专利名称：改良的淀粉、其用途及生产方法
发明概述本发明涉及改良的淀粉及其生产和用途。淀粉具有改变的粘度性质和改变的磷酸(phosphate)含量。
图1描绘了含有PCR扩增的马铃薯R1作为插入物的农杆菌载体。
图2描绘了含有合成R1作为插入物的农杆菌载体。
图3显示了在淀粉完全水解后葡萄糖-6-磷酸的测定，以及R1玉米淀粉磷酸化的增加。
图4显示与非转基因玉米淀粉相比R1玉米淀粉的相对溶胀力。
图5显示与非转基因玉米淀粉相比R1玉米淀粉的相对溶解性。
图6显示了HPLC分析的结果，表明在模拟的消化条件下R1玉米粉的体外可消化性。
图7显示了R1玉米粉对淀粉水促水解酶酶解的敏感性。
图8显示了温育时间和酶浓度对R1玉米淀粉水解速率的影响。
图9表明了R1玉米淀粉的可发酵性。
图10显示了表达合成R1(密码子优化的)的T1代种子中淀粉磷酸化的水平。
发明详述这里描述的由核酸分子编码的蛋白质是一种R1蛋白质，它影响淀粉合成和/或修饰。已发现在植物细胞中该蛋白质的量的改变会导致植物淀粉代谢的改变，特别是导致具有改良的物理化学性质的淀粉的合成。
使用编码R1蛋白质的核酸分子，通过重组DNA技术可以得到合成改良淀粉的转基因植物，改良淀粉与野生型植物合成的淀粉在其结构以及物理化学性质上不同。为了达到这一目的，将编码R1蛋白质的核酸分子与调控元件相连，然后导入到植物细胞中，其中，调控元件可确保在植物细胞中的转录和翻译。本发明的核酸分子优选为对玉米优化的核酸序列，例如在序列编号1中给出的序列。
因此，本发明使用含有编码R1蛋白质的核酸分子的转基因植物细胞，其中的核酸分子与可确保在植物细胞中转录的调控元件相连。优选地，调控元件对于核酸分子而言是异源的。
使用本领域技术人员已知的方法，转基因植物细胞可以被再生为整个植物。本发明的另一个主题包括含有上述转基因植物细胞的植物。原则上转基因植物可以是任何希望物种的植物，即转基因植物可以是单子叶植物或者双子叶植物。优选地，在本发明中使用的植物和植物细胞是转基因玉米或者转基因稻。
由于编码R1蛋白质的核酸分子的表达或者额外表达，本发明中使用的转基因植物细胞和植物可合成这样的淀粉，该淀粉与野生型即非转基因植物的淀粉相比发生了改变，特别是在这种淀粉水溶液的粘度和/或磷酸的含量方面。
因此，可以从本发明的转基因植物细胞和植物中得到的淀粉是本发明的主题。
以离子性官能团共价衍生淀粉可提高淀粉在任何离子性介质中的溶解性和溶胀力，使改良的淀粉分子更易被其他分子(例如修饰剂化学物质和/或酶)接近。例如，使用离子性磷酸基团共价修饰淀粉中的葡萄糖残基可以提高淀粉分子对水或任何极性溶剂的亲和性。这种衍生化还可通过在葡萄糖残基链上连接的带有两个负电荷的磷酸基团之间的电互斥作用帮助淀粉的溶胀。溶胀的和水合磷酸化的淀粉更容易受到修饰剂，包括例如水解酶、化学物质和/或酶的进攻，以便进一步衍生化。
修饰剂的实例包括但是不局限于交联剂如三氯氧化磷、三偏磷酸钠(sodium trimetaphosphate)、乙己二酐；以及取代剂如1，2-环氧丙烷(proplene oxide)、1-辛烯基琥珀酸酐以及醋酸酐。
可以将可从本发明的转基因植物中获得的淀粉用于食品和饲料应用中。用离子性官能团(例如磷酸)衍生的淀粉的使用不仅可提高可以被水解的淀粉的比例，而且可提高淀粉水解的速率和/或减少实现完全水解所需的酶。
本发明中的改良淀粉可以用于例如以下应用中动物饲料。使用易消化的淀粉配制饲料，饲料中因而具有更多的可摄取的饮食能量。尽管改良的淀粉可以用于任何动物的饲料中，但优选将这种淀粉用于单胃动物(包括但是不局限于鸡和猪)的饲料中。改良的淀粉在反刍动物如牛、山羊和绵羊的饲料中也是有用的。
人的食品。使用易消化的淀粉配制食品，食品中因而具有更多的可摄取的饮食能量。
在发酵工艺中作为可发酵的原料。可用于不同发酵工艺(例如乙醇生产)中的淀粉，首先被淀粉酶和/或葡萄糖淀粉酶断裂为易于发酵的糖(聚合度通常小于或等于3)。经该酶促水解后进行发酵，在发酵中将糖转化为各种不同的发酵产物(例如乙醇)。因此，更易于(在更少的时间内和/或使用更少的酶量)被淀粉酶和/或葡萄糖淀粉酶水解的淀粉可以作为发酵工艺更好的起始底物。
本发明的改良淀粉可以用于任何的发酵工艺，包括但是不局限于乙醇生产、乳酸生产以及多元醇的生产(例如甘油的生产)。
本发明的改良淀粉(即R1玉米淀粉)在室温下改善的可消化性，可以通过使淀粉中的更大部分可用于水解酶的水解和易于被水解酶水解接近，而使“粗淀粉发酵(raw-starch fermentation)”过程在经济上利润更大。
因此，本发明中的改良淀粉可以用于粗淀粉发酵。在粗淀粉发酵中，淀粉在酶促水解之前不被液化，于室温下在进行发酵工艺的同时进行水解。
使用本发明的方法即转基因表达R1蛋白质(葡聚糖二激酶(glucan dikinase))的方法在植物内(in-planta)进行淀粉衍生化，可改进淀粉用于饲料、食品或者可发酵底物时的溶解性和溶胀力，和提高淀粉的可消化性。
本发明中还包括制备水解淀粉产物溶液的方法，该方法包括在可激活R1多肽的条件下处理包含有淀粉颗粒(starch granules)的植物或者植物部分，由此加工淀粉颗粒形成含有水解的淀粉产物的水溶液。在本发明中使用的植物或者植物部分是转基因植物或者植物部分，其基因组中加入了编码R1多肽的表达盒。水解的淀粉产物可以包含糊精、麦芽低聚糖(maltooligosaccharide)、葡萄糖和/或其混合物。该方法可还包含分离水解的淀粉产物和/或发酵水解的淀粉产物。
R1多肽优选在胚乳中表达。可以操作性地将R1基因的序列与启动子以及使该酶靶向淀粉颗粒的信号序列相连。
本发明还包含制备水解淀粉产物的方法，该方法包括在可激活R1多肽的条件下处理包含有淀粉颗粒的植物或者植物部分，由此加工淀粉颗粒形成含有水解的淀粉产物的水溶液。在本发明中使用的植物或者植物部分是转基因植物或者植物部分，其基因组中加入了编码R1多肽的表达盒。
本发明还包括制备发酵产物例如乙醇的方法，该方法包括在可激活R1多肽的条件下处理包含有淀粉颗粒的植物或者植物部分，由此消化多糖形成寡糖或者可发酵的糖，并在促进可发酵糖或寡糖向乙醇转化的条件下温育可发酵的糖。在本发明中使用的植物或者植物部分是转基因植物或者植物部分，其基因组中加入了编码R1多肽的表达盒。
植物部分可以是谷物(grain)、果实、种子、茎干、木材、蔬菜或者根。优选植物部分来自植物如燕麦、大麦、玉米或者稻。发酵产物包括但是不局限于乙醇、乙酸、甘油和乳酸。
本发明还包括制备麦芽糖糊精的方法，该方法包括将转基因谷物与水混和、加热所述的混合物、将产生的糊精糖浆与固体分离，和收集麦芽糖糊精。此外，还包括了从表达R1的谷物中制备糊精或糖的方法。
本发明还涉及使用表达R1的转基因谷物制备可发酵的糖的方法。
用离子性官能团衍生化的改良淀粉提高的溶解性和溶胀力，使淀粉更易受到不仅仅是水解酶而且是任何修饰剂的攻击。因此改良淀粉还可以进一步进行其他的酶促和/或化学修饰。溶胀的和溶剂化的淀粉可以提高修饰剂向淀粉分子/颗粒中的渗透，因此可以容纳更高程度的取代，并且使官能团在淀粉分子/颗粒中具有均一的分布。
通过以下的方法和实施例对本发明进行进一步描述，这些方法和实施例的意图不是以任何形式限制本发明的范畴。
实施例实施例1用于在玉米中表达R1的构建体马铃薯R1-cDNA的PCR扩增和克隆以PCR从马铃薯(Solanum tuberosum)组织的cDNA文库中扩增出全长的cDNA，使用的引物是根据GenBank登录号Y09533[LorberthR.，Ritte G.，Willmitzer L.，Kossmann J.，Nature Biotech.1998，16，473-477]设计的引物R1-5′-pr5′-T GCA GCC ATG GGTAAT TCC TTA GGG AAT AAC-3′和R1-3′-pr5′-TC CAA GTC GAC TCA CATCTG AGG TCT TGT CTG-3′。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增出的DNA克隆到pCR载体中。插入物的序列经确证并移入(切割和连接)下面描述的农杆菌转化载体中。
经过玉米密码子优化的R1基因的构建R1蛋白质的氨基酸序列从文献[Lorberth R.，Ritte G.，Willmitzer L.，Kossmann J.，Nature Biotech.1998，16，473-477]中得到。根据公开的蛋白质氨基酸序列，设计针对玉米优化的编码R1的合成基因(序列编号1)。
分离出启动子片段(γ-玉米醇溶蛋白)用于胚乳特异的表达在这里描述的构建体中使用的(γ-玉米醇溶蛋白)启动子是根据2003年3月6日出版的国际出版物编号WO 03/018766中公开的描述分离的，将该文献整体在这里引用作为参考。
R1农杆菌转化载体(agro-transformation vectors)的构建
质粒pNOV4080(图1)通过将PCR扩增的马铃薯R1-DNA(NcoI和SalI是两个两侧的限制性位点)连接到玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子之后(即其3′端)而构建。通过农杆菌感染进行玉米的转化。转化载体含有磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，后者允许用甘露糖筛选转基因细胞。转化的玉米植物自体授粉，收集种子进行分析。
以相似的方式构建质粒pNOV 2117(图2)。插入物是合成的R1-DNA，后者具有经玉米密码子优化的序列(编码序列编号1中显示的氨基酸序列)。在2003年3月6日出版的国际出版物编号WO03/018766中公开了对pNOV2117的描述。
实施例2农杆菌转化A.转化质粒和选择标记将用于转化的基因克隆到适于玉米转化的载体中。在这个实施例中使用的载体含有磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，用于转基因系的选择(Negrotto等(2000)Plant Cell Reports 19798-803)。
B.根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的制备含有植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)在YEP(酵母提取物(5克/升)，蛋白胨(10克/升)，NaCI(5克/升)，15克/升琼脂，pH6.8)固体培养基上于28℃下生长2-4天。用添加100μMAs(Negrotto等，(2000)Plant Cell Rep 19798-803)的LS-inf培养基悬浮大约0.8×109个农杆菌。细菌在该培养基中预诱导30-60分钟。
C.接种从A188或者其他适宜基因型的8-12天龄的穗中切下未成熟的胚，置于LS-inf+100μM As液体中。用新鲜的感染培养基润洗胚一次。然后加入农杆菌溶液，旋涡振荡胚30秒，使其和细菌自然沉降5分钟。然后将胚盾片一侧朝上转移到LSAs培养基中，在黑暗中培养2-3天。接下来每个培养皿20-25个胚转移到添加有头孢噻肟(250毫克/升)和硝酸银(1.6毫克/升)的LSDc培养基中，于28℃暗处培养10天。
D.转化细胞的选择和转化植物的再生将产生胚胎发生性愈伤组织的未成熟胚胎转移到LSD1M0.5S培养基中。在该培养基上选择培养物6周，在三周时进行继代培养。存活的愈伤组织转移到添加有甘露糖的Reg1培养基中。光照培养(16小时光照/8小时编制)后，将绿色组织转移到没有生长调节因子的Reg2培养基中，温育1-2周。将植物幼苗转移到含有Reg3培养基的MagentaGA-7(Magenta Corp，Chicago ILL.)盒子中，光照下培养。2-3周后，通过PCR检查植物中是否存在PMI基因以及其他的目的基因。PCR检测阳性的植物转移到温室中。
R1在玉米种子胚乳中的表达获得使用pNOV 4080转化的玉米植物自体授粉的T2或者T3代种子。pNOV 4080构建体将R1的表达靶向到胚乳中。使用碘溶液染色淀粉进行检查，观察到玉米粒中淀粉的正常积累。使用抗R1肽片段(YTPEKEKEEYEAARTELQEEIARGA)的抗体进行Western印迹分析，检测到R1的表达。也可以在过量表达R1蛋白质的转基因玉米的胚乳提取物中检测到增高的R1二激酶活性[Ritte G.，Lloyd J.R.，Eckermann N.，Rottmann A.，Kossmann J.，Steup M.，2002，PNAS，99(10)7166-7171；Ritte G.，Steup M.，Kossmann J.，LloydJ.R.，2003，Planta 216，798-801.]。
实施例3 R1转基因玉米的磷酸化淀粉从玉米中分离淀粉从玉米粒上除去胚和果皮后得到胚乳，置于冰上。向12.6克胚乳中加入60毫升缓冲液(1.25mM DTT，10mM EDTA，10％甘油，和50mMTris-HCl，pH7.0)，将混合物匀浆。匀浆产物通过一层Miracloth(Calbiochem)过滤除去细胞残渣。4℃15000g离心滤出物15分钟。通过温和抽吸将致密的白色淀粉颗粒沉淀层上方的轻淡的黄色胶状层取出，得到洁白的淀粉颗粒。得到的淀粉颗粒用缓冲液洗两次，用80％乙醇洗两次除去低分子量的储藏蛋白质，用冷丙酮洗两次，干燥。分离淀粉并在室温储藏。[Chen Mu-Forster，Chee Harn，Yuan-Tih ko，George W.Singletary，Peter L.Keeling and Bruce P.Wasserman(1994)The Plant Journal 6(2)，151-159.]通过温和酸水解淀粉样品以制备淀粉水解产物用0.5-2.5毫升0.7N的盐酸重悬淀粉(100-500mg)，置于95℃4小时。用葡萄糖测定试剂盒(Sigma)和HPLC分析对淀粉水解产物中的葡萄糖进行定量。
在葡萄糖氧化酶(来自淀粉/葡萄糖测定试剂盒(Sigma))催化的反应中淀粉水解产物中的葡萄糖被氧化为葡萄糖酸。混合物在37℃下温育30分钟。反应过程中释放的过氧化氢在过氧化物酶存在下将无色的邻联茴香胺转化为褐色的氧化型邻联茴香胺。之后加入12N硫酸终止反应，形成稳定的粉红色产物。相对于标准葡萄糖溶液，测量540纳米的吸光度，定量样品中的葡萄糖量。
将样品的一份稀释5-25倍，通过0.2微米滤膜过滤后用于HPLC分析。
使用以下条件用HPLC对样品进行分析柱Alltech Prevail Carbohydrate ES5 micron 250×4.6毫米检测器Alltech ELSD 2000泵Gilson 322注射器Gilson 215注射器/稀释器溶剂HPLC级乙腈(Fisher Scientific)和水(用WatersMillipore系统纯化)用于低聚合度寡糖(聚合度1-15)的梯度时间％水％乙腈0 15 855 15 8525 50 5035 50 5036 80 2055 80 20
56 15 8576 15 85用于高聚合度糖(聚合度20-100及以上)的梯度时间 ％水 ％乙腈0 35 6560 85 1570 85 1585 35 6510035 65用于数据分析的系统Gilson Unipoint Software SystemVersion 3.2通过对HPLC曲线中产生的峰面积进行积分并且与使用获自可靠的糖标准品的定标曲线(峰面积对重量)进行比较，对样品中的糖进行测定。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试验确定淀粉中葡萄糖残基6位磷酸化的水平向一份(100微升)温和酸淀粉水解产物样品中加入800微升含有100mM MOPS-KOH(pH7.5)，100mM MgCl2，2mM EDTA的缓冲液，置于一个小比色杯中，用80-100微升0.7N KOH中和。加入NAD(终浓度0.4mM)和2单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶起始反应，最终的检测体积是1毫升。对340纳米吸收的改变测量2分钟，从而计算反应速率。[Nielsen，T.H.，Wichmann，B.，Enevoldsen，K.，and Moller，B.L.Plant Physiol.(1994)105，111-117.]图3.淀粉完全水解后葡萄糖-6-磷酸的测定。R1玉米淀粉中磷酸化增加。从不同事件(转基因R1玉米)的玉米粒(T3代种子)中分离淀粉样品(大约100毫克)，完全水解(温和酸水解，如上描述)为葡萄糖。如上所述对水解产物中的葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸进行定量。图3显示了在不同样品中淀粉磷酸化的相对水平，这是通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试验进行测定并且针对样品中测定的葡萄糖进行标准化的。
使用上述方法对不同转化的R1转基因玉米事件进行筛选，显示在表达马铃著R1转基因的玉米中淀粉具有高水平的植物内磷酸化。从非转基因玉米中分离出的淀粉样品没有被磷酸化，因为用所述试验几乎不能检测到磷酸化。在R1玉米淀粉中观察到的磷酸化水平几乎是马铃薯淀粉(商购获得的样品)中观察到的磷酸化水平的一半。应当注意的是这一试验方法检测的只是6位上的磷酸化，淀粉中葡萄糖残基任何3位或者2位的磷酸化用这一方法无法检测出来。用三个转化事件(用I，II，III标记，以箭头表示)进一步表征R1玉米(实验在下面描述)。
31P-NMR分析测定淀粉样品中酯键接的磷酸(ester-linkedphosphate)的水平将温和酸水解的淀粉样品冷却至室温，加入100mM乙酸盐缓冲液(pH5.5)最后用2.8N的KOH中和。样品在氮气气流中吹洗。向样品中加入已知量的β-NAD。用300微升水和300微升DMSO d6溶解样品。在30℃下在DPX-300上获得光谱数据。β-NAD用作标准，用于定量样品中酯键接的磷酸。通过对峰积分进行定量。样品中磷酸酯水平的测定考虑到样品中任何污染性无机磷酸的存在。
表1.通过31P-NMR测定共价连接的磷酸。这里显示的磷酸百分比是与样品中的葡萄糖相比淀粉水解产物中存在的酯键接的磷酸的量。实验按照以上的描述进行。
该结果进一步确证了在葡萄糖-6-磷酸试验中得到的结果；在R1玉米淀粉样品中观察到的磷酸化水平达到马铃薯淀粉中观察到的磷酸化水平的一半。与上面描述的葡萄糖-6-磷酸试验方法不同的是，本方法测定的是与淀粉样品相关的总的酯键接的磷酸。
实施例4R1玉米淀粉的溶胀和溶解性来自R1玉米、非转基因玉米和转基因阴性对照玉米的淀粉样品根据如上描述制备；商购获得其他的淀粉样品。根据Subramanian等的描述(Subramanian，V.，Hosney，R.C.，Bramel-Cox，P.1994，Cereal Chem.71，2772-275.)测定淀粉样品的溶胀力，仅对其稍微改进。将1％(w/w)的淀粉与蒸馏水的悬液加热至95℃30分钟。摇动防止形成团块。混合物在3000rpm离心15分钟。仔细地将上清取出，称量溶胀后淀粉沉淀的重量，溶胀力是此湿沉淀的重量与起始干淀粉重量的比值。
图4显示了与非转基因玉米淀粉相比R1玉米淀粉的相对溶胀力。将淀粉样品的溶解性按如下进行比较。将4.5M尿素中的淀粉样品(1％w/w)在50℃下搅拌30分钟。混合物在3000rpm离心15分钟。仔细地将上清取出。通过淀粉/葡萄糖测定试剂盒(Sigma)和碘染色测量上清中存在的淀粉。图5显示了与非转基因玉米淀粉相比R1玉米淀粉的相对溶解性。图中显示了两组独立实验的结果。
图5显示了与非转基因玉米淀粉相比R1玉米淀粉的相对溶解性。
作为一个带有两个电荷的官能团，磷酸酯对水具有高亲和性；而且在与淀粉的葡萄糖链共价结合之后，磷酸基可以通过电互斥作用有助于溶胀。这样通过使玉米淀粉磷酸化，可以提高其在离子性溶剂(包括水)中的溶解性及其溶胀力(例如在水中)。R1玉米淀粉是一种磷酸化形式的玉米淀粉，而玉米淀粉通常是不被磷酸化的。因此，正如预期的那样，我们观察到R1玉米淀粉(来自表达马铃薯R1基因的玉米的T2代种子)溶胀力的提高(提高30-40％，图4)。R1玉米淀粉(来自T2代种子)的相对溶解性(图5)看起来也显著高于非转基因对照中观察到的溶解性。
R1玉米对酶促水解的敏感性(susceptibility)在模拟的消化条件下对水解的敏感性将研磨的玉米粉(在Kleco中研磨的种子)通过300微米孔径的筛子，制备用于检测的样品。样品(500毫克)在37℃下(在往复的摇床上)用5毫升的胃蛋白酶/盐酸(2000单位/毫升于0.1N盐酸中)溶液在酸性pH下处理30分钟，模拟胃消化条件。然后用氢氧化钠中和温育的反应混合物，用2.5毫升胰酶制剂(于150mM KPO4，pH7.4缓冲液中，浓度为5毫克/毫升)进行下一步消化。旋涡振荡试管，在往复摇床上，于37℃下低速振荡温育120分钟。在温育结束时向每个试管中加入7.5毫升水，旋涡振荡。24℃下，玉米粉未消化的部分在台式离心机中4000rpm离心30分钟进行沉淀，样品的上清加热到100℃15分钟，冷却，离心，取上清用于检测消化产生的总的可溶性糖(在糖链用酶完全水解后用BCA试剂测量葡萄糖)、小寡聚糖(用上面描述的HPLC分析)以及葡萄糖(BCA试剂)。从不同检测方法中得到的结果互相确证。图6中显示的是HPLC分析；该结果清楚地表明，与正常玉米粉相比，来自R1玉米粉样品的总小寡聚糖(聚合度1-7)释放增加了(10-20％)。
图6表明了在模拟的消化条件下R1玉米粉的体外可消化性。该图显示了在模拟的消化道消化过程结束时得到的葡萄糖和其他小的(小于8)寡聚糖的积累。通过对HPLC分析曲线的峰面积进行积分，对糖进行测定。
在不同的淀粉水解酶存在(体外)时对水解的敏感性使用不同来源的三种α淀粉酶和一种葡萄糖淀粉酶检测了R1玉米粉中R1玉米淀粉的可酶促消化性。将研磨的玉米粉(在Kleco中研磨的种子)通过300微米孔径的筛子，制备玉米粉样品，用于检测。对于每一种酶反应，使用在500微升100mM乙酸钠(pH5.5)中重悬的玉米粉(50毫克)。所有这些酶促消化中使用的酶量低于完全水解样品中存在的淀粉所需酶的水平。反应如图例所示在有或者没有不存在酶的预温育的条件下进行。
图7显示了R1玉米粉对淀粉水解酶的酶促水解的敏感性。对于图7A描绘的结果，玉米粉的样品在乙酸钠缓冲液中在75℃(I)、60℃或25℃(II)下预温育15分钟。预温育结束时，将样品冷却至室温，每一个反应混合物中加入10微升来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α淀粉酶(Sigma)，旋涡混和，在室温不断振荡下温育30分钟。然后在14000rpm离心反应混合物2分钟，收集上清并在95℃加热，使任何残留的酶失活，离心取上清，用0.4微米的滤膜过滤，制备用于HPLC分析(上面描述的方法)的样品。该图描绘了由于酶促水解释放的易溶的可发酵葡萄糖寡糖(聚合度＝1-3)的相对量。可发酵糖的量是由HPLC分析测定的(积分峰面积并且与用可靠的糖产生的校正曲线相比较)葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖产物量的总和。
当玉米粉样品没有加热到玉米淀粉的凝胶化温度(大约70℃，在进行预温育或者用酶温育的过程中)之上时，对水解的相对敏感性差异显著得多(图7)。
对于图7B，不同玉米粉样品对嗜热α淀粉酶(在玉米中转基因表达)的敏感性用与使用米曲霉α淀粉酶时描述的相似的方式进行测定。玉米粉样品(非转基因对照和R1玉米)与表达α淀粉酶的玉米粉混和，比例为10∶1，85℃温育90分钟(I)、3小时(I)或者24小时(II)。释放的可溶性糖用HPLC分析和定量，如前面所述。
对于图7C，通过在室温预温育15分钟后与酶混和，测定对于大麦α淀粉酶(10微升纯化的酶，蛋白质浓度为5毫克/毫升)而言非转基因的玉米和R1玉米样品(50毫克)的可消化性。如使用米曲霉α淀粉酶所述的那样进行反应。室温温育进行30分钟和3小时。图7C I显示了酶促反应后释放的可溶性葡萄糖寡糖的相对量；而一个R1玉米样品和非转基因玉米样品产生的HPLC曲线示于图7C II中。
图7D显示了与上述相似的实验的结果，该实验使用了来自黑曲霉(Aspergillus niger)的葡萄糖淀粉酶(Sigma)作为酶，非转基因的玉米或者R1玉米样品(50毫克)作为底物。酶(50或100单位)与室温下预温育的玉米粉样品(于100mM乙酸钠缓冲液pH5.5中)混和，在室温下继续进行60分钟温育。根据上面的描述，用HPLC分析释放到反应混合物中的葡萄糖。图7D I显示了酶解反应后产生的葡萄糖的相对量；而R1玉米样品和非转基因玉米样品的HPLC曲线示于图7D III中(100单位的酶)。
图8显示了温育时间和酶浓度对R1玉米淀粉水解速率的影响实验按对图7A的描述进行。预温育和温育温度是25℃(室温)。用于检测温育时间对水解影响的酶的量(米曲霉的α淀粉酶)是500微升反应体积中10微升酶(图8A)。图8B中显示实验的温育时间是30分钟。如上所示，用亲水官能团(例如R1玉米淀粉中的磷酸酯)共价衍生化淀粉，可增加其在含水介质中的溶胀和溶解性，使改良的淀粉分子更易被水解酶接近。因此，使用这种衍生化形式的淀粉不仅会提高可被酶降解的淀粉的比例，而且还很可能可以提高水解的速率。在这里使用通过在玉米胚乳中表达马铃薯R1蛋白质基因而在转基因玉米植物中制备的磷酸化玉米淀粉对这个假设进行检验。
如图6所示，与正常的玉米淀粉(非转基因)相比，R1玉米淀粉(在玉米粉中)相对更易消化(通过体外检测测定)。在这个体外检测中，已尽力模拟了单胃动物消化道中的酶促反应条件。发现在R1玉米样品和对照非转基因玉米之间有10-15％以上的差异。
与玉米淀粉相比，R1玉米淀粉更易于被所有用于检测的淀粉水解酶攻击(图7和8)。这再次符合这样的思想被磷酸化的R1淀粉，在水溶液中更加溶胀和水化(与未磷酸化的正常玉米淀粉相比)，使得R1淀粉分子更易受到水解酶的进攻。综合图7和8中描述的实验，表明玉米粉中的R1玉米淀粉比非转基因的对照水解速率更快。因此，可以使用比非转基因对照淀粉所需的更少的酶量和/或更短的温育时间从R1玉米淀粉中释放出相同量的可发酵/可溶性葡萄糖寡糖。
还应该注意，当玉米粉样品没有加热到玉米淀粉的凝胶化温度(大约70℃，在进行预温育或者用酶温育过程中)之上时，对水解的相对敏感性差异就更为显著(图7)。
实施例5
R1玉米淀粉的可发酵性发酵过程使用锤式粉碎机(Perten 3100)，将玉米粒研磨为精细的粉末(75％以上的重量可以通过0.5毫米的筛子)得到转基因和非转基因玉米的玉米粉样品。使用Halogen水分分析仪(Metler)测定玉米粉样品的水分含量。典型地，样品的水分含量在11-14％(w/w)之间。玉米粉样品称重装入17×100毫米聚丙烯无菌一次性培养管中。大致的干燥样品重量是每管1.5克。每管中加入4毫升水，将pH调整为5.0。每个样品中接种每克玉米粉大约1×107的酵母。[酵母(EDTFerminol Super HA-Distillers活性干酵母)种菌培养物在酵母起始培养基(每300毫升含有50克M040麦芽糖糊精，1.5克酵母提取物，0.2毫克ZnS04，100微升AMG300葡萄糖淀粉酶和ml四环素(10毫克/毫升))中生长。将500毫克酵母接种到培养基中，30℃温育16小时，不断振荡]。接种后加入0.5毫升酵母提取物(5％)、1.5毫升水、0.03毫升0.9M硫酸和葡萄糖淀粉酶(黑曲霉)Sigma A7095-50ML。最后的发酵混合物调整为33％固体。称重发酵管，在30℃温育。每间隔一段时间对管进行称重(至少每24小时一次)，不混和。定期(每24小时)从发酵管中取样(混和后)，用HPLC分析测定乙醇的产量(如下所述)。
对发酵产物进行HPLC分析。使用该方法对玉米发酵工艺中产生的乙醇和其他发酵产物进行定量。使用配备有二元泵和温控自动进样器的Waters 2695 Alliance HPLC系统；Waters 2414折射率检测器以及Eppendorf的柱加热器用于分析。
层析条件层析柱类型Bio-Rad Aminex HPX-87H(300×7.8毫米)层析柱温度50℃检测器温度35℃样品温度6-11℃移动相0.005M硫酸(在HPLC级水中)流速0.6毫升/分钟等度洗脱运行时间30分钟制备并使用五点定标曲线，以对乙醇和其他发酵产物进行定量。为了定标，将各种不同的化合物(麦芽糖糊精M100(聚合度4+)、麦芽三糖(聚合度3)、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乳酸、甘油、乙酸和乙醇称重或者用移液管吸入到100毫升容量瓶中，用含0.02％叠氮化物的HPLC级水稀释到刻度。标准注射25微升的Std-0％；Std-5％；Std-10％；Std-15％和Std-20％，以制备五点定标曲线。Std-0是空白。样品注射25微升的发酵混合物(14000rpm离心5分钟并用0.2微米滤膜过滤后)。
图9A和9B显示了从表达马铃薯天然R1基因的转基因玉米样品中得到的结果；这些结果与非转基因对照比较。在乙醇生产方面我们发现转基因样品在发酵工艺中表现更好(24小时时大约9-14％)；这一趋势持续了发酵的至少72小时，尽管随着温育时间的延长，这一趋势有所下降。与这一发现相一致的是我们还发现转基因R1玉米的每单位干重的百分比重量改变也高于对照(1-3％)。
这一发现与我们的假设，即由于磷酸化形式的玉米淀粉在水中更高的溶胀力和溶解性导致其可以容易地被水解酶靶向，是相一致的。这会使磷酸化的淀粉与正常的未磷酸化的淀粉相比，以更快的水解速率和/或使用更少量的酶被有效水解。正如这里所证明的，可发酵糖的有效水解和有效释放使乙醇生产的产量提高。这一结果可以外推到其他种类的发酵产物(乳酸、甘油等)。
实施例6来自表达经过玉米密码子优化的合成马铃薯R1基因的转基因玉米的磷酸化淀粉从玉米粒中分离淀粉的过程、分离淀粉样品的温和酸水解、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸测定按照前面的描述进行。
图10A提供了淀粉完全水解后对葡萄糖-6-磷酸的测定。R1(合成基因)玉米淀粉的磷酸化提高。从不同事件(转化了合成R1基因的玉米)的玉米粒(T1代种子)中分离出的淀粉样品(大约100毫克)完全水解(温和酸水解，如前面所述)为葡萄糖。按照上面的描述对水解产物中的葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸进行定量。图10A显示了不同样品中淀粉的相对磷酸化水平，这是通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试验进行测定并且针对样品中估计的葡萄糖进行标准化的。
使用以上描述的方法对不同的合成R1转基因玉米事件进行筛选，结果表明在表达马铃薯R1(合成的)转基因的玉米中淀粉具有高水平的植物内磷酸化。从非转基因玉米中分离出的淀粉样品没有磷酸化，因为用这一试验几乎不能检测到磷酸化。在表达经过玉米密码子优化的合成R1玉米淀粉中观察到的磷酸化水平显著高于在表达天然马铃薯R1基因的转基因玉米中观察到的磷酸化水平。应当注意的是这一试验方法检测的只是6位上的磷酸化，淀粉中葡萄糖残基任何3位磷酸化用这一方法无法检测出来。
HPLC分析定量和检测葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸为了在淀粉样品的水解产物中检测并定量葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-3-磷酸，使用由以下部分组成的Dionex DX-500 BioLC系统进行HPLC分析具有脱气选择的GS-50梯度泵；ED50电化学检测器；AS-50热室；AS-50自动上样器层析条件如下1.层析柱类型CarboPac PA 10 Analtyical(4×250毫米)2.检测器温度室温3.样品温度室温4.洗脱剂A水B300mM NaOH C1M NaOAC5.流速1.0毫升/分钟6.程序时间(分钟)A(％) B(％)C(％)0 87.5 12.5 0.0015.0 85.50 12.502.0015.10 85.50 12.502.00
25 0.00 60.0040.0030.00.00 60.0040.0033.50.00 0.00 100.0036.587.50 12.5 00.0043.0(结束) 87.50 12.5 00.007.检测(ED40)脉冲电流测定法，金电极。ED40的波形时间(秒) 电势(伏) 积分0.0 0.050.20 0.05 开始0.40 0.05 结束0.41 0.750.60 0.750.61 -0.151.00 -0.150.20D-葡萄糖-6-磷酸二钾盐和葡萄糖-1-磷酸(Sigma)用作标准品。制备和使用五点定标曲线，对葡萄糖-6-磷酸的水平进行定量。
图10B显示一些来自转基因和非转基因的玉米以及马铃薯的淀粉样品水解产物的Dionex HPLC分析洗脱曲线。靠近葡萄糖-6-磷酸峰的第二个峰很可能是由于水解产物中存在葡萄糖-3-磷酸产生的(这一层析过程能够将葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-1-磷酸明显分离开)。与表达天然马铃薯R1基因的转基因玉米中分离的淀粉样品相比，在表达经过密码子优化的合成R1基因的转基因玉米中(T1代玉米种子的遗传分离的玉米粒)观察到更高水平的淀粉磷酸化。
所有的出版物、专利以及专利申请在这里引用作为参考。尽管在前面说明书中已经结合本发明的某些优选实施方案描述了本发明，并为了举例说明本发明给出了许多细节，但是对于那些本领域的技术人员显然的是，本发明可以有其他的实施方案，并且在不偏离本发明基本原则的前提下可以对这里描述的某些细节进行相当大的改变。
权利要求
1.一种生产改良的玉米淀粉的方法，该方法包括a)用含有编码R1的核酸的表达盒转化玉米细胞；b)产生所述的改良的淀粉。
2.由权利要求1的方法产生的改良的玉米淀粉。
3.包含权利要求2的磷酸化淀粉的动物饲料。
4.一种制备发酵产物的方法，该方法包括a)制备含有权利要求2的磷酸化淀粉的谷物；b)向发酵反应中加入来自a)的产物。
5.权利要求4的方法，其中的发酵产物是乙醇、乳酸、乙酸或者甘油。
6.改善淀粉在单胃动物中的可消化性的方法，该方法包括用含有表达盒的谷物饲喂所述的动物，其中所述表达盒含有编码R1的核酸。
7.提高谷物中可发酵/可水解淀粉的方法，该方法包括向所述的谷物中插入含有编码R1的核酸的表达盒。
8.在粗淀粉发酵中使用权利要求2的改良淀粉的方法。
9.制备水解的淀粉产物之溶液的方法，该方法包括在可激活R1多肽的条件下处理含有淀粉颗粒的植物或者植物部分，由此加工淀粉颗粒以形成含有水解的淀粉产物的水溶液。
10.权利要求9的方法，该方法进一步包括分离水解的淀粉产物和/或发酵水解的淀粉产物。
11.包含序列编号1的核酸。
全文摘要
本发明涉及改良的淀粉以及其生产和用途。该淀粉具有改变的粘度性质和改变的磷酸酯含量。本发明还涉及SEQ ID NO1所示核酸分子，该核酸分子编码密码子优化形式的玉米R1蛋白质。
文档编号A23K1/175GK1826412SQ200480020812
公开日2006年8月30日 申请日期2004年5月24日 优先权日2003年5月22日
发明者M·B·拉纳汉, S·S·巴苏 申请人:辛根塔参与股份公司