P2.C08GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGTTTGTGTGGCTTGGATCTGAAGACTAAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.345 ARX34P2.F09GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGTTCTGGGCTTGTGTGTGAGGATTGACGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.346 ARX34P2.C10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATGATGAAGGCGAAAAGACGAGGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.347 ARX34P2.C11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAGTGCTGATGCGTGTCCTGGGATGGAATTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.348 ARX34P2.D09GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGCGTTTATAGCGATCGATGATGATATAGGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.349 ARX34P2.D10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGCGTTCAAATGGGATAGAATTGGCTGCGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.350 ARX34P2.D11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAATTGTGCGTCAGTGTGAGGCGGTTTGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.351 ARX34P2.E07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGTCGAAATGAGGGTCTGGAGTTCCGACGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.352 ARX34P2.E09GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAATTTGGTAATCTGGGTGACTTAGGATGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.353 ARX34P2.G12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATTTTTTGTGCCGAAGTAAGAGTACGCGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.354 ARX34P2.H08AGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGAGTGTGCGCGGATGAAAACAGAAGTTGTCGCTGTCNATCGATCNATCAATGAAGGGCG实施例8 以人类IgE为靶的rRmY 2’-氧甲基SELEXTM进行筛选，识别含有2’-氧甲基C、U和2’-羟基G、A(rRmY)的适体。所有筛选是以固定在疏水培养板上的人类IgE蛋白为靶的直接筛选。与首次用于实验未经筛选的库相比，筛选产生了明显富含人类IgE结合的库。本文中记载了对应人类IgE的单个克隆序列，但是单个克隆与人类IgE的结合数据没有记载。
库制备使用ABI EXPEDITETMDNA合成机，合成带有序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCGCTGTCGATCGATCGATCGATG-3′(序列ID NO459)的DNA模板，接着，采用标准方法进行去保护处理。然后，使用引子PB.1 18.95.G5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3′(序列NO460)和STC.104.102.A(5′-CATCGATCGATCGATCGACAGC-3′(序列NO461)扩增模板，进而用做利用Y639F单变异T7 RNA聚合酶生命体外转录的模板(200nM模板用于第1次循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)。按照下述条件进行转录HEPES缓冲液200mM、DTT 40mM、亚精胺2mM、Triton X-100 0.01％、PEG-8000 10％、二氯化镁5mM、二氯化锰1.5mM、500μM三磷酸核苷(每种)、500μM磷酸鸟苷、0.01单位/微升无机焦磷酸酶、Y639F单变异T7聚合酶。
筛选通过室温下100μl的1倍Dulbecco’PBS溶液中在NuncMaxisorp疏水性培养板上固定20pmole人类IgE两个小时，引发每次循环的筛选。然后，去除上清液，使用120μl清洗缓冲液(1倍DPBS、0.2％BSA、0.05％Tween-20)清洗孔四次。将RNA库加热到90℃并持续3分钟，再冷却至室温并放置10分钟，致使序列重折叠。在第一次循环中采用正向筛选步骤。简单地讲，将1×1014个分子(0.2毫摩尔)的RNA库培养在固定靶蛋白孔的100微升结合缓冲液(1倍DPBS和0.05％Tween-20)中1小时。去除上清液，然后用120微升清洗缓冲液清洗孔4次。在后续循环中包括负向的筛选步骤。在进行正向筛选步骤以前，在室温下空培养孔中培养RNA库30分钟，从库中去除任何塑料结合的序列。在第4次循环后增加清洗的次数以增加严格性。在所有情况下通过加入反转录混合物(3’引子，STC.104.102.A和ThermoscriptRT，Invitrogen)后，随后，在65℃下培养1个小时，直接在筛选培养板上反转录与固定人类IL-23结合的RNA库。所得的cDNA用做PCR扩增的模板(嗜热水生菌聚合酶，新英格兰生物实验室)。利用60℃退火温度结合的“热启动”PCR条件使引子—二聚体构成最小化。按照生产商建议的条件，使用Centrisep色谱柱对扩增的DNA模板库进行脱盐处理，并且利用扩增的DNA模板库为下一循环筛选设计RNA库的转录。每次循环中使用10％聚丙烯酰胺凝胶，凝胶提纯所得的转录库。
与未经实验的库相比四次循环后富集了对应人类IgE的rRmY库筛选。增加筛选的严格性，并继续另2次循环。在第六次循环库KD值是大约500nM或者更高。利用TOPO TA克隆仪(Invitrogen)克隆所得的库并用于排序。库中含有一种主要的克隆(AMX(123).A1)，其占到排序克隆的71％。测定另外三种克隆，三种克隆表现出具有更强于主要克隆的结合性。据计算，库的KD值是大约500nM。再如上文所述计算分解常数。表18展示了对应人类IgE第6次循环后rRmY库的克隆，其中主要克隆是占到96个克隆40％的AMX(123).A1，以及其它8种序列族。
表18.对于人类IgE第6次循环后rRmY库单个克隆序列的对应cDNAsSEQ ID No.355 AMX(123).A1GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATCTGGGCGAGCCAGTCTGACTGAGGAAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.356 ARX34P1.B07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAGAAGATATGAGAGAAAGGATTAAGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.357 ARX34P1.A07GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAAAAGATATGAGAGAAAGGATTAAGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.358 ARX34P1.A01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAAAAGATATGAGAGAAAGGATTAAGAGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.359 ARX34P1.G05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAAAAGACATGAGAGAAAGGATTAAGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.360 ARX34P1.F09GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACNAAAAAGTATATGAGAGAAAGGATTAANAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.361 ARX34P1.B02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAAAAGATATGAGAGAAAAGGATTGAGAGATGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.362 ARX34P1.G02GGGAGAGGAGAGCACGTTCTACGAAAAAGATATGGAGAGAAAGGATTAAGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.363 ARX34P1.A04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAAAAGATATGAGAGAAAGGATTAAAAGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.364 ARX34P1.G06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAANAAGATACATAGTAGAAAGGATTAATAAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.365 ARX34P1.E05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGCGTGTTGGTAGGGTACGACGAGGCATGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.366 ARX34P1.B11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGCAAAAATGTGATGCGAGGTAATGGAACGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.367 ARX34P1.B01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGACCTCAGCGATAGGGGTTGAAACCGACACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.368 ARX34P1.H06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATGGTCGGATGCTGGGGAGTAGGCAAGGTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.369 ARX34P1.C12GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTATCGGCGAGCGAAGCATCCGGGAGCGTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.370 ARX34P1.C09GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTATTGGCGCGCGAAGCATCCGGGAGCGTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.371 ARX34P1.A11GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTATACCTGACGGCCGGAGGCGCATAGGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.372 ARX34P1.H09GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATGGTCGGATGCTGGGGAGTAGGCAAGGTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.373 ARX34P1.B05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACACGAGAGTACTGAGGCGCTTGGTACAGAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.374 ARX34P1.B10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGAAGGTAGAAAAAGGATAGCTGTGAGAAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.375 ARX34P1.C01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGAGGGATAATACGGGTGGGATTGTCTTCCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.376 ARX34P1.D04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATTGAGCGTTGAAGTTGGGGAAGCTCCGAGGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.377 ARX34P1.E02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGCGCAGATATACAGCGAGGTAATGGAACGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.378 ARX34P1.F01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAGACAGCCCAATAGCGGCACGCAACTTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.379 ARX34P1.G03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCGGTTGAGGGCTCGCGTGGAAGGGCCAACACGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.380 ARX34P1.H01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATATCAATAGACTCTTGACGTTTGGGTTTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.381 ARX34P1.E02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGTGAAGGAAAAGTAAGTGAAGGTGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.382 ARX34P1.E03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGATGAAATGAGTGTCTGCGATAGGTTAAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.383 ARX34P1.H10GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGAAGGAAATGTGTGTCTGCGATAGGTTAAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCG实施例9以PDGF-BB为靶的rRmY和rGmH 2’-氧甲基SELEXTM进行筛选，识别含有2’-氧甲基C、U和2’-羟基G、A(rRmY)、2’-氧甲基A、C、U和2’-羟基G(rGmH)的适体。所有筛选是以固定在疏水板上的人类PDGF-BB蛋白为靶的直接筛选。与首次用于实验未经筛选的库相比，筛选产生了明显富含人类PDGF-BB结合的库。本文中记载了对应PDGF-BB的单个克隆序列。
库制备使用ABI EXPEDITETMDNA合成机，合成带有序列5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCGCTGTCGATCGATCGATCGATG-3′(序列ID NO459)的DNA模板，接着，采用标准方法进行去保护处理。然后，使用引子PB.1 18.95.G5′-GGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC-3′(序列NO460)和STC.104.102.A(5′-CATCGATCGATCGATCGACAGC-3′(序列NO461)扩增模板，进而用做利用Y639F单变异T7RNA聚合酶生命体外转录的模板(200nM模板用于第1次循环；并且在后续循环使用大约50nM，在文中所述条件下使用最佳PCR反应的1/10稀释)。按照下述条件进行转录HEPES缓冲液200mM、DTT 40mM、亚精胺2mM、Triton X-100 0.01％、PEG-8000 10％、二氯化镁5mM、二氯化锰1.5mM、500μM三磷酸核苷(每种)、500μM磷酸鸟苷、0.01单位/微升无机焦磷酸酶、Y639F单变异T7聚合酶。使用两种不同的组合物进行rRmY和rGmH转录。
筛选通过室温下100μl的1倍Dulbecco’PBS溶液中在NuncMaxisorp疏水性培养板上固定20pmolPDGF-BB两个小时，引发每次循环的筛选。然后，去除上清液，使用120μl清洗缓冲液(1倍DPBS、0.2％BSA、0.05％Tween-20)清洗孔四次。将RNA库加热到90℃并持续3分钟，再冷却至室温并放置10分钟，致使序列重折叠。在第一次循环中采用正向筛选步骤。简单地讲，将1×1014个分子(0.2毫摩尔)的RNA库培养在固定靶蛋白孔的100微升结合缓冲液(1倍DPBS和0.05％Tween-20)中1小时。去除上清液，然后用120微升清洗缓冲液清洗孔4次。在后续循环中包括负向的筛选步骤。在进行正向筛选步骤以前，在室温下空培养孔中培养RNA库30分钟，从库中去除任何塑料结合的序列。在第4次循环后增加清洗的次数以增加严格性。在所有情况下通过加入反转录混合物(3’引子，STC.104.102.A和ThermoscriptRT，Invitrogen)后，随后，在65℃下培养1个小时，直接在筛选培养板上反转录与固定PDGF-BB结合的RNA库。所得的cDNA用做PCR扩增的模板(嗜热水生菌聚合酶，新英格兰生物实验室)。利用60℃退火温度结合的“热启动”PCR条件使引子—二聚体构成最小化。按照生产商建议的条件，使用Centrisep色谱柱对扩增的DNA模板库进行脱盐处理，并且利用扩增的DNA模板库为下一次循环筛选设计RNA库的转录。每次循环中使用10％聚丙烯酰胺凝胶，凝胶提纯所得的转录库。
尽管未经实验的库确实可以与PDGF-BB结合，但是经过四次循环后富集了超过未经实验库的rRmY PDGF-BB筛选。筛选的严格性增加，并继续另8次循环。在第12次循环富集的库更超过未经实验的库，但是KD值很高。在第10次循环富集了超过未经实验库的rGmH筛选。库的KD值也是大约950nM或者更高。利用TOPO TA克隆仪(Invitrogen)克隆库并用于排序。
图13(A)展示了rRmY库PDGF-BB筛选第12次循环库的结合图形，
图13(B)展示了rGmH库PDGF-BB筛选第10次循环库的结合图形。利用夹层过滤结合技术再次测定分解常数。在此公式中试用数据，估算分解常数(KDs)片段RNA结合＝amplitude*KD/(KD+[PDGF-BB])。
表19.对应PDGF-BB第12次循环筛选rRmY库单个克隆序列的对应cDNAsSEQ ID No.384 PDGF-BB ARX36.SCK.E05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATCCTTGCGTATGATCGGCATCGTAAGACACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.385 PDGF-BB ARX36.SCK.F05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATCCTTGCGTATGATCGGCATCGTAAGACACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.386 PDGF-BB ARX36.SCK.E01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATCGAAGTCGTGACAGAAACCACTCGCTGTCGATCCATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.387 PDGF-BB ARX36.SCK.F01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATCGAAGTCGTGACAGAAACCACTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.388 PDGF-BB ARX36.SCK.G01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGAAAAGGTTGGCGAAACGAAGAAGAATTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.389 PDGF-BB ARX36.SCK.G02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGAAAAGGTTGGCGAAACGAAGAANAATTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.390 PDGF-BB ARX36.SCK.F04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGGGAGTTGCGGTGTTTTGCGGTGGATTTGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.391 PDGF-BB ARX36.SCK.E04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGGGAGTTGCGGTGTTTTGCGGTGGATTTGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.392 PDGF-BB ARX36.SCK.F02GGGAGAGGAGAGAACGCTCTACAAGATTGTAGATCAACAGCGAAGGCGTGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.393 PDGF-BB ARX36.SCK.E02GGGAGAGGAGAGAACGCTCTACAAGATTGTAGATCAACAGCGAAGGCGTGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.394 PDGF-BB ARX36.SCK.A02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAANAAGATNNCCANCNNGAGANAAAGGAGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.395 PDGF-BB ARX36.SCK.A03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAACATCGAAGATCGAACTGAAAAGGAGGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.396 PDGF-BB ARX36.SCK.A06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACATGTGCATGCAAGGTGGGGCTGACACGAGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.397 PDGF-BB ARX36.SCK.B01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAGGAGTAGATCGACAGAATAGAAAAATCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.398 PDGF-BB ARX36.SCK.B02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAAAGGTAAGGTCAAAAAAGCGCAACGTTGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.399 PDGF-BB ARX36.SCK.D04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAAAGGAGGCGAAATAAGTGAGACAATGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.400 PDGF-BB ARX36.SCK.B04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAAAATCCACAAACATAGCTGTAATTGCTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.401 PDGF-BB ARX36.SCK.B05GGGAGAGGAGAGACGTTCTACAAGAACATATAACATTTTGGTTGAGAGCAACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.402 PDGF-BB ARX36.SCX.D03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAGAGTCNACGATTTCNATCACAAATGTGGCTGCTGTCNATCGATCGATCNATGAAGGGCGSEQ ID No.403 PDGF-BB ARX36.SCK.C01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAGCAAGCAAAAAAAGTATCGACAGAAGTGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.404 PDGF-BB ARX36.SCK.D06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAGTAATATCAGAGCAATCGGAATAAGAGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.405 PDGF-BB ARX36.SCK.D02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGACTTCGATGCGATGGATTTGGAAATGTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.406 PDGF-BB ARX36.SCK.C03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGAAAGAATTACAGGAACAAATACACGTGCGGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.407 PDGF-BB ARX36.SCK.F06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGAAATCAATCGAGGTGATCGTTATATAGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.408 PDGF-BB ARX36.SCK.C04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGATTTGGATCGACAATCTCGTAGAAGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.409 PDGF-BB ARX36.SCK.C06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAATGCAAGTTTAAGTGTGGTGTCAAACGCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.410 PDGF-BB ARX36.SCK.G03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAATAAAGACACGAAGATCGACGGAGACTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.411 PDGF-BB ARX36.SCK.F03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAGATGTGTTTAAGAATCGAGGTTTTCGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.412 PDGF-BB ARX36.SCK.C02GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAGTTGGCACGCATGTATAGGTATTTTGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.413 PDGF-BB ARX36.SCK.B03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAAAAAAGAGATGAGAGAAAGGATTAAGAGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.414 PDGF-BB ARX36.SCK.B06GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAAAGGAAAAAAAACGATCGGCAGAGTCCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.415 PDGF-BB ARX36.SCK.C05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATTAAGGAAACATTTACGCGAATACATGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.416 PDGF-BB ARX36.SCK.D01GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGACGTTTGCTCTGAAATAGGACAGAAGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.417 PDGF-BB ARX36.SCK.E03GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAAGATGTGTTTAAGAATCGAGGTTTTCGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.418 PDGF-BB ARX36.SCK.A04GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCGAGATCGAAAGGTAAGAGAAAATTCATGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.419 PDGF-BB ARX36.SCK.A05GGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTAAGATTCGTCGTTCAGACAGAGAAAGCGACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCG
表20.对应PDGF-BB第10次循环筛选rGmH库单个克隆序列的对应cDNAsSEQ ID No.420 PDGF-BB ARX36.SCK.E08.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTTGGCGACGATCTGTGACCTGAATTTTTGTCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.421 PDGF-BB ARX36.SCK.F08.N13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTTGGCGACGATCTGTGACCTGAATTTTTGTCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.422 PDGF-BB ARX36.SCK.E09.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTTGGTCTCAGCAGCTTTTAACAAAGTATCCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.423 PDGF-BB ARX36.SCK.F09.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTTGGTCTCAGCAGCTTTTAACAAAGTATCCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.424 PDGF-BB ARX36.SCK.F07.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCGCTATTTTGTTCATTGAAGGACTTGTCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.425 PDGF-BB ARX36.SCK.E07.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCGCTATTTTGTTCATTGAAGGACTTGTCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.426 PDGF-BB ARX36.SCK.E11.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCCTATTGAGGTTGATTGGAAGTGCCTATGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.427 PDGF-BB ARX36.SCK.F11.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCCTATTGAGGTTGATTGGAAGTGCCTATGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.428 PDGF-BB ARX36.SCK.F10.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGAAGATGTTATGATGATTGACGAGGAGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.429 PDGF-BB ARX36.SCK.E10.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGAAGATGTTATGATGATTGACGAGGAGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.430 PDGF-BB ARX36.SCK.E12.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGTCTGAGTGTCGCCGCCTTGTGTGATGTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.431 PDGF-BB ARX36.SCX.F12.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGTCTGAGTGTCGCCGCCTTGTGTGATGTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.432 PDGF-BB ARX36.SCK.A07.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTGATGGCTGTGAATGAGGTAGTTCGAATACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.433 PDGF-BB ARX36.SCK.C12.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTGAAATCAAGGTTGTTAATTTGGGGAATCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.434 PDGF-BB ARX36.SCK.B07.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTATAAGGCCGTAACCGGGTAGCGAGTGGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.435 PDGF-BB ARX36.SCK.A09.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTNTACGTGGGCGAAGGAGCTGCGGGCGTTGNAGTTTGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.436 PDGF-BB ARX36.SCK.A11.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTCATCCTAGTCTGAGATCGGATTTTCTTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.437 PDGF-BB ARX36.SCK.C09.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGTTTGCGAGTGTGGTCGACGCTGAATGCGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.438 PDGF-BB ARX36.SCK.A08.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGGATTGATAGGGATTGAGATGAGGTCTTGTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.439 PDGF-BB ARX36.SCK.D07.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATGTCGTGTTAGATTACTTATTGCTATCTGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.440 PDGF-BB ARX36.SCK.D08.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGATGCCTGGCGGAAACGGAGCCTGGGATTTCGCTGTCNATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.441 PDGF-BB ARX36.SCK.B11.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAGGATTTGACGTGTGTGTGCTAGAGTACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.442 PDGF-BB ARX36.SCK.D09.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACGAGTATTATGCGTCCCTTGAGGATACACGGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.443 PDGF-BB ARX36.SCK.B10.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAGGGATAACTGTAGCGATGAAAGTAAACGATGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.444 PDGF-BB ARX36.SCK.C10.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACAAGAAGTGTGGCCGCAGAGACGAAATGCACGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.445 PDGF-BB ARX36.SCK.A10.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCCATATCTTCCTTCTTTATTCCGTTAGTTGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.446 PDGF-BB ARX36.SCK.B09.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTGTGTTGATGCTTCCGTTTGAGATTGCCCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.447 PDGF-BB ARX36.SCK.B12.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCNGTAAGANAANCTATTTTAGCCCTTGNNCTGCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.448 PDGF-BB ARX36.SCK.C08.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCCTTGTCCTCCAATCCTCTTTTGACTCTTGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.449 PDGF-BB ARX36.SCK.D12.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACCTGATTTTGTCACTGGATTCCGATGGCTTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.450 PDGF-BB ARX36.SCK.C11.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGTAATAAGGGATGCGTCAGGAACCTGTGTTCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.451 PDGF-BB ARX36.SCK.D11.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTGCTTTCCGGGAATTTGTTTGTTTGCTTCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.452 PDGF-BB ARX36.SCK.C07.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTTCGTCGGTTGACTTTTCTTCGTGTAGTGTCGCTGTCGATCGATTGATCGATGAAGGGCGSEQ ID No.189 PDGF-BB ARX36.SCK.A12.M13FGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACTATGAAGGGTTTTAAAGATGACACATTAGCCGCTGTCGATCGATCGATCGATGAAGGGCG
由下述权利要求书定义已详细描述本发明与前述非限定实施例的权益与保护范围。
权利要求
1.对应靶分子识别含有修饰核苷酸的核酸配体的方法，其中包括a)制备转录反应混合物，其中包括变异聚合酶、一种或者多种2’-修饰三磷酸核苷(NTPs)、镁离子、和一种或者多种低核苷酸转录模板；b)通过在一定条件下转录一种或者多种低核苷酸转录模板，制备单链核酸的候选混合物，由此变异聚合酶将至少一种或者多种核苷酸嵌入所述候选混合物的每一种核酸，其中所述候选混合物的每种核酸包括选自2’-位置修饰嘧啶与2’-位置修饰嘌呤的2’-修饰核苷酸；c)将候选混合物与所述的靶分子相接触；d)从剩余的候选混合物分离出相对于候选混合物与靶分子亲合性增强的核酸；e)在生命体外扩增亲合性增强的核酸，产生富含配体的核酸混合物，由此识别出靶分子的核酸配体。
2.权利要求1的方法，其中一种或者多种2’-修饰核苷酸选自2’-羟基、2’-脱氧、2’-氧-甲基、2’-NH2、2’-氟、和2’-甲氧基乙基修饰。
3.权利要求1的方法，其中一种或者多种2’-修饰核苷酸是2’-氧-甲基修饰。
4.权利要求1的方法，其中一种或者多种2’-修饰核苷酸是2’-氟修饰。
5.权利要求1的方法，其中变异聚合酶是变异的T7 RNA聚合酶。
6.权利要求5的方法，其中变异的T7 RNA聚合酶包括在639位置从酪氨酸残基到苯丙氨酸残基的变异(Y639F)。
7.权利要求5的方法，其中变异的T7 RNA聚合酶包括在748位置从组氨酸残基到丙氨酸残基的变异(H784A)。
8.权利要求5的方法，其中变异的T7 RNA聚合酶包括在639位置从酪氨酸残基到苯丙氨酸残基的变异和在748位置从组氨酸残基到丙氨酸残基的变异(Y639F/H784A)。
9.权利要求1的方法，其中低核苷酸转录模板还包括嵌入其5’末端固定区域的前导序列。
10.权利要求9的方法，其中前导序列包括全嘌呤前导序列。
11.权利要求10的方法，其中全嘌呤前导序列具有至少6个核苷酸、至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少14个核苷酸的长度。
12.权利要求1的方法，其中转录反应混合物还包括锰离子。
13.权利要求12的方法，其中镁离子浓度是锰离子浓度的3.0-3.5倍。
14.权利要求1的方法，其中每种三磷酸核苷浓度为0.5mM，镁离子浓度为5.0mM，锰离子浓度为1.5mM。
15.权利要求1的方法，其中每种三磷酸核苷浓度为1.0mM，镁离子浓度为6.5mM，锰离子浓度为2.0mM。
16.权利要求1的方法，其中每种三磷酸核苷浓度为2.0mM，镁离子浓度为9.6mM，锰离子浓度为2.9mM。
17.权利要求1的方法，其中转录反应混合物还包括2’-羟基三磷酸鸟苷。
18.权利要求1的方法，其中转录反应混合物还包括聚亚烷基二醇。
19.权利要求18的方法，其中聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
20.权利要求1的方法，其中转录反应混合物还包括鸟苷酸。
21.权利要求1的方法，其中还包括f)重复步骤d)和e)。
22.按照权利要求1的方法识别对应凝血酶的核酸配体。
23.按照权利要求1的方法识别对应血管内皮生长因子(VEGF)的核酸配体。
24.按照权利要求1的方法识别对应免疫球蛋白E的核酸配体。
25.按照权利要求1的方法识别对应IL-23的核酸配体。
26.按照权利要求1的方法识别对应血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)的核酸配体。
27.权利要求1的方法，其中2’修饰三磷酸核苷包括2’-羟基三磷酸腺苷(ATP)、2’-羟基三磷酸鸟苷(GTP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)和2’-氧-甲基-三磷酸尿苷(UTP)的混合物。
28.权利要求1的方法，其中2’修饰三磷酸核苷包括2’-脱氧三磷酸嘌呤核苷和2’-氧-甲基三磷酸嘧啶核苷的混合物。
29.权利要求1的方法，其中2’修饰三磷酸核苷包括2’-氧-甲基三磷酸腺苷(ATP)、2’-羟基三磷酸鸟苷(GTP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)和2’-氧-甲基-三磷酸尿苷(UTP)的混合物。
30.权利要求1的方法，其中2’修饰三磷酸核苷包括2’-氧-甲基三磷酸腺苷(ATP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)、2’-氧-甲基三磷酸尿苷(UTP)和2’-氧-甲基-三磷酸鸟苷(GTP)和脱氧三磷酸鸟苷(GTP)的混合物，其中脱氧三磷酸鸟苷至多占到三磷酸鸟苷总量的10％。
31.权利要求1的方法，其中2’修饰三磷酸核苷包括2’-氧-甲基三磷酸腺苷(ATP)、2’-氟三磷酸鸟苷(GTP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)和2’-氧-甲基-三磷酸尿苷(UTP)的混合物。
32.权利要求1的方法，其中2’修饰三磷酸核苷包括2’-脱氧三磷酸腺苷(ATP)、2’-氧-甲基三磷酸鸟苷(GTP)、2’-氧-甲基三磷酸胞苷(CTP)和2’-氧-甲基-三磷酸尿苷(UTP)的混合物。
33.一种制备含有一种或者多种修饰核苷酸的核酸的方法，其中包括(a)制备转录反应混合物，其中包括变异聚合酶、一种或者多种2’-修饰的三磷酸核苷(NTPs)、镁离子和一种或者多种低核苷酸转录模板；(b)在一定条件下将一种或者多种低核苷酸转录模板与变异的聚合酶相接触，由此变异聚合酶将一种或者多种2’-修饰核苷酸嵌入核酸转录产物。
34.权利要求33的方法，其中一种或者多种2’-修饰核苷酸选自2’-羟基、2’-脱氧、2’-氧-甲基、2’-NH2、2’-氟、和2’-甲氧基乙基修饰。
35.权利要求33的方法，其中一种或者多种2’-修饰核苷酸是2’-氧-甲基修饰。
36.权利要求33的方法，其中一种或者多种2’-修饰核苷酸是2’-氟修饰。
37.权利要求33的方法，其中变异聚合酶是变异的T7 RNA聚合酶。
38.权利要求37的方法，其中变异的T7 RNA聚合酶包括在639位置从酪氨酸残基到苯丙氨酸残基的变异(Y639F)。
39.权利要求37的方法，其中变异的T7 RNA聚合酶包括在748位置从组氨酸残基到丙氨酸残基的变异(H784A)。
40.权利要求37的方法，其中变异的T7 RNA聚合酶包括在639位置从酪氨酸残基到苯丙氨酸残基的变异和在748位置从组氨酸残基到丙氨酸残基的变异(Y639F/H784A)。
41.权利要求33的方法，其中低核苷酸转录模板还包括嵌入其5’末端固定区域的前导序列。
42.权利要求41的方法，其中前导序列包括全嘌呤前导序列。
43.权利要求42的方法，其中全嘌呤前导序列具有至少6个核苷酸、至少8个核苷酸、至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少14个核苷酸的长度。
44.权利要求33的方法，其中转录反应混合物还包括锰离子。
45.权利要求44的方法，其中镁离子浓度是锰离子浓度的3.0-3.5倍。
46.权利要求33的方法，其中每种三磷酸核苷浓度为0.5mM，镁离子浓度为5.0mM，锰离子浓度为1.5mM。
47.权利要求33的方法，其中每种三磷酸核苷浓度为1.0mM，镁离子浓度为6.5mM，锰离子浓度为2.0mM。
48.权利要求33的方法，其中每种三磷酸核苷浓度为2.0mM，镁离子浓度为9.6mM，锰离子浓度为2.9mM。
49.权利要求33的方法，其中转录反应混合物还包括2’-羟基三磷酸鸟苷。
50.权利要求33的方法，其中转录反应混合物还包括聚亚烷基二醇。
51.权利要求50的方法，其中聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
52.权利要求33的方法，其中转录反应混合物还包括鸟苷酸。
53.一种含有序列的适体组合物，其中所有腺苷核苷酸基本上是2’-羟基腺苷，所有的鸟苷核苷酸基本是2’-羟基鸟苷，所有的胞苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基胞苷，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷。
54.权利要求53的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷。
55.权利要求53的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷。
56.权利要求53的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸都是2’-羟基腺苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷。
57.一种含有序列的适体组合物，其中所有嘌呤核苷酸基本上是2’-脱氧嘌呤，所有的嘧啶核苷酸基本上是2’-氧-甲基嘧啶。
58.权利要求57的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有嘌呤核苷酸的至少80％是2’-脱氧嘌呤，所有嘧啶核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基嘧啶。
59.权利要求57的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有嘌呤核苷酸的至少90％是2’-脱氧嘌呤，所有嘧啶核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基嘧啶。
60.权利要求57的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有嘌呤核苷酸都是2’-脱氧嘌呤，所有嘧啶核苷酸都是2’-氧-甲基嘧啶。
61.一种含有序列的适体组合物，其中所有鸟苷核苷酸基本上是2’-羟基鸟苷，所有的胞苷核苷酸基本是2’-氧-甲基胞苷，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷，所有的腺苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基腺苷。
62.权利要求61的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷，所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基腺苷。
63.权利要求61的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷，所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基腺苷。
64.权利要求61的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有鸟苷核苷酸都是2’-羟基鸟苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷，所有腺苷核苷酸都是2’-氧-甲基腺苷。
65.一种含有序列的适体组合物，其中所有的腺苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基腺苷，所有的胞苷核苷酸基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基鸟苷或者脱氧鸟苷，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷，其中脱氧鸟苷含量小于10％鸟苷核苷酸。
66.权利要求65的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基腺苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷，并且脱氧鸟苷不超过鸟苷核苷酸总量的10％。
67.权利要求65的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基腺苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷，并且脱氧鸟苷不超过鸟苷核苷酸总量的10％。
68.权利要求65的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸都是2’-氧-甲基腺苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的90％是2’-氧-甲基鸟苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷，并且脱氧鸟苷不超过鸟苷核苷酸总量的10％。
69.一种含有序列的适体组合物，其中所有的腺苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基腺苷，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷，所有的胞苷核苷酸基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸基本上是2’-氟鸟苷序列。
70.权利要求69的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基腺苷，所有尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷，所有胞苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-氟鸟苷。
71.权利要求69的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基腺苷，所有尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷，所有胞苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-氟鸟苷。
72.权利要求69的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸都是2’-氧-甲基腺苷，所有尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-氟鸟苷。
73.一种含有序列的适体组合物，其中所有的腺苷核苷酸基本上是2’-脱氧腺苷，所有的胞苷核苷酸基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基鸟苷序列，所有的尿苷核苷酸基本上是2’-氧-甲基尿苷。
74.权利要求73的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸的至少80％是2’-脱氧腺苷，所有胞苷核苷酸的至少80％基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基鸟苷序列，所有的尿苷核苷酸的至少80％是2’-氧-甲基尿苷。
75.权利要求73的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸的至少90％是2’-脱氧腺苷，所有胞苷核苷酸的至少90％基本是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基鸟苷序列，所有的尿苷核苷酸的至少90％是2’-氧-甲基尿苷。
76.权利要求73的适体组合物，其中在所述含有序列的适体组合物中，所有腺苷核苷酸都是2’-脱氧腺苷，所有胞苷核苷酸都是2’-氧-甲基胞苷，所有鸟苷核苷酸都是2’-氧-甲基鸟苷序列，所有的尿苷核苷酸都是2’-氧-甲基尿苷。
全文摘要
本发明提供了产生使经修饰三磷酸核苷嵌入自身序列的适体治疗剂的材料与方法。由本发明方法制备的适体具有增强的稳定性与延长的半衰期。
文档编号C07H21/02GK1735693SQ200380108282
公开日2006年2月15日 申请日期2003年12月3日 优先权日2002年12月3日
发明者安东尼·克费, 查尔斯·威尔逊, 波拉·伯梅斯特, 萨拉切斯沃思·克内 申请人:阿切埃米克斯有限公司