专利名称：油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因及其在油菜中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因序列及其在油菜中的应用。
背景技术：
丙酮酸脱氢酶系(PDC)广泛地分布于微生物、植物和哺乳动物中。在动物中这个复合体由三个酶组成丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酸转乙酰酶(E2)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3)。丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA是一个不可逆步骤，处于代谢途径的分支点，是连接酵解和三羧酸循环的中心环节，因此受到严密的调节控制。对丙酮酸脱氢酶复合体的调控主要通过激酶丙酸酸脱氢酶激酶(PDK)或磷酸酶丙酸酸脱氢酶脂酶(PDP)的磷酸化或去磷酸化作用完成。PDK因调控PDC的活性也参与了多种生理反应及发育过程。哺乳动物中存在有四种不同的PDK(分别称为PDK1，PDK2，PDK3，PDK4)，PDK1-4通过不同的生化活性、底物特异性磷酸化位点及组织特异的表达模式来实现不同的调节方式和目的；此外，PDK之间形成的异源二聚体可能也是一种活性调节方式。目前对植物PDK的研究相对更滞后一些，主要还是基于动物的研究结果。植物PDK的一些同源基因也是通过与动物的序列信息比较分析克隆，植物中只有拟南芥和玉米中分离了此类基因。但是在本发明申请之前，没有人公开或发表过油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因序列及其在油菜中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因及其在油菜中的应用。
本发明的目的是这样实现的1、油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因(1)油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因(BnPDK1)主要具有编码蛋白激酶催化区的核苷酸序列和线粒体定位的序列SEQ ID NO1。
(2)克隆该基因的方法包括下列步骤①取油菜mRNA，用Strategene公司ZAPII-cDNA Synthesis kit按出厂商建议建立油菜cDNA文库；②设计特异引物进行PCR扩增，得到了基因的全序列。
2、油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因在油菜中的应用方法(1)提供一种载体，它含有启动子和翻译控制件。这种表达载体可以从商业途径获得，常用的载体包括质粒，噬菌体，病毒等，但最常见的首选是质粒。
(2)提供一种可在植物中表达的宿主菌，本方法优先的是农杆菌，更优选的是农杆菌LBA4404。
(3)提供一种将所述载体导入植物细胞的方法，如基因枪注射法，细菌导入法；本方法优选农杆菌导入法，如农杆菌LBA4404油菜子叶柄导入法。
(4)提供一种含该丙酮酸脱氢酶激酶基因的载体转化的植株；在本方法中，上述植株选自油菜。
(5)提供一种能抑制表达油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因的转基因油菜的方法，包括下列步骤①用两种引物即P5和P3作引物组合(P5CGGTCGACATGATATTTCCTAAGAGCTTGG；P3CGGTCGACTCAGGGCAAAGGCTCTTGTGAATC)，以cDNA文库作为模板DNA，通过PCR方式合成全长的BnPDK1。限制性内切酶sal1消化的DNA片段克隆到质粒pMD中，其插入片段经DNA测序鉴定。质粒含有的编码BnPDK1全长367氨基酸的序列。
②将含有丙酮酸脱氢酶激酶基因的载体转染农杆菌LBA4404，培养农杆菌于YM液体培养基，并将无菌苗在农杆菌菌液中浸泡。
③在加Kan的选择培养基筛选阳性克隆。
在本发明的具体实施例中，植株无菌苗选自油菜，通过选择培养基最后筛选到丙酮酸脱氢酶激酶抑制表达的植株，植株表现出早开花性状，这样缩短了植物生长周期，并且种子重量和含油量增加。
本发明所述的“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。
本发明所述的“植物细胞”是指植物的各种未成熟胚，或愈伤组织，或悬浮细胞，或原生质体。这些植物细胞在适当的条件下均能再生成植物。
克隆本发明中所述的丙酮酸脱氢酶激酶基因的方法是本领域中常用的方法。提取mRNA的方法也有多种成熟的技术，试剂盒可从商业途径获得，而构建cDNA文库也是常用的分子生物学技术。构建本发明中所述的载体和将载体转染入植株也是本领域中常用的方法。其中所涉及的质粒，转染用媒体和试剂可从商业途径获得。
本发明具有下列优点和积极效果1、本基因具有组氨酸蛋白激酶的保守序列。
2、本应用能制备一种能抑制表达丙酮酸脱氢酶激酶基因的转基因油菜，该转基因油菜表现为早开花性状，并且生长期减少，种子产量和含油量增加。
图1-植物表达载体图Kan，Str分别为卡那抗性和链霉素抗性，35S为启动子，基因BnPDK1为克隆基因插在35S启动子之后。
图2-PCR结果检测图2-8样为转基因植株，1为对照野生植株，结果显示转基因植株3，5，7，9成功导入了反义基因。
图3-Northern结果分析图2-8样为转基因植株，1为对照野生植株，结果显示转基因植株基因表达量小于野生植株。
具体实施例方式
通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1--基因的克隆及测序利用引物从cDNA文库中分离到一序列，经测序得到BnPDK1。
1、提取油菜mRNA。
RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)液氮研磨100mg材料。
(1)加1mlTRIZOL，室温放置5min。
(2)加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。
(3)12000g，15min，4摄氏度。取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀后室温放置15min。
(4)12000g，15min，4摄氏度。去上清，加入1ml70％乙醇。
(5)7500g，7min，4摄氏度。去上清，空气干燥。
(6)DEPC-H2O溶解。
2、用Strategene公司ZAPII-cDNA Synthesis kit按出厂商建议构建油菜cDNA文库。
3、用两条引物(P5/P3)以文库为模板，通过PCR方式(94摄氏度53min，94摄氏度1min，65摄氏度50s，72摄氏度1min30s，30个循环，72摄氏度10min)合成BnPDK1的全长。
实施例2--载体构建将合成的全长BnPDK1 DNA片段用限制性内切酶sal1消化后，反向克隆到质粒PMD中(如图1示)，其插入片段经DNA测序鉴定。pBnPDK1含有的编码BnPDK1全长367个氨基酸的序列。
实施例3--植株的转化与筛选油菜的农杆菌转化1、无菌苗的准备种子经70％乙醇30sec，ddH2O洗，5％NaClO浸泡30min，ddH2O洗5次后，平铺于MS于培养基(PH 5.8)中，琼脂浓度0.8％。油菜无菌苗备用。
2、油菜子叶柄转化接种LBA4404(含pMD-BnPDK1)于固体培养基YM上，两天后挑取单菌落于50ml YM液体培养基中培养。取5天无菌苗子叶柄，于菌液中浸泡10min。置于共培养基上培养2-3天。
3、共培养结束后，用液体MS培养基洗子叶柄两次，再用加Carb的液体MS培养基洗一次。子叶柄转移至选择培养基上。每隔15天继代1次。
4、待再生芽长至1cm时切取小芽移至生根培养基上，用加Carb与Kan的固体MS培养基筛选。
5、苗生根后，移栽入蛭石。10天后移栽下土钵。
实施例4--转化植株的核酸分析-PCR鉴定1、用于PCR的转化植株总DNA的提取(1)70％乙醇擦洗叶片，称取大约100mg(2)加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris-Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH 7.5)，室温快速研磨。
(3)1.5ml Ependorff管中涡旋混匀5～10s(4)12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，-20摄氏度沉淀过夜。
(5)12000rpm，15min，室温。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。
(6)12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。
(7)加无菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。
(8)以总DNA为模板，进行PCR。
2、PCR程序PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，反应的时间和温度作如下94摄氏度53min94摄氏度1min，65摄氏度50s，72摄氏度1min30s，30cycles72摄氏度10min 结果如图2示实施例5--转化植株的核酸分析-Northen杂交1、RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)液氮研磨100mg材料。
(1)加1ml TRIZOL，室温放置5min。
(2)加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。
(3)12000g，15min，4摄氏度。取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温放置15min。
(4)12000g，15min，4摄氏度。去上清，加入1ml70％乙醇。
(5)7500g，7min，4摄氏度。去上清，空气干燥。
(6)DEPC-H2O溶解。
2、RNA电泳1.2％琼脂糖电泳3、Northen杂交DNA探针的32P标记(1)于第一个1.5mlEP管中按下列顺序加样配制反应混合液10XPCR Reaction Buffer 2.0ulMgCl2(25mM)1.2ulPrimer P5(10uM) 0.2ulPrimer P3(10uM) 0.2uldNTP(dATP，dGTP，dTTP each 1.5mM) 2.0ul32P-dCTP(60u Ci)6.0ul65摄氏度3min，置于室温。
(2)于第二个管中加入DNA模板3.0ul(128ng)加入7.5ul，混匀，煮沸3min，置于冰上。
(3)将2ul用冰预冷的稀释Taq DNA Polymerase(1U/ul)和dNTP及引物混合物迅速加入到变性的模板DNA中，总反应体积21ul。
(4)混合物置42摄氏度反应30min。
(5)加入4ul 0.5M EDTA(pH 8.0)于探针反应混合液中终止反应。放射性标记的探针过Sephades R-25M柱中纯化。该柱子事先用STE溶液(980ul TEpH 7.5+20ul 5.0M NaCl)平衡。分管收集用STE溶液洗脱的探针，合并2管放射性比活性最高的洗脱液作为杂交用探针。
4、预杂交含有RNA的尼龙膜，先用3XSSC(10XSSC1.5M NaCl和0.15M柠檬酸钠，pH 7.0)湿润，将膜正面朝上，置于杂交管中。鲑鱼精子DNA(ssDNA)100ul(10mg/ml)煮沸5min，置于冰上10min，加入到10ml预杂交液(同杂交液成分相同，为0.5M Na2PO4pH 7.4，7％SDS)中，65摄氏度预杂交2~3小时。
5、杂交将探针加入新换的10ml杂交液中，65摄氏度过夜。
6、洗膜1XSSC，0.1％SDS，65摄氏度，15～30min，2次。
0.1XSSC，0.1％SDS，65摄氏度，15～30min，2次。
7、放射自显影将膜用保险膜包裹，用盖革计数器检测膜上的放射性水平，置暗室中进行X光片的放射性自显影。
X光片的放射自显影结果如图3示序列表<110>中国农科院油料作物研究所<120>油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因及应用<160>1<210>1<211>1104<212>DNA<213>油菜<400>
ATGGCGGTGA AGAAGGCTAG CGAGATGTTT TCGAAGAGCT TGATCGAGGA CGTTCACAGA 60TGGGGATGCA TGAAGCAGAC GGGCGTGAGC CTCAGGTACA TGATGGAGTT CGGGTCCACT 120CCCACTGAGA GGAACCTCCT GATCTCGGCG CAGTTTCTTC ACAAGGAGCT TCCGATTCGG 180ATCGCGAGGC GTGCGATCGA ACTCGAGACG CTGCCTTATG GCCTCTCTGA GAAACCTGCC 240GTCTTGAAGG TAAGAGATTG GTATGTGGAG TCATTCAGGG ACATGAGAGC ATTTCCTGAG 300ATCAAGGATA CTGCTGATGA GAAAGAGCTC ACACAGATGA TTAAGGCCGT CAAAGTAAGG 360CACAACAACG TGGTTCCCAT GATGGCTCTT GGTGTGAACC AGCTGAAGAA AGGAATGAAA 420CTCTACGAAA AACCTGATGA GATTCATCAG TTTCTTGATC GCTTCTACTT GTCGCGTATA 480GGAATCCGTA TGCTTATCGG GCAGCATGTT GAGTTGCACA ATCCAAACCC ACCACTTCAC 540ACTGTGGGTT ACATACACAC CAAGATGTCT CCTATGGAGG TGGCAAGGAA TGCTAGTGAA 600GATGCAAGGT CGATTTGTTT CAGAGAGTAT GGTTCTGCTC CGGAGATAAA CATATATGGC 660GATCCAAGTT TCACCTTTCC GTATGTACCA ACCCATTTGC ATCTTATGGT GTATGAGCTA 720GTCAAGAACT CTCTACGTGC TGTCCAAGAG CGATTTGTTG ACTCTGATAG GGTTGCACCA 780CCAATCCGTA TCATTGTTGC TGATGGAATC GAAGATGTTA CAATAAAAGT CTCAGATGAA 840GGTGGAGGTA TACCGAGAAG CGGTCTCCCC AAAATATTCA CCTATCTTTA CAGCACTGCA 900AGAAACCCGC TTGAAGAAGA TGTGGACTTG GGAACAGCTG ATGTACCCGT GACAATGGCT 960GGTTATGGTT ATGGTCTGCC AATTAGTCGC TTGTATGCTC GATACTTTGG TGGAGATTTG 1020CAGATCATAT CCATGGAAGG ATACGGGACT GATGCTTACT TGCACTTGTC TCGTCTTGGA 1080GATTCACAAG AGCCTTTGCC CTGA110权利要求
1.一种油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因(BnPDK1)，其特征在于具有编码蛋白激酶催化区的核苷酸序列和线粒体定位的序列SEQ IDNO1。
2.一种油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因在油菜中的应用，其特征在于(1)提供一种载体，它含有启动子和翻译控制件；(2)提供一种可在植物中表达的宿主菌；(3)提供一种将所述载体导入植物细胞的方法；(4)提供一种含该丙酮酸脱氢酶激酶基因的载体转化的植株；(5)提供一种能抑制表达油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因的转基因油菜的方法。
全文摘要
本发明公开了一种油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因及其在油菜中的应用，涉及基因工程技术领域。本基因具有编码蛋白激酶催化区的核苷酸序列和线粒体定位的序列SEQ ID No1。本基因在油菜中的应用包括(1)提供一种载体，它含有适当的启动子和翻译控制件；(2)提供一种可在植物中表达的宿主菌；(3)提供一种将所述载体导入植物细胞的方法；(4)提供一种含该丙酮酸脱氢酶激酶基因的载体转化的植株；(5)提供一种能抑制表达油菜丙酮酸脱氢酶激酶基因的转基因油菜的方法。本转基因油菜表现为早开花性状，并且生长期减少，种子产量和含油量增加。
文档编号A01H5/00GK1772906SQ20051001949
公开日2006年5月17日 申请日期2005年9月27日 优先权日2005年9月27日
发明者华玮, 王汉中, 李荣俊 申请人:中国农业科学院油料作物研究所