专利名称：一种植物组培双层培养增殖方法
技术领域：
本发明涉及到一种植物组培双层培养增殖方法，属于植物的人工繁殖和栽培方法技术领域。
背景技术：
植物组织培养技术近几年发展很快，已经成为名、特、稀、优植物工厂化育苗技术的重要手段之一.同时也是植物基因工程技术的重要环节。植物组织培养的传统方法又分为茎尖消毒、诱导培养、增殖培养、生根培养、移栽定植等步骤，其中增殖培养是决定植物组培效率的关键步骤，传统方法是将诱导培养的带芽茎段接种到固体培养基中增殖、生根，由于植物材料遗传背景的差异，有些植物增殖分化周期较长，不能实现快速、规模化的理想增殖目标，如美国开心果、牡丹、木本植物等。使用传统方法的缺陷是，随着培养时间的延长(25天以上)，培养容器中水分减少，容器中的湿度降低，导致培养材料出现干尖，落叶，叶片变黄，培养材料出现生长缓慢，分化受限等不良现象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便的植物组培双层培养增殖方法，为生物技术的应用拓展或延伸新的技术手段。
本发明的技术方案是这样实现的这种植物组培双层培养增殖方法，其特征在于A、固体培养阶段将培育0.3-0.5厘米以上的试管苗茎段，接种到如下重量比例的固体增殖培养基中MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，糖30g/l，琼脂6g/l加入蒸馏水至1000l，于25-27℃培养18-20天；B、双层培养阶段在步骤A的培养容器内加入如下比例的液体增殖培养基MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，加入蒸馏水至1000ml，于25-27℃培养10天以上即可用于生根。
所述的植物组培双层培养增殖方法，步骤A中固体培养基的制备方法是分别取MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，使用糖30g，琼脂6g，加入蒸馏水至1000ml摇匀后分装到培养瓶中，每瓶分装30毫升，用封口膜封好，放进灭菌器进行高压消毒备用。
所述的植物组培双层培养增殖方法，步骤B中液体培养基的制备方法是分别取MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，加入蒸馏水至1000ml，高压消毒备用。
所述的植物组培双层培养增殖方法，步骤A中固体培养阶段的培养方法包括将0.3～0.5cm的带叶芽的茎段植物材料，接种于装有固体培养基的培养容器，置于光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下，于25-27℃培养18-20天。
所述的植物组培双层培养增殖方法，步骤B中液体培养阶段的培养方法包括在培养容器中加入5-15ml的液体培养基，置于光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下，于25-27℃培养10天以上。
采用本发明的植物组培双层培养增殖方法操作简单、使用范围比较广，对木本植物，草本植物，药用植物及禾本科植物均有很好的效果。与传统的增殖组培方法相比，克服了植物材料在增殖培养过程中，因失水导致植物材料生长缓慢，干尖，落叶等不良现象。补充液体培养基一方面节省了琼脂和蔗糖，同时还减少了材料接种过程中的污染，提高了培养效果，苗分化数较传统方法增加3-8个，降低成本20％以上。尤其对一些国外引进的名优资源，使用该方法以高效的增殖显出优势，为名优植物资源保存和利用提供了有利的技术保障。
具体实施例方式
下面结合名优资源植物的增殖培养实例说明本发明的具体实施方式
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(1)培养器皿选取直径5-9cm，高度的7-10cm的培养瓶，使用前冲洗干净，用塑料膜封口，经高压消毒后备用。
(2)固体培养基制备分别取MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，糖30g，琼脂6g，加入蒸馏水至1000ml，摇匀后分装到培养瓶中，每瓶分装30毫升，用封口膜封好，放进灭菌器进行高压消毒。
(3)液体培养基制备分别取MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，加入蒸馏水至1000ml，分装到500毫升三角瓶，用封口膜封好，放进火菌器进行高压消毒上述MS大量，MS微量，B5有机培养基的基本配方来源于《植物组织培养法》-孙敬三著。
(4)高压消毒将封好的固体培养基和液体培养基进行湿热热灭菌，压力1.1公斤/厘米2，温度121℃的条件下，高压灭菌时间为20分钟。待压力下降到50℃以下时，在进行放气，取出已灭菌培养基，及时放进接种室备用。
(5)器械的准备将手术刀、剪刀、枪型镊子、滤纸等，用牛皮纸分别包好，采用高压消毒后备用。
实施例1、四倍体刺槐的增殖培养(1)固体培养在无菌条件下，剪取组培四倍体刺槐茎段0.5cm，接种到直径5cm，瓶高9cm的培养瓶中，每瓶4个，用封口膜封好，放进培养室培养，25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的条件下培养18天；(2)液体培养将培养20天的四倍体刺槐放到无菌条件下，分别加入10毫升液体培养基，用封口膜封好，置于25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下培养10天以上，较传统方比增加丛生芽3-5个，芽苗高2-5厘米，苗生长健壮。
实施例2、霍霍巴的增殖培养在无菌条件下，剪取霍霍巴茎段0.8cm，接种到直径6cm，瓶高10cm的培养瓶中，每瓶5个，用封口膜封好，置于25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下培养20天；将霍霍巴于无菌条件下分别加入10毫升液体培养基，用封口膜封好，置于25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下培养10天以上，单芽增殖数较传统方比增加5-10个，丛生芽2-5厘米，即可用于生根。
实施例3、油麻的增殖培养在无菌条件下，剪取油麻茎段0.3-0.5cm，接种到直径7cm，瓶高10cm的培养瓶中，每瓶4个，用封口膜封好，置于25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下培养20；将油麻放到无菌条件下，分别加入10毫升液体培养基，用封口膜封好，置于25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下培养10天以上，单芽增殖数较传统方比增加4-8个，丛生芽高2-5厘米，即可用于生根。
实施例4、草樱花的增殖培养在无菌条件下，剪取草樱花茎段0.5-0.8cm，接种到直径6cm，瓶高10cm的培养瓶中，每瓶4个，用封口膜封好，放进培养室培养，置于25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下培养20天；将草樱花放到无菌条件下，分别加入10毫升液体培养基，用封口膜封好，置于25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下培养10天以上，单芽较常规相比增殖4-8个，丛生芽高3-5厘米，即用于生根。
实施例5、水稻转基因苗的增殖培养无菌条件下，将需要进行分化的0.3-0.5cm水稻转基因苗，接种到直径5cm，瓶高10cm的培养瓶中，每瓶4个，用封口膜封好，置于25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下培养20天；将培养水稻无菌苗放到无菌条件下，分别加入10毫升液体培养基，用封口膜封好，置于25～27℃，光照强度1500～3000lx，光照时间8-12h/天的环境条件下培养10天以上，较传统方法相比，单芽增殖数增3-5个，芽高3-5厘米，生长健壮。
本发明列举的实施例旨在进一步地阐述植物组培双层培养增殖方法，而不对本发明的范围构成任何限制。本发明实例和经由本发明权利要求书1、2、3、4、5所述的方法均可得到增殖数量高，生长健壮的植物组培分化苗。
权利要求
1.一种植物组培双层培养增殖方法，其特征在于A、固体培养阶段将培育0.3-0.5厘米以上的试管苗茎段，接种到如下比例的固体增殖培养基中MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，糖30g/l，琼脂6g/l，加入蒸馏水至1000l，于25-27℃培养18-20天；B、双层培养阶段在步骤A的培养容器内加入如下比例的液体增殖培养基MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，加入蒸馏水至1000ml，于25-27℃培养10天以上即可用于生根。
2.根据权利要求1所述的植物组培双层培养增殖方法，其特征在于步骤A中固体培养基的制备方法是分别取MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，使用糖30g，琼脂6g，加入蒸馏水至1000ml，摇匀后分装到培养瓶中每瓶分装30毫升，用封口膜封好，放进灭菌器进行高压消毒备用。
3.根据权利要求1所述的植物组培双层培养增殖方法，其特征在于步骤B中液体培养基的制备方法是分别取MS大量100ml，MS微量10ml，B5有机10ml，加入蒸馏水至1000ml，高压消毒备用。
4.根据权利要求1所述的植物组培双层培养增殖方法，其特征在于步骡A中固体培养阶段的培养方法包括将0.3～0.5cm的带叶芽的茎段植物材料，接种于装有固体培养基的培养容器，置于光照强度1500～3000lx，光照时间12h的环境条件下，于25-27℃培养18-20天。
5.根据权利要求1所述的植物组培双层培养增殖方法，其特征在于步骡B中液体培养阶段的培养方法包括在培养容器中加入5-15ml的液体培养基置于光照强度1500～3000lx，光照时间12h/天的环境条件下，于25-27℃培养10天以上。
全文摘要
本发明提供一种操作简便的植物组培双层培养增殖方法，为生物技术的应用拓展或延伸新的技术手段。这种植物组培双层培养增殖方法，其特征在于A、固体培养阶段将培育0.3－0.5厘米以上的试管苗茎段，接种到如下重量比例的固体增殖培养基中MS大量100ml，MS微量10ml，B
文档编号A01H3/02GK1771795SQ20051001297
公开日2006年5月17日 申请日期2005年11月14日 优先权日2005年11月14日
发明者王玉珍, 罗景兰, 史印山, 尤亚伟, 刘香玲 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所