专利名称：：R基因作为选择标记在植物转化中的用途和同种源基因在植物转化中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物转化领域，特别是茄科植物(5Wa"flceae)优选马铃薯的植物转化。
背景技术：
：自/人上世纪70年代末和80年代初发现农杆菌(JgroZ^"er/wwspp.)的Ti质粒(胂瘤诱导质粒)可以用作植物遗传工程中的载体后，人们就已经知晓使用转化细菌如农杆菌进行植物的转化以获得表达目的异源基因或基因片段的转基因植物。野生型的质粒诱导植物细胞产生肿瘤细胞，但是可以将其修饰使得其可以携带外源基因构建体进入细胞而不必使受体细胞肿瘤化。在肺瘤诱导期间，被称为T-DNA(转移DNA)的Ti质粒的特异性片段整合到宿主植物核DNA中。在植物的遗传工程中，所述T-DNA被修饰并携带待整合到植物DNA上的外源基因构建体，由此可以获得转基因植物。用于获得转基因植物的转化过程通常包括用转化细菌感染植物细胞，所述转化细菌通常包括基本无致瘤性的农杆菌林，所述细菌带有包含T-DNA载体构建体并允许所述构建体转移进入植物细胞基因组的重组核酸，所述构建体主要包含希望在最终的转化植物中表达的所需核酸、基因或基因片段，和选择性标记核酸或选择基因。此所需的外源基因和标记通常位于质粒或载体的T-DNA片段中，其是与至少一个同向重复侧面相接，或位于两个不完全相同(imperfect)的同向重复(最通常长度为24个碱基对，称为T-DNA边界)之间的DNA。外源基因/选择基因构建体转移进入植物细胞发生在细菌vir基因(位于相同或不同的质粒上)参与调节T-DNA/基因构建体转移重复的缺口，由此在T-DNA边界^^质粒中切下T-DNA构建体并将其插入到植物基因组中。通过使由此处理的植物细胞在适当的环境中生长，可以再生出完整的植物，其中部分植物带有所需的基因。为了在未转化细胞的背景中选择所需转化的细胞，将编码所述选4奪基因的DNA和使其表达的工具与T-DNA上的目的基因物理连接，从而可以回收转化体。T-DNA中存在所述选择或标记序列通常被视为有效回收的绝对条件；否则需要筛选数万乃至数十万的假定转化体以确定所需异源基因的存在和功能性插入。与之相反，假定转化体通常在选择性培养基或选择性压力下生长，这适合所选择的选择性标记赋予转化细胞选择性优点，从而使其超过最初过剩存在的未转化的细胞。历史上，植物选择标记是在表达后对加入到再生培养基中的选择性试剂产生抗性的显性基因，但其本身不是细胞生长所必需的。将此选择性试剂(如抗生素、除草剂、氨基酸或氨基酸类似物)以毒性浓度加入到植物或植物培养基中。在植物转化中最广泛使用的选择性标记或选择基因是，EP131623中所述的提供对选择性试剂卡那霉素抗性的细菌新霉素磷酸转移酶基因(nptl、nptll和nptIII基因)和EP186425中所述的提供潮霉素抗性的细菌aphIV基因。EP275957公开了来自绿色产色链霉菌(S化e;tom;;c^vzW^c/7/'owoge"es)提供对除草剂草铵磷(phosphinotricin)抗性的乙酰转移酶基因的用途。EP218571中提到了提供对除草剂草甘膦相对抗性的植物基因。所述抗性是基于编码对N-磷酸曱基甘氨酸相对耐受的5-烯醇丙酮莽草酉吏-3-石舞酸酉旨合醇(5-enolshikimate-3隱phosphatesynthase(EPSPS))的基因的表达。某些氨基酸如赖氨酸、苏氨酸、或赖氨酸衍生物氨基乙基胱氨酸(ACE)和色氨酸类似物如5-甲基色氨酸，由于其在高浓度应用时具有抑制细胞生长的能力，也可以被用作选择性试剂。在此选择体系中，可选择的标记基因的表达导致转基因细胞过量产生氨基酸，从而允许转基因细胞在选择条件下生长。的条件下生长和增殖的标记，如缺乏植物生长激素的条件。选择标记基因能够编码一种酶，在其中碳源被换成非转化细胞不能直接利用的加密(encryptic)碳源或潜在碳源的条件下，这种酶表达后将加密碳源转化为支持转化的植物细胞在包含最低营养物的条件下生长和增殖的碳源。此正选择标记的实例为将不可利用的甘露糖-6-磷酸转化为可以用作植物细胞碳源的果糖-6-磷酸的磷酸甘露糖异构酶(参见US6143562),或来自锈棕色链霉菌d一画戸sn^/一o愿)的木糖异构酶(HaldrupA.等，1998,PlantCellReport18:76-81)。另一类选择标记基因允许对可能的转化植物细胞进行筛选，而非对抵抗毒性物质如抗生素的转化细胞进行直接遗传选择。因此，它们通常也被称为筛选性标记。这些基因被称为报告基因并包括如|3-葡萄糖醛酸酶(GUS)、P-半乳糖苷酶、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。或者，筛选性标记可以提供一些其它可视性反应应答。例如，在某物质外观或生长模式，所述物质可以直接应用于植物或植物细胞中，或存在于植物或植物细胞生长培养基中。通常，包含此筛选性标记基因的植物或植物细胞具有可用于鉴定的独特表型，即它们可以与未转化的细胞相区别。这些特征表型允许鉴定包含构建体的细胞、细胞群、组织、器官、植物部分或整个植物。形态异常诱导(MAI)标记基因的实例是来自农杆菌的异戊烯转移酶基因(Keller等，WO00/37060)。异戊烯转移酶是植物生长激素细胞分裂素生物合成中的限速酶。引入—基因的植物细胞产生细胞分裂素，结果是包含^基因的细胞的增殖和分化被打乱，引起了各种形态异常。在最终获得的转基因植物中，非内源序列如农杆菌T-边界和抗生素抗性基因和其它选择性标记序列的存在在大多数情况下被认为是不需要的。虽然这些序列被认为是转化过程所必需的，但其通常对最终幹化植物的确没有积极作用，且事实上出于多种原因消费者想要减少它。根据转基因选择基因横向转移进入肠道细菌的理论风险，消费者组织对食物产品中抗性标记的广泛分布表示关注。环境组织关注转基因植物和相关物种间交叉授粉的风险，这会导致抗性性状转移到杂草中，危害转基因农作物的长期使用并引起潜在的生态学问题。到目前为止已经开发了许多系统来帮助去除选择性标记基因。两种不同构建体的共转化可以导致整合有两个转基因的转基因系，且在遗传交叉后选才奪性标记可以与目的基因隔离开来。如WO95/16031、US6265638和WO00/18939中提出了通过共转化去除选择性标记基因。然而，共转化系统需要标记基因定位于非连锁的位置，意味着筛选许多更独立的转化事件。然而，许多交叉授粉且特别是无性繁殖的农作物(如苹果或草莓)，和特别是块茎状的农作物如马铃薯和木薯是高度杂合的，因此通过遗传分离去除标记序列有可能需要很多年才能发现具有适合的田间作业性能的克隆。现已采用多个转座性元件系统和位点特异性重组系统以去除标记(SugitaK等，2000PlantJ22:461-469;Zuo等，2001NatureBiotech19:157-161)。EP716147描述了用于将所需基因引入植物的载体，其包含目的基因和位于可除去的DNA元件(即转座性元件或位点特异性重组系统)上的至少一个形态异常诱导(MAI)标记基因。通过肉眼观察其异常的枝形态可以很容易地检测到由包含MAI的基因构建体转化的植物。同样，在转座性元件转座后或重组系统位点特异性去除后MAI基因功能的缺失可以很容易地通过正常形态的枝来检测。无需进行杂交步骤即可使此类转基因植物不含标记基因。这些系统需要表达转座酶或重组酶，其介导插入到重组或转座酶靶序列间的区域删除，随后通过遗传分离去除标记基因。此外，这些系统比较耗时，且对于主要为无性繁殖的物种也不切实际。此外，删除的片段可以再插入到基因组的其它位置。另一个诱导DNA删除的方法是基于两个同源序列间的染色体内的同源重组。染色体内的同源重组频率通常很低，从而不能使此系统有效应用于产生转基因区域的删除。使用噬菌体入的attP区可以增加此重组频率(ZubkoE等，2000NatureBiotech18:442-445)。然而，此过程仍旧不可预期且效率低至不能产生数百至数千个独立的转化事件以发现具有适合农业性能的克隆。不使用选择标记来回收转基因细胞的系统已有描述。在WO98/51806中，公开了使用结节培养和非选择性筛选分析通过富集转基因部分而不使用选择性标记来回收转化细胞的方法。此方法包括培养包含非选择性的可分析的转基因的植物细胞或组织，直到发育出包含分生组织的节。随后，使用非选择性分析如酶分析或ELISA测定植物组织。通过此方法回收的阳性分析的植物是嵌合的且具有转化的部分。为了从阳性分析的组织中富集这些转化的部分，制备了节外植体并培养形成枝。再次用非选择性分析来测定枝和叶，希望所回收富含转化部分的植物，使得最终在几轮分析后能够获得接近均一的转基因植物。WO03/010319描述了获得包含重组核酸的无标记植物的方法，所述重组核酸包含T-DNA构建体并允许所述构建体转移进入植物细胞基因组，所述构建体具有的外源核酸不含编码选择标记的核酸。此方法包括转化不包含分生组织部分，即结间的茎段、叶、块茎盘、花、花粉和/或根的植物组织，和用不含选择性标记或报告基因的T-DNA处理植物细胞或组织。随后，植物细胞经历愈伤组织期，植物将由此发育。随后，使用非选择性分析如PCR、酶分析或ELISA测定植物组织。通过此方法回收的阳性分析的植物是非嵌合的且不必经历费时的杂交步骤。已证明此方法非常有用。WO05/004585描述了获得包含重组核酸的无标记植物的方法，所述重组核酸包含没有选4奪性标记的所谓P-DNA构建体以及具有选择性抗生素标记的构建体。通过对暂时标记基因表达的正选择以及对标记整合的负选择，可以鉴定包含P-DNA插入但缺少任何标记基因拷贝的植物细胞。然而，仍需要其它备选的转化方法。
发明内容本发明进一步提供了植物转化过程中备选的选择方法。除了在大多数情况下认为在获得的最终转基因植物中不需要存在有抗生素抗性基因和其它选择性标记序列的事实外，通常更不愿在转基因植物中存在非^4物序列(即异种源序列，transsequences)。许多可商购的转基因农作物包含外源调节元件，如花椰菜花叶病毒的35S启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止子。Rommens等(2004)说明了获准用于商业的转基因植物平均包含8个源自病毒、细菌或植物的遗传元件，所述植物与耙农作物是两性间不相容的，即不可能通过传统的植物培育而发生基因渗入。因此本发明提供了具有附加的核酸序列的植物，但是此遗传修饰的植物基本上由同种源植物序列(cisplantsequences)组成，例如遗传修饰的马铃薯植物，其具有来自另一马铃薯品种、培育克隆或可杂交物种的附加的(基本是)马铃薯植物(编码的)序列。此同种源植物序列处于其天然的遗传背景中，即受其自身启动子的控制，具有内含子和其自身的转录终止信号。在下文中此类转基因植物也被称为同种源基因(cisgene)植物。或者，实施方案描述了产生包含源自两性相容组内多种基因的遗传元件的植物的方法。具有此遗传元件的植物-波称为基因内植物(Rommens等，TIPS2007)。在优选的实施方案中，商业上感兴趣的马铃薯植物(如Desiree或Bintje)带有分离自其它马铃薯品种(如来自野生种马铃薯如6w/6固"謹m)的核酸序列。优选地，获得的遗传修饰的茄属植物(So/am/m)包含茄属植物5，和3，序列以指导cDNA序列或基因组序列的转录。相对于所用的5，和3'序列，所用的cDNA或基因组序列可以是正义或反义的方向。5，和3'序列最初可以连接所用的cDNA或基因组序列，或它们通常可以连接到茄属植物中的另一编码序列。在优选的实施方案中，所用的编码序列是基因组序列(正义或反义方向)，且所用的5，和3，序列是连接到在正常条件下的基因组序列的一类序列(即5，和3'序列可操作地连接其自然编码序列)。本发明提供用于获得具有目的核酸的植物的方法，包括提供包含所述目的核酸的重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和确定存在所述目的核酸且不存在载体骨架和/或边界序列，其中所述目的核酸(或待转移的DNA,如T-DNA)基本上为植物核酸。对于不含载体DNA序列的转化体的生产，需要递送DNA至细胞中，所述细胞不包含在细菌宿主如大肠杆菌(￡.co/0中维持质粒载体所必需的DNA序列，如抗生素抗性基因，包括但不限于氨千青霉素、卡那霉素和四环素抗性，且不包含原核生物的DNA复制起点(在此情况中，可以在转化前纯化包含转化DNA的DNA片段。可以通过如琼脂糖凝胶电泳和随后从琼脂糖中回收DNA片段来实现纯化)。通过测试是否存在载体或载体骨架或边界序列，本发明提供了用于确定植物是否具有包含目的核酸的重组核酸的方法，包括任选地进一步提供带有功能性R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触至少一种疫霉属(/V^top/zAora)的激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应，还包括确定是否存在非茄属植物核酸序列。在优选的实施方案中，所述非茄属植物核酸序列为非茄属植物T-DNA边界序列，即在优选的实施方案中测试存在还是不存在T-DNA边界序列，特别是在使用至少一种非茄属植物T-DNA边界序列的情况中。待转移的核酸序列不含编码选择性标记或报告基因的核酸序列，但是可以存在同种源基因标记或报告子序列。然而，所述方法基本不需要通过选择性试剂处理来进行选择。反之，例如使用如公知的核酸技术，如通过聚合酶链式反应检测或在常规Southern杂交实验中与互补序列杂交检测，从而通过测试目的核酸的存在来实现对所需转化体的选择。对本领域技术人员显而易见的是可以通过监测基因表达产物存在与否或其量的变化来检测所需外源基因或基因片段的存在。例如，对于可由ELISA(酶联免疫吸附)检测的表本文中的术语"所述目的核酸基本上为植物核酸"是指从植物(优选茄属植物)获得/来源/分离的序列，即待转移的核酸序列基本上为茄属植物核酸序列。例如如果选择农杆菌/二元载体方法作为转移方法，则存在于T-DNA上的序列(即待转移的部分)基本上为茄科植物核酸序列。所用二元载体的边界序列以及骨架可包含非茄科植物核酸序列。在优选的实施方案中，所用的植物细胞属于茄科植物。这导致产生所谓同种源(转基因)植物，即使用本物种自身的序列或可杂交物种的序列通过遗传修饰获得的植物。例如，商业上的马铃薯品种，其具有分离自野生型马铃薯品种或可杂交物种的核酸序列。在优选的实施方案中，对T-DNA上所用序列进行克隆，使得仅有茄属植物序列存在于T-DNA上，例如使用源自茄属植物的连接子分隔T-DNA上不同编码序列。也可以使用(修饰的)多克隆位点，其在克隆后仅导致已经存在于所用植物细胞的基因组背景中的核苷酸序列的存在。本文所用的术语"基本上"是指虽然全部序列位于天然存在的至少一种(优选非遗传修饰的)植物(优选茄属植物)中，但是遗传环境或背景可能会略有不同。在优选的实施方案中，本发明提供用于获得具有目的核酸的植物的方法，包括提供包含所述目的核酸的重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和确定存在所述目的核酸且不存在载体骨架和/或边界序列，其中所述目的核酸基本上为植物核酸，其中所述植物核酸为茄科植物核酸。更优选所用的植物细胞为茄科植物细胞。在另一优选的实施方案中，本发明提供用于获得具有目的核酸的植物的ii方法，包4舌提供包含所述目的核酸的重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和确定存在所述目的核酸且不存在载体骨架和/或边界序列，其中所述目的核酸基本上为植物核酸，其中所述目的核酸为cDNA序列，或其中所述目的核酸为反向(重复)序列，或其中所述目的核酸为基因组序列。在更优选的实施方案中，所述植物核酸是受自然的/天然的5，(启动子)和3，(终止子)核酸序列控制的开放阅读框，且在更优选的实施方案中，所述核酸序列是基因组序列。此类序列与茄科植物细胞的结合使用导致产生所谓的同种源基因植物，即使用本物种自身的序列进行遗传修饰的植物。另一优选的实施方案是其中所述目的核酸为R基因的方法。这样，本发明提供了如至少部分抗病原菌(致病疫霉(i5z'"/wtow))的同种源基因马铃薯植物。这类植物被认为很容易受到伦理委员会以及消费者组织的反对，而同时这些植物减少如杀真菌剂的使用。通过确定是否存在非茄属植物核酸序列来对本文所述的方法进行进一步的补充。这确认不存在任何非植物核酸序列。优选地，所述非茄属植物核酸序列为非茄属植物T-DNA边界序列。目的核酸可以作为染色体外的(游离基因的)复制分子存在于植物细胞中，但更优选地根据本发明的方法导致重组核酸(待转移的核酸序列)整合进入所述植物的基因组。本发明进一步提供了一种植物，所述植物可以通过用于获得具有目的核酸的植物的方法获得，所述方法包括本发明提供用于获得具有目的核酸的植物的方法，包括提供包含所述目的核酸的重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和确定存在所述目的核酸且不存在载体骨架和/或边界序列，其中所述目的核酸基本上为植物核酸。本发明还提供了一种遗传修饰的植物，所述植物具有同种源基因，即从相同物种但不同品种获得/来源/分离的基因。优选地，所述同种源基因受自身5，(启动子)和3，(终止子)序列的控制，且更优选地所述同种源基因为基因组序列。所述基因组序列可以包含内含子和外显子序列。在优选的实施方案中，所获得的植物基本上仅包含从植物且更优选从茄属植物获得的核酸序列。因此，本发明提供了用于确定植物是否具有包含目的核酸的重组核酸的方法，包括任选地进一步提供带有功能性R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触至少一种疫霉属的激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应，其中所述重组核酸基本上由茄属植物核酸序列组成，即待转移的核酸序列基本上为茄属植物核酸序列。例如如果选冲奪农杆菌/二元载体方法作为转移方法，则存在于T-DNA上的序列(即待转移的部分)基本上为茄科植物核酸序列。所用二元载体的边界序列以及骨架包含非茄科植物核酸序列。将选择不包含这些边界序列和骨架序列的这类茄科植物转化体。这导致产生所谓同种源基因植物，即使用本物种自身的序列或可杂交物种的序列通过遗传修饰获得的植物，例如，商业上的马铃薯品种，其具有分离自野生型马铃薯物种或不同马铃薯品种或可杂交物种的核酸序列。在优选的实施方案中，对T-DNA上所用序列进行克隆，使得仅有茄属植物序列存在于T-DNA上，例如使用源自或基于茄属植物基因组设计的连接子分隔T-DNA上不同编码序列。也可以使用(修饰的)多克隆位点，其在克隆后仅导致已经存在于所用植物细胞的基因组背景中的核苷酸序列的存在。本文所用的术语"基本上"是指虽然全部序列位于天然存在的至少一种(优选非遗传修饰的)植物(优选茄属植物)中，但是遗传环境或背景可能会略有不同。此外，本发明提供了用于确定是否植物具有包含目的核酸的重组核酸的13方法，包括进一步提供带有功能性同种源R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触至少一种,疫霉属的激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应。化是否已经成功。术语"重组核酸"通常用于描述双链或单链DNA或RNA分子，且包括核酸的环型和线型形式。在一些实施方案中，本发明方法中所用的重组核酸至少包含(i)重组的目的核酸和(ii)功能性R基因。然而，目的核酸和功能性R基因也可以是同一个核酸，因此，在此实施方案中，本发明的方法中所用的重组核酸至少包含功能性R基因。在后一种情况中，所述功能性R基因被用作选择工具以及被用于提供抵抗真菌感染/病原菌的(至少部分)保护。本发明的方法中所用的重组核酸除了包括功能性R基因或重组的目的核酸和功能性R基因的组合(如骨架/载体序列)，以及在农杆菌介导的转化的情况中至少一个和优选为两个(任选地修饰的)T-DNA边界序列之外，也可以包含其它序列。T-DNA边界源自农杆菌，因此包含这些边界的植物不包括在同种源基因植物或基因内植物的定义中。W005/004585的发明已经搜索了功能性植物T-DNA边界。在拟南齐属(Jra&Wo;^;y)、水稻、马铃薯等中确定了这些类似物的存在(Rommens等，PlantPhysiol.2004)。本领域已知这些T-DNA边界的删除通常会发生在T-DNA整合进入基因组期间。我们已经详细分析了使用构建体pKGBA50mf-IR1.1(deVetten等，2003)获得的五个转化体，并观察了从RB侧39-237bp和从LB侧79-1054bp的T-DNA序列的删除。Zhu等(2006)报道了类似的结果。他们分析了来自独立转基因水稻植物的171个左边界和134个右边界，并观察了在RB侧多至35bp和在LB侧多至340bp的T-DNA删除。他们指出一些转化体可能发生在LB侧长度大于611bp的删除。Windels等(2003)分析了来自拟南芥属转化体的67个T-DNA/植物DNA接合处。他们观察到在RB侧多至629bp和在LB侧多至2309bp的T-DNA序列的删除。Thomas和Jones(2007)表征了98个T-DNA/植物DNA接合处序列。所分析的42个接合处中有41个接合处未保留有源自LB重复的序列。所分析的56个接合处中有36个接合处未保留有源自RB重复的序列。基于这些观察，希望能够选择出大量仅包含整合在基因组中的茄科植物序列的转化体。为了获得最大数量的具有(删除的)未整合边界的转化体，所述边界优选较短，具有最少25bp的左侧和右侧边界，然而使用较长边界也是可行的。如本文在实验部分的公开，优选的左边界设置是在其中使用减弱区与双左边界的组合。这种设置防止更频繁的骨架整合(左边界的连读)。EP-A-1009842例举了防止连读的类似方法。骨架载体(非T-DNA)序列向植物基因组的整合在才艮癌农杆菌(爿gro6"cten'wm^we/a"'em)转化期间频繁发生(Kononov等，1997;Ramanathan和Veluthambi，1995;VanderGraaff等,1996;Wenck等，1997;Wolters等，1998)。Wang等(1987)报道了"边界重复的侧翼序列增强(在右侧)或减弱(在左侧)其活性，，。他们定义了"减弱区，，靠近质粒pTiC58的LB的T-DNA的363bp富含AT的EcoRI/BclI片段。DeBuck等(2000)指出"有可能删除内部边界区(存在于载体来源的最初Ti质粒中的一段T-DNA)会引起LB重复的无效缺口，这导致连读通过LB和位于下游的载体序列的转移"。Kuraya等(2004)指出"来自对照载体的'载体骨架，的转移主要因为T-DNA转移中间产物形成的无效终止，且附加的LB序列有效地抑制此转移"。基于这些报道，我们已经在我们的一个实施例中克隆了额外的胭脂碱型LB以及在二元载体的LB外的侧翼减弱区，以防止骨架载体DNA向植物基因组中整合。如上所述，本发明的方法中所用的重组核酸还可以包含载体序列，条件是它们是同种源基因，即获得自相同的植物或相同的两性相容组。例如，载体序列可以包含用于在大肠杆菌和农杆菌中保持重组核酸的选择标记。本领域的技术人员很清楚如果想要引入多个目的核酸，本发明的方法中所用的重组核酸可以包含多个目的核酸。存在于本发明的方法中所用的重组核酸的其它序列为启动子和/或终止子序列，优选为与目的核酸和/或R基因功能性连锁/偶联。下文描述了这些启动子和/或终止子序列的优选实施方案。本领域的技术人员明白可以想出大量全部包括在本文中的目的核酸。在一个实施方案中，所述目的核酸允许调节所述基因组中靶基因的表达。可以通过"正义"技术(sensetechnology)实现上调(或过表达)和下调。如果将全长的靶基因拷贝插入到基因组中，则可以获得一系列表型，其中一些过表达靶基因，一些低表达靶基因。随后可以对由此方法生产的植物群体进行筛选和个体表型分离。优选的实施方案包括其中所述调节包括下调的方法。靶基因表达的抑制(通常称为"基因沉默")可以通过"反义下调"和"正义下调"(也成为"共抑制")来实现。在反义下调中，将与全部或部分内源靶基因互补的DNA片段以相反的方向插入到基因组中。虽然尚未完全阐明此机制，但有一种理论认为此反义基因转录产生的mRNA与内源基因转录产生的mRNA产物在序列上互补。随后反义mRNA结合天然产生的"正义"mRNA形成抑制天然mRNA翻译成蛋白质的双《逸体。反义下调技术为本领域所熟知并在全世界的实验室常规使用。因此，可以通过将靶基因编码序列的至少一个片段的拷贝插入到靶生物体的基因组来实现基因沉默，此拷贝可以包含全部或部分或截短的序列，并可以是正义或反义方向。此外，可从基因组基因序列获得的内含子序列可以被用于构建抑制载体。也有在生物体中实现转基因和内源基因的基因沉默的报道，其中仅在启动子区域有序列同一性。在更优选的实施方案中，本发明使用重组核酸，其中所述目的核酸包含所述耙基因的至少部分多核苷酸区域的反向重复。虽然反义和正义下调可以导致耙基因的完全沉默，但效率通常不是很高。最多有25%的反义转化体呈现完全的沉默，而从正义构建体获得的转化体只有约10%显示出一定水平的说明书第14/60页沉默(Smith等，2000Nature407:319-320;Wolters和Visser，2000PlantMolBiol43:377-386)。最近，已经观察到当基因沉默载体包含靶基因的全部或部分多核苷酸区域的反向重复时，增强了对生物体内选择的靶基因的抑制。反向重复序列可以由如T-DNA组成，所述T-DNA带有驱动cDNA正义拷贝表达的一个启动子以及在相同cDNA的反义拷贝前的另一启动子(Chuang和Meye磨itz,2000ProcNatlAcadSciUSA97:4985-4990),或T-DNA可以包含两个末端的侧翼均为启动子的cDNA序列(LaCount等，2000MolBiochemParasit111:67-76),或T-DNA可以包含驱动(部分)cDNA的反向重复转录的启动子(Hamilton等，1998;Smith等，2000Nature407:319-320;Wang和Waterhouse,2000WangMB,WaterhousePM(2000)PlantMolBiol43:67-82),或待沉默的基因的启动子(Mette等，2000EMBOJ19:5194-5201)。据报道在使用内含子作为重复间的间隔子的情况中，一些反向重复构建体导致100%的转化体呈现出耙基因沉默(Smith等，2000Nature407:319-320)。间隔子片段有助于正确反向重复序列的稳定性，但其对于沉默的特异性则不是必需的。在特别优选的实施方案中，目的核酸编码颗粒结合型淀粉合酶(GBSSI)或包含反义序列。在转基因马铃薯中包含的GBSSI的短重复区域导致完全沉默的转化子的频率有显著增加。本发明还提供了一种目的核酸，所述目的核酸允许在植物细胞中表达异源的，同种源基因(cisgenic)多肽。适合的多肽是多样的，转入植物中的目的外源核酸或基因的典型实例是编码修饰新陈代谢和分解代谢过程的蛋白质和酶的那些。其它实例是可以编码增加作为食物或农作物的植物营养价值的蛋白质的基因。典型的实例包括可以抑制抗营养因子形成的植物蛋白和具有更多所需氨基酸成分(如比非转基因植物具有更高的赖氨酸含量)的植物蛋白。在优选的实施方案中，所述目的核酸编码包含酶的多肽。目的核酸也可以编码在食物加工中使用的酶，如凝乳酶、竹芋蛋白和a-半乳糖苷酶。目的核酸也可以编码引入或增加病原菌抗性的试剂。优选地，目的基因是这样的基因，其编码具有高营养价值的蛋白质或肽、反馈不敏感的氨基酸生物合成酶如二氢吡啶二羧酸合酶(EC4.2.1.52，DHPS)、提供疾病抗性的酶或肽、正义或反义转录物如马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、a-淀粉酶、分支酶、颗粒结合型淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、蛋白酶或葡聚糖酶。在另一实施方案中，目的核酸是调整植物组织和器官质构性质(特别是在热处理如蒸煮后)的核酸序列。优选地，可以改变马铃薯块茎的蒸煮类型，如从"粉状的"至"坚实的，，或与此相反。此基因的实例为编码所谓StTLRP蛋白质(马铃薯富含酪氨酸和赖氨酸的蛋白质)的sttlrp核酸。图3提供了此sttl卬核酸的核酸序列。StTLRP蛋白质(和编码其的W/r/核酸)适用于调整植物细胞壁的质构特性，特别是缺乏刚性的(木质化的)次生细胞壁的细胞(和主要由其构成的组织)。发现mRNA表达水平和马铃薯块茎的坚实度之间有显著的关联。包含W/^基因特定等位基因(W/vA7等位基因)的马铃薯基因型比缺乏此等位基因的基因型具有更高的W/r;mRNA水平(如上调64倍)。平均而言，在蒸煮后这些基因型具有更坚实的组织。相反地，缺乏A7等位基因的基因型在蒸煮后为粉状的。因此，特别高表达的等位基因能够为马铃薯块茎提供"坚实"，"非粉状的"的表型，而低表达的等位基因(和因此缺少高表达的等位基因)能够提供"粉状的"的表型。图3显示了A7等位基因的基因组和cDNA核酸序列。在另一优选的实施方案中，本发明提供了其中目的核酸也为功能性R基因方法。术语R基因通常用于描述所编码的基因产物能够为植物提供(至少部分)病原菌抗性的DNA序列。更优选地，此选择过程中所用的R基因也可以用于向所获得的植物提供抗性。优选地，对此选择过程中所用的R基因和其它功能性R基因(作为目的核酸)进行选择，以便它们提供抗病原菌的互补的(和更优选地部分重叠的)保护。使用至少两个优选不同的R基因导致所谓的R基因堆叠。通过如ATTA(即根癌农杆菌瞬时表达分析)来测试多种不同的R基因是否提供互补和/或重叠的作用。在此分析中，将编码待测试的R基因的核苷酸序列引入到也用于稳定转化方法的农杆菌菌抹。在用乙酰丁香酮或已知可以增强农杆菌T-DNA转移的任何其它酚类化合物孵育细菌后，通过注射可以使一定量的农杆菌培养物渗透进入原位植物叶片(如烟草或马铃薯或番茄植物)，此后将植物置于温室并用病原菌(如致病疫霉)感染。2-5天后，记下出现抗性症状的叶片。对多种不同的致病疫霉分离抹或对多种不同的激发子，测试多种不同的R基因。测试多种不同的R基因是否提供互补和/或重叠的作用的另一种方法是使用分开的叶片分析，其中优选使用充分表征的分离抹(如致病疫霉分离抹)或效应物(如激发子)，其揭示了在茄属植物和疫霉属中搜寻重复的功能性等位基因是鉴定和表征R-avr组合的强有力工具，其比之前可能仅使用的分离抹筛选具有更高的识别分辨率。以前已经对野生的茄属植物物种进行过抗致病疫霉的基因作图。表1中给出了抗植物晚疫病的R基因的作图的总结。目前，已经克隆了4个抗晚疫病的R基因，且它们均属于NB-LRR类的植物R基因；来自矮茄(S.dew/^ww)的i/和i3a(Ballvora等，2002;Huang等，2005)和来自51.Zw/6ocaWa"wm的i;^-WW和(vanderVossen等，2003，2005)。表1中给出了可以用作目的核酸的R基因的实例。然而，本发明的方法中也可以使用分离自除马铃薯之外的其它植物的R基因。优选地，所用的功能性R基因和激发子相匹配。例如，如果要使用来自大豆植物的Rpslb，则所用的激发子优选为大豆疫霉菌(/Vy^，/^/wraso力e)的激发子(优选Avrlb-l)。下表中给出了其它实例。19宿主R基因Avr基因病原菌马铃薯肠致病疫霉(尸/^o/7似Aora/"/^a朋)卵菌)马铃薯致病疫霉卵菌大豆争/6大豆疫霉菌卵菌拟南芥)一*7Hyaloperonosporaparasitica卵菌番痴，爿w9黄枝孢菌真菌番茄尸to番茄细菌性叶斑病菌(i^ewi/o,W(zy，z'wgae，7b附她)纟田菌通常，本文所用的术语"功能性(R-)基因"是指能转录的基因，即基因产物被表达(并提供能够与至少一种疫霉属激发子相互作用的产物)。表1中给出了适合的基因。有多种方式可以将重组核酸转移至植物细胞，如农杆菌介导的转化。然而，希望实施本发明时，除了农杆菌感染之外，还有其它方法可以有效地将DNA传递到受体植物细胞中。认为适合将DNA传递到植物细胞的方法几乎包括可以将DNA引入细胞的任何方法，如通过DNA的直接传递如通过PEG介导的原生质体转化(Omirulleh等，1993),通过脱水/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等，Mol,Gen.Genet.,199:183-188,1985),通过电穿孔(美国专利第5,384,253号)，通过碳化硅纤维的搅动(Kaeppler等，19卯；美国专利第5,302,523号；和美国专利第5,464,765号)和通过DNA包被颗粒的力口速(美国专利第5,550,318号；美国专利第5，538，877号；和美国专利第5,538,880号)。通过诸如这些技术的应用，可以稳定地转化来自几乎任何植物物种的特定细胞，且这些细胞可以发育成转基因植物。在使用农杆菌介导的转移中，优选使用有充分毒力的农杆菌，如根癌农杆菌，如菌抹A281或源自其的菌林或本领域中可获得的其它有毒力的菌抹。这些农杆菌菌抹携带源自包含WW、vz>C和基因的Ti质粒pTiBo542毒力区的DNA区。根癌农杆菌的毒力(vir)基因产物协调T-DNA的加工20和其向植物细胞中的转移。KV基因表达受控于WM和v/K，其中WM基于感受诱导信号通过磷酸化激活v/K7。F^G反而诱导WM，C，A五的表达。这些基因编码参与DNA转移的蛋白质。认为pTiBo542毒力的增强是由此Ti质粒上超毒力的vz'K7基因所引起(Chen等，Mol.Gen.Genet230:302-309,1991)。在微粒轰击中，颗粒可以用核酸包被并借助推进力被传递进入细胞。示例性颗粒包括如鴒、金、铂等那些颗粒。在一些情况中，可以预期DNA在金属颗粒上的沉淀并非是使用微粒轰击来将DNA传递至受体细胞所必需的。然而，可以想到的是，颗粒也可以包含DNA而非被DNA包被。对于根据本发明的微粒轰击转化，可以对物理和生物学参数进行优化。物理因素是那些涉及操纵DNA/微粒沉淀的因素，或那些影响大颗粒或微粒射程和速度的因素。生物学因素包括涉及在轰击前和紧随轰击后操纵细胞的所有步骤，如帮助减轻轰击所带来的损伤的靶细胞的渗透调节，把组织相对于颗粒轨道的定向，以及诸如线性化DNA或完整的超螺旋质粒等转化DNA的性质。认为轰击前操作对成功的转化特别重要。在优选的实施方案中，将用不含骨架质粒DNA序列的线性化DNA转化靶组织。因此，可以预期的是，可期待在小规模研究中调节各种轰击参数以充分地使条件优化。可能特别希望调节物理参数如DNA浓度、缝隙距离、射程距离、组织距离和氦气压力。还可以预期氦气的等级可能影响转化效率。也可以通过改变影响受体细胞生理状态和由此可能影响转化和整合效率的条件来优化降低损伤的因素。例如，可以调节受体细胞的渗透状态、组织水化和继代培养时期或细胞周期来达到最佳转化。用于微粒轰击的转化DNA可以包含表达盒，所述表达盒通常包含希望被引入到细胞中的cDNA和一个或多个基因，且还可以包含与外源基因可操作连接的启动子和3，区。本发明中描述了优化的基因构建体。DNA区段还可以包含第二个、第三个、第四个、第五个、第六个或任何其它数量的，能够被置于单个DNA分子上并被转化进入受体细胞的外源基因。根据本发明的方法，用于重组核酸转化的受体植物细胞可以来自潜在地任何可转化的单子叶或双子叶植物。优选用于本发明的单子叶植物细胞来自水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、谷子、高粱、甘蔗、草冲草和玉米。优选用于本发明的双子叶植物细胞包括来自玉米、番茄、柑橘、烟草、大豆，和特别是马铃薯和木薯的细胞。在转移重组核酸后，从所述遗传修饰的植物细胞生产植物。这包括本领域熟知且无需进一步说明的再生方法。如果得到的植物包含提供抗疫霉属抗性的R基因，其可以在任何龄期经受至少一抹疫霉属菌林或疫霉属激发子的处理。原则上仅仅具有一个叶片的所得植物可以已经经受至少一株疫霉属菌抹或疫霉属激发子的处理。此外，可在体外和体内测试植物。在优选的实施方案中，涉及在从体外培养到盆栽两周后测试。除了标记基因是同种源基因之外，根据本发明的方法的重要优点是，获得的植物无需生长在选择性培养基上，如包含除草剂、抗生素、氨基酸类似物等的培养基。此外，本发明的方法不包括使用如在使用GFP或GUS标记中所需的额外装置。如上所述，在本发明的方法中可以使用除马铃薯外的植物的其它功能性R基因，例如当转化大豆时可以使用来自大豆的Rpslb基因，或当转化马铃薯时可以使用来自马铃薯的Cf基因。因此，本发明还提供了确定植物是否已经具有包含目的核酸的重组核酸的方法，包括进一步提供具有功能性R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触如枝孢属(C7^fo^on'wm)的至少一种激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应。在此特定实施例中所用的植物细胞为番茄属(Z^co;e"/co")植物细胞。本发明的方法任选地还包括测试拷贝数。此分析优选在DNA/RNA水平进行。这包括根据标准方法从植抹或植株库中分离核酸(Sambrook等，1989)。核酸可以是基因组DNA、RNA或mRNA。也可以检测重排。本发明提供使用mRNA检测方法来确定在转化的植物细胞或其子代中的核酸构建体是否充分地整合进入将被转录为mRNA构建体的植物基因组中。使用直接(DNA)或间接(RNA)扩增在样品中鉴定部分转基因的目的特异性核酸。其次，检测已鉴定的产物。在某些应用中，可以通过可见方法(如凝胶的溴化乙锭染色)进行检测。或者，检测涉及通过化学发光、放射标记或荧光标记的放射性闪烁照相，或甚至使用电或热脉沖信号的系统来间接鉴定产物。可以想到会有多种不同的分析方法来筛选使用本发明的方法产生的转基因植物。这些技术可以用于检测特定基因的存在以及在基因构建体中可能出现的重排。这些技术包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交(FISH)、直接DNA测序、PFGE分析、Southern或Northern印迹、单链构象分析(SSCA)、RNAse保护分析、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)、斑点印迹分析、变性梯度凝胶电泳、限制性片段长度多态性(RELP)和PCR-SSCP或基于芯片DNA技术。本发明提供了使用核酸检测方法来确定是否转化的植物细胞或其子代被重组核酸所转化，所述重组核酸包含允许整合进入植物细胞基因组的T-DNA构建体或功能性等价核酸构建体。此外，本发明提供了核酸检测方法在确定转化的植物细胞或其子代是否被重组核酸所转化中的应用，包括测试所述细胞或所述子代中是否存在非所需的载体材料，如载体骨架序列。例如，根据本发明的方法可以用于检测转化的植物细胞是否基本上不含作为辅助的多余核酸。将随后使由核酸检测方法所鉴定的转化植抹发育成植物。再生植物进入茎和根发育的阶段后，可以将它们移入温室进行继续生长和测试。特别是在由基因枪轰击的转化中，控制所引入转基因的拷贝数和有效生产低拷贝转化体可以通过去磷酸化或通过核酸区段末端的平端化对核酸区段末端进行修饰来实现(W099/32642)。优选地，从茄科植物获得/分离所用的功能性R基因和/或所用的目的核酸，其包含其自身的5，(启动子)和3，(终止子)序列，即所用的功能性R基因和/或所用的目的核酸优选受控于其自然的/天然的启动子和终止子区域。在优选的实施方案中，本发明提供确定植物是否具有包含目的核酸的重组核酸的方法，包括进一步提供具有功能性R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触至少一种疫霉属的激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应，其中所述目的核酸与所述功能性R基因相同。此方法不依赖于选择性标记，且因此不需要使用选择性试剂处理进行选择。在此实施方案中，功能性R基因具有双重功能，即所述R基因被用于确定哪个植物具有重组核酸且也被用于提供(至少部分)抗病原菌的抗性。在另一实施方案中，本发明提供确定植物是否具有包含目的核酸的重组核酸的方法，包括进一步提供具有功能性R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触至少一种疫霉属的激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应，其中所述目的核酸为功能性R基因。表1给出了适合的R基因的实例。此方法实际上是提供带有至少部分抗病原菌抗性的植物的方法。在此实施方案中，也可以使用被用来确定重组核酸是否存在的功能性R基因来提供抗性。在后一种情况中，所生产的植物包含至少两个功能性R基因。本领域技术人员明白植物也可以具有三个或四个或五个或六个(优选不同的)功能性R基因。优选地，对所用的R基因进行选择，以便它们提供抗病原菌的互补的保护。更优选地，所获得的保护为导致(持久的)抗性表型的宽范围保护。如上所述，可以使用多种反应确定是否存在对激发子的反应。在优选的实施方案中，所述反应为超敏反应(HR)。例如使用农杆菌感染法或农杆菌渗入法来测试是否诱导出HR。在本文的实验部分详述了这两个技术。如果使用代表性疫霉属菌林代替(分离的)激发子，本领域技术人员优选使用接种。转移的核酸可以作为染色体外的(游离基因的)复制分子存在于植物细胞中，但根据本发明的方法更优选地导致重组核酸整合进入所述植物的基因组。优选地，本发明提供确定植物是否具有包含目的核酸的重组核酸的方法，包括进一步提供具有功能性R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触至少一种疫霉属的激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应，其中所述目的核酸和/或所述功能性R基因为cDNA序列。在优选的实施方案中，所述目的核酸为反向(重复)序列。反向重复序列的实例为GBSS的反向重复序列。在另一优选的实施方案中，本发明提供确定植物是否具有包含目的核酸的重组核酸的方法，包括进一步提供具有功能性R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触至少一种疫霉属的激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应，其中所述目的核酸和所述功能性R基因为基因组序列，更优选为茄科植物基因组序列。结果，这些基因存在于它们自然的/天然的外显子/内含子背景中。在最优选的实施方案中，所述目的核酸和所述功能性R基因不但为基因组序列(更优选为茄科植物基因组序列)，而且也受它们自然的/天然的5，和3，序列的控制，即受存在于最初/自然的/天然的背景中的启动子和终止子序列的控制。如前所述，可以使用不同功能性R基因/激发子(或疫霉属)的组合来进行本发明的方法。在其中一个实施方案中，功能性R基因为Rpi-blb-l或Rpi-stol或Rpi-ptal,且所用的激发子为RD7(IPI-O)，因此本发明还提供确定植物是否具有包含目的核酸的重组核酸的方法，包括进一步提供具有功能性R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触至少一种疫霉属的激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应，其中所述功能性R基因为编码Rpi-blb-l或Rpi-stol或Rpi-ptal的基因，或编码其功能性片段的基因，或编码其衍生物的基因。在更优选的实施方案中，所述激发子为RD7(IPI-0)。如我们共同未25决的申请之一中详细地公开，Rpi-stol和Rpi-ptal为Rpi-blb-l的同源物，且可以与RD7(IPI-O)相互作用。图4显示了Rpi-blb-l和Rpi-stol和Rpi-ptal间的比对。在另一实施方案中，所用功能性R基因为编码如图2所示的blb-3的基因，因此在另一实施方案中，本发明提供确定植物是否具有包含目的核酸的重组核酸的方法，包括进一步提供具有功能性R基因的所述重组核酸，将所述重组核酸转入植物细胞，从所述细胞生产植物，和使得到的植物接触至少一种疫霉属的激发子，并确定是否存在对所述至少一种激发子的反应，其中所述功能性R基因为编码blb3的基因，或编码其功能性片段的基因，或编码其衍生物的基因。在另一实施方案中，所述功能性R基因为编码如图2所示的blb-3的基因。Blb3是LZ-NBS-LRR类的R基因并描述于共同未决申请中，提供对一系列致病疫霉分离抹的抗性。Blb-3核酸序列的功能性片段是完整blb-3核酸序列的截短的(N陽末端、C-末端、中间部分或其组合)序列。截短序列与全长序列相比具有可相比的功能和/或活性，即功能性片段能够为茄科家族成员提供抗卵菌属病原菌的物种非特异性(至少部分)抗性。例如，本文中已经通过所述的ATTA方法学或匹配效应物(激发子)的效应物筛选测试了此截短序列。衍生物的实例为blb-3的等位基因变体。本发明进一步提供了可通过本发明方法获得的植物。在优选的实施方案中，所述植物是商业上感兴趣的马铃薯品种，如Bintje、Desiree或Premiere、Spunta、Nicola、Favorit、RussetBurbank、Aveka或LadyRosetta。例^口通过进行PCR确定本发明植物的特征，来确定是否存在功能性R基因和是否不存在选择标记如卡那霉素。R基因优选存在于其非天然背景中，如Rpi-blbl或3在非<S.Zm/^costom^背景中，或R3在非矮茄背景中，或Rpi-stol在非&Wo/om/en^m背景中，或Rpi-ptal在非&背景中。对于所用目的核酸也是如此，例如如果目的基因分离自&m/crot/o"wm，优选将所述目的基因引入到非&w/cro心Wwm背景中。也就是说，优选待引入的性状引入到与其克隆或分离的物种不同的品种中。在另一优选的实施方案中，本文所用的R基因和/或目的核酸对植物细胞是外源的。本文中使用术语"外源的，，来描述这样的情况，其中R基因和/或目的核酸相对于宿主细胞是异源的(即与用于转化的细胞相比，其源自基因组/遗传背景不同的细胞或生物体)，或与所述R基因和/或目的核酸的天然形成的对应物相比，R基因和/或目的核酸相对于所用宿主细胞是同源的，但位于不同的基因组环境中(例如与天然的基因排列相比，其被不同基因围绕)。如上所述，所用R基因和/或所用目的核酸优选受控于其自身的5，(启动子)和3，(终止子)核酸序列。也可以通过如PCR或序列分析来确定存在此5，(启动子)和3，(终止子)核酸序列。如上所述，所用R基因和所用目的核酸为基因组序列，即任选地存在内含子和外显子序列。另外，也可此外，本发明的植物优选为非嵌合的和/或不含标记，且不含骨架序列和不含边界序列。本发明方法所获得的植物不需要任何重组事件(例如，以除去选择标记)且不需要任何杂交事件(例如，以删去选择标记)，即可由本发明方法获得的植物不需要额外的重组事件或性周期。然而，获得的植物可以被用作新品种的杂交亲本。因此所获得植物的基因组背景基本等同于转化所用植物细胞的遗传背景，且所述获得的植物不包含任何重组事件的痕迹。所述方法可以用于多种类型的植物。优选的单子叶植物(本发明使用细胞)来自水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、谷子、高粱、甘蔗、草坪草和玉米。优选的双子叶植物(本发明使用细胞)包括玉米、番茄、柑橘、烟草、大豆，和特别是马铃薯和木薯。具体实施例方式将在以下非限制性实施例中对本发明进行更详细地解释。实施例实验部分材料和方法农杆菌感染法使用携带在pGR106中的候选物效应物(来自OSU)的重组根癌农杆菌GV3101菌抹来筛选茄属植物中的反应。pGR106-CRN2和pGR106空载体(Jones等，1999;Takken等，2000;Torto等，2003)分别被用作阳性和阴性对照。培养物在添加有抗生素的固体琼脂LB培养基上于28。C生长2天。通过刺破中间叶脉两侧的叶片来接种过量的菌体。每2-4天通过目测记录局部和整体的症状。对于成熟的植物接种，通常使用来自三至四周植物的三片叶片，且交替使用不同叶龄的叶片用于各种处理的重复。农杆菌感染法在茄属植物中的应用已知茄属植物中产生PVX抗性，并干扰二元PVX载体的大规模筛选。为了确定可用于分析的不同茄属植物种质的范围，我们使用携带pGR106和pGR106-CRN2的根癌农杆菌(Vleeshouwers等，2006)来接种植物(来自31个种的80个茄属植物克隆)。持续用pGR106-CRN2处理引起50个植物克隆上接种位点周围的坏死(63%),然而空载体菌抹未引起症状。我们推断这些植物适于PVX农杆菌感染分析。所测试的其余茄属植物克隆则不适于此分析。对阳性和阴性对照都有的反应发生在20个克隆中，且被认为是对PVX的非特异性反应。十个其它克隆对pGR106-CRN2未显示出坏死反应，可能是因为基因插入物未发生原位表达(expressed。总之，似乎PVX分析适于约80%的被检物种和60%的克隆。因此，在使用来自致病疫霉的大组候选物效应物进行每次筛选前，要进行pGR106-CRN2和pGR106空载体的预筛选。农杆菌渗入法在本生烟草(M6ew//^m/a"a)中进行携带R基因和AVR基因的农杆菌菌抹的共渗入。重组的根癌农杆菌培养物在用于LBA4404构建体的添加有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB培养基(1升MQ水中加10克细菌蛋白胨、10克NaCl和5克酵母提取物)中生长。AGL-1中添加有5mg/L四环素和50mg/L卡那霉素(空AGL-1仅在四环素上生长)。在一天或两天后，将计算量的培养物(根据600nm下OD0.5计算)转移到用于所有菌抹的添加有卡那霉素的YEB培养基(1升MQ水中加5克牛肉提取物、5克细菌蛋白胨、5克蔗糖、1克酵母提取物、2ml1MMgS04)中，但对于AGL-1空载体使用四环素。在l天l夜后，将细胞在3500rpm下离心并重悬浮于添加有1ml200mM乙酰丁香酮的MMA培养基(20克蔗糖、5克MS盐和1.95克MES)中，至最终OD为0.5。在通过3ml注射器渗入4-6周龄的植物前将两种构建体(R基因和PEX)以1:1混合。实施例1同种源基因R3a转化体的选择载体pBINmf::R3a的构建用酶Pmel和Clal消化衍生自pBI121的二元载体pPGB-lS(Kuipers等，1995)以去除NptII基因。通过Klenow聚合酶处理使Clal粘末端变为平末端，随后使用T4DNA连接酶通过平末端连接使载体DNA环化。这产生了载体pPGBmf(不含标记)，其在T-DNA中包含马铃薯GBSSI启动子和随后的NOS终止子(为1140-bpHindlll/EcoRI片段)。用Hindlll和EcoRI消化构建体pPGBmf,得到1140bp和9681bp的两个片段。9681-bp片段包含内部LB(左边界)序列、LB、骨架载体DNA、RB和内部RB序列，将其从琼脂糖凝胶中分离。通过退火引物AWOl(5，-AGCTTGGCGCGCCCGGGTTAATTAAG-3，)和AW02(5'陽AATTCTTAATTAACCCGGGCGCGCCA-3，)制备双链寡核苷酸。此序列包含HindIII和EcoRI粘末端和Ascl、Smal和Pacl的限制性位点。将此寡核苷酸与pPGBmf的9681-bpHindIII/EcoRI片段连接，得到载体pBINmf(9707bp)。通过将SH23-2的Pacl/Ascl基因组DNA片段克隆到Pacl/Ascl消化的pBINmf得到载体pBINmf::R3a。SH23-2是细菌人工染色体(BAC)SH23的亚克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并将7-10kb部分连4矣到载体pBINPLUS的BamHI位点。载体pBINmf::R3a中的T-DNA包含9-kb的SH23-2pBINPLUS亚克隆的片段，基因R3a的编码序列(CDS)位于其中。3849-bpCDS(在植物转化后)受存在于SH23-2中R3a最初的启动子和终止子的调控。从二倍体马铃薯克隆SH83-92-488中分离基因组片段SH23-2(Huang等，2005)。4吏用辅助质粒pRK2013通过三亲交配将二元载体pBINmf::R3a转化到根癌农杆菌菌抹AGLO或AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。马铃薯的转化和转化体的选择根据Visser等(1991a)描述的方法，将来自马铃薯栽培种'Desiree'的体外生长植物的节间插条(cuttings)通过根癌农杆菌共培养进行转化。用根癌农杆菌AGL-1中的pBINmf::R3a转化马铃薯栽培种'Desiree'。没有进行选择。在4周后，收获第一个枝条并连续收获枝条约3个月。每个茎外植体收获了不超过两个再生体，并使枝条生长于玻璃罐(直径10cm)或塑料罐(直径15cm)中的MS30培养基上。每个罐包含5个插条。在插条和罐的内壁间留出2至3cm的空间。通过avr3进行体外选择使体外植林在24。C和16小时光/8小时黑暗下生长。将带有3至4片完全发育叶片的植抹用于体外接种。根据马铃薯基因型，在2至4周后可以对植抹进行接种。通过吸取10pl液滴的游动孢子悬液(2.5x104孢子/ml)在近轴侧接种每个体外植抹的3个最大叶片(每叶片l个斑点)。在无菌条件下进行接种物制备和接种。排除接触罐或培养基的内壁或盖的叶片，因为我们发现这些叶片比相同植物的其它叶片的易感性更高。在与带有被接种脱离叶片的盘相同的气候室中孵育接种有体外植林的罐。将表现出易感性相互作用的非转化植抹记为S(具有大量孢子形成的扩展伤口)或类别SQ(没有或很少孢子形成的扩展伤口)。将表现出抗相互尾的HT坏死)。将推定转化体移至新培养基中和/或移至温室的盆栽土中。DNA分析根据Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分离方法从体外枝条中分离DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列号1、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)进行PCR,以研究转化体中骨架载体DNA的存在。用HindIII消化4(ig的转化体DNA,通过凝月交电泳分离片段，并进行Southern印迹。使用R3a探针与印迹杂交，以检验T-DNA插入物的数量。不含边界的转化体对边界序列进行PCRT-DNA的右边界和左边界序列并非源自茄属植物，而是从pBIN19(pTiT37边界)中获得。进行PCR以分析这些边界序列是否存在于转化体中。使用以下引物分析右边界引物RBcheck2(5，-CCAATATATCCTGTCAAACA-3，)和引物SHcisl(5'誦CATCATCATCCCAAGTACAA-3')。当用载体pBINmf::R3a的DNA作为模板时，预期由这些引物得到1221bp的片段。使用引物SHcis2(5'-AAGGGCAAACATAACCATTC-3，)和引物LBeheckl(5'-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的组合分析左边界。当用载体pBINmf::R3a的DNA作为模板时，预期由这些引物得到1712bp的片段。使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以从转化体获得T-DNA侧翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化转化体的DNA。基因组步移适配子(GenomeWalkerAdaptors)与获得的片段连接来构建酶特异性文库。使用适配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGWl(5'-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)进行第一PCR以获得RB侧翼DNA。使用适配子引物AP2(5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5，-GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)进行巢式PCR。使用适配子引物API和引物SHGW3(5，-GTATGTATGTGTAGTTAATGGGGTAGT-3，)进行第一PCR以获得LB侧翼DNA。使用适配子引物AP2和引物SHGW4(5，-ACGGTTTCTAAATTAACGTAGCCAATA-3，)进行巢式PCR。实施例2同种源基因R3a转化体的选择带有减少T-DNA边界的载体pBINAW2b::R3a的构建使用pBIN19作为起始物构建包括RB和LB的新骨架载体。消化RB和LB的引物。使用引物URB(5'-GCGGTCCTGATCAATCGTCAC-3，)和RBK(5，-GGTACCTGACAGGATATATTGGCGGGTAAA-3，;具有Kpnl位点)从1156bp的pBIN19扩增RB上游DNA序歹'J。使用引物LBKX(5'-GGTACCTCTAGAGTTTACACCACAATATATCC-3，；具有Kpnl和Xbal^f立点)牙口DLB(5'-GCGGGTTTAACCTACTTCCTTT隱3，)乂人627bp的pBIN19扩增LB下游DNA序列。将两个PCR产物克隆到pGEM-T并测序。用Sacl和Kpnl消化从pGEM-T载体中释i文RB上游序列。用Kpnl和Nsil消化从32/KpnlRB上游序列和Kpnl/NsilLB下游序列与Sacl/Nsil消化的pUC28载体连接(BeneS等，1993)，得到质粒pUC28-LBRB。通过此连接将RB和LB彼此相连，仅通过KpnI和XbaI识别序列隔开。使644-bpBglII/Nsi片段从此载体中释放，并与来自于pBIN19的6966-bpBcll/Nsil骨架载体序列连接，得到质粒pBINAW2。通过此连接，删除了侧翼于RB的tetR基因。为获得在RB和LB间具有多于两个独特限制性位点的载体，用Kpnl消化质粒pUC28-LBRB并随后自连接，得到质粒pUC28-LBRBl。将来自质粒pUC28-LBRB的562-bpXbal片段与Xbal消化的pUC28-LBRBl连接，得到质粒pUC28-LBRB2。此质粒包含通过KpnI、Smal、BamHI和XbaI的多克隆位点隔开的RB上游序列和LB下游序列。用Kpnl和Nsil消化质粒pUC28-LBRB2。从琼脂糖凝胶中分离526-bp片l殳并将其与Kpnl/Nsil消化的pBINAW2连接，得到载体pBINAW2a。由退火引物MN01(5，-CGGCGCGCCCGGGTTAATTAAG-3，)和画02(5'-GATCCTTAATTAACCCGGGCGCGCCGGTAC-3，)制备双链寡核苦酸。此序列包含Kpnl和BamHI粘末端和Ascl、Smal和Pacl的限制性位点。将此寡核香酸与Kpnl/BamHI消化的pBINAW2a连接，得到载体pBINAW2b。通过将SH23-2的Pacl/Ascl基因组DNA片段克隆到Pacl/Ascl消化的pBINAW2b得到载体pBINAW2b::R3a。SH23-2是细菌人工染色体(BAC)SH23的亚克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并将7-10kb部分连接到载体pBINPLUS的BamHI位点。载体pBINAW2b::R3a中的T-DNA包含9-kb的SH23-2pBINPLUS亚克隆的片段，基因R3a的编码序列(CDS)位于其中。3849-bpCDS(在植物转化后)受存在于SH23-2中R3a最初的启动子和终止子的调控(图5)。从二倍体马铃薯克隆SH83-92-488中分离基因组片段SH23-2(Huang等，2005)。使用辅助质粒pRK2013通过三亲交配将二元载体pBINAW2b::R3a转化到根癌农杆菌菌抹AGL-1中(Figurski和Helinski,1979)。马铃薯的转化和转化体的选择根据Visser等(1991a)描述的方法，将来自马铃薯栽培种'Desiree'的体外生长植物的节间插条通过根癌农杆菌共培养进行转化。用根癌农杆菌COR308或AGL-1中的pBINAW2b::R3a转化马铃薯栽培种'Desiree'。没有进行选择。在4周后，收获第一个枝条并连续收获枝条约3个月。每个茎外植体收获了不超过两个再生体，并使枝条生长于玻璃罐(直径10cm)或塑料罐(直径15cm)中的MS30培养基上。每个罐包含8个插条。在插条和罐的内壁间留出2至3cm的空间。DesireeR3a转化体的PCR选择1至2周后，收集8个或更多独立枝条的叶或茎材料并建库(库的大小依据所期望转化体的频率)。根据Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分离方法在96孔微量滴定板中分离这些库中枝条的DNA。4吏用引物AL79(5，-GAGAATGGAAGATTTGGGTGAAG-3，)和AL80(5'-CTAATCTCACCAGTTGGCTGTTC-3，)对分离自再生体库的DNA进行PCR分析，以一全测转化体的存在。在PCR阳性库中，在96孔孩吏量滴定板中收集单个枝条的叶片和/或茎材料，并使用CTAB基因组DNA分离步骤分离基因组DNA。使用引物AL79(5'-GAGAATGGAAGATTTGGGTGAAG-3，)和AL80(5'-CTAATCTCACCAGTTGGCTGTTC-3，)对分离自单个再生体的DNA进行PCR分析，以检测转化体的存在。通过avr3进行体外选择使体外植抹在24。C和16小时光/8小时黑暗下生长。将带有3至4片完全发育叶片的植抹用于体外接种。根据马铃薯基因型，在2至4周后可以对植抹进行接种。34通过吸取10(il液滴的游动孢子悬液(2.5xio4孢子/ml)在近轴侧接种每个体外植林的3个最大叶片(每叶片l个斑点)。在无菌条件下进行接种物制备和接种。排除接触罐或培养基的内壁或盖的叶片，因为我们发现这些叶片比相同植物的其它叶片的易感性更高。在与带有被接种脱离叶片的盘相同的气候室中孵育接种有体外植林的罐。将表现出易感性相互作用的非转化植抹记为S(具有大量孢子形成的扩展伤口)或类别SQ(没有或很少孢子形成的扩展伤口)。将表现出抗相互作用的推定转化体记为类别R(无症状或局部的HR样坏死)或类别RQ(拖尾的HR坏死)。将推定转化体移至新培养基中和/或移至温室的盆栽土中。马铃薯栽培种Desiree的无标记R3a转化效率用根癌农杆菌COR308或才艮癌农杆菌Agl-l中的pBINAW2b::R3a接种约5,000个马铃薯栽培种Desiree的茎节间或叶外植体。表2中显示了收获枝条的数量、获得的PCR阳性枝条的频率和显示出表型的枝条的频率。对于COR308,没有收获的枝条被记为PCR阳性，然而对于AGL-l,此百分比大于1.5。/。。在这些PCR阳性转化体中，超过60%显示出R3a抗性。因此，通过高毒力农杆菌菌林AGL1的转化可以产生大量PCR阳性枝条，其中有超过60%表现出表型。表2.通过高毒力AGL1农杆菌菌抹使R3a基因高效的无标记转化到Desiree马铃薯<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>根据Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分离方法从体外枝条中分离DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列号l、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)进行PCR,以研究转化体中骨架载体DNA的存在。用HindIII消化4pg的转化体DNA，通过凝胶电泳分离片段，并进行Southern印迹。使用R3a探针与印迹杂交，以检验T-DNA插入物的数量。单拷贝且不含载体DNA的转化体的选择对于基因内或同种源基因转化体的一个要求应该是其不具有载体DNA或多个T-DNA的插入物。有报道在20至75%的转化植物中发生有边界远处的DNA整合到宿主植物的基因组中。使用针对pBIN19载体四个开放阅读框的引物通过PCR分析所选不含标记的R3a抗性马铃薯转化体中骨架载体DNA的存在。在38个测试的R3a抗性马铃薯转化体中，20个转化体对全部5条DNA片段均为阴性。使用R3a作为探针通过Southern印迹杂交进一步分析这20个不含载体DNA的转化体。这些分析显示大多数转化体包含3个或更少拷贝的T-DNA插入。此外，在所分析的20个转化体中，8个包含单个T-DNA插入。这表明不使用选择标记基因来获得不含骨架载体DNA,仅包含一个T-DNA插入物的R3a转化体是可行的。不含边界的转化体对边界序列进4亍PCRT-DNA的右边界和左边界序列并非源自茄属植物，而是从pBIN19(pTiT37边界)中获得。进行PCR以分析这些边界序列是否存在于转化体中。使用以下引物分析右边界引物RBcheckl(5'-CCAATATATCCTGTCAGGTA陽3，)和引物SHcisl(5'画CATCATCATCCCAAGTACAA-3，)。当用载体pBINAW2b::R3a的DNA作为模板时，使用这些引物预期得到795bp的片段。使用引物SHcis2(5'-AAGGGCAAACATAACCATTC-3，)和引物LBcheckl(5，-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的组合分析左边界。当用载体pBINAW2b::R3a的DNA作为模板时，使用这些引物预期得到1084bp的片段。遞^7差西*#移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以从转化体获得T-DNA侧翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化转化体的DNA。基因组步移适配子与获得的片段连接来构建酶特异性文库。使用适配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC隱3，)和引物SHGW1(5，-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)进行第一PCR以获得RB侧翼DNA。使用适配子引物AP2(5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5'-GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)进行巢式PCR。使用适配子引物API和引物SHGW3(5，-GTATGTATGTGTAGTTAATGGGGTAGT-3，)进行第一PCR以获得LB侧翼DNA。使用适配子引物AP2和引物SHGW4(5，-ACGGTTTCTAAATTAACGTAGCCAATA-3，)进行巢式PCR。同种源基因R3a转化体的选择使用上述Genomewalkingkit分析8个不含标记和载体DNA的单拷贝R3a转化体中不存在边界序列。8个转化体中有6个转化体不含任何右边界序列，然而8个转化体中有5个转化体不含任何左边界序列。观察到多达500bp的删除。8个转化体中有4个转化体不含任何源自农杆菌的T-DNA边界序列。这些转化体是同种源基因的，所依据的定义是它们不包含任何非马铃薯来源的序列，且这些转化体具有在天然基因组背景中的插入，此插入与在发现此基因的最初马铃薯物种(即矮茄)中发现的插入相同。实施例3全部马铃薯GBSS-IRT-DNA载体的构建T-DNA序列完全源于马铃薯GBSSI基因组序列。为了克隆延长的GBSSI启动子，确定了通常所用启动子的HindIII位点上游(Visser等，1991b;vanderLeij等，1991a;登录号X58453)直到BglII位点0.6kb上游(vanderLeij等，1991a)的序列。使用质粒pWAM101的DNA(vanderLeij等，1991b)作为模板，通过引物GBSS画O(5'-TACCGCTACCACTTGACATTC-3，)和BINMCS(5'-GCACCCCAGGCTTTACACTTT-3，)进行此PCR。在BglII和HindIII之间的738-bp序列与Dai等(1996)(登录号X83220)公布的序列具有高度同源性(98%—致)。设计引物来扩增GBSSI启动子和上游区域引物UPGBX(5'-CTCTAGAAGTTCGAGACACTGGCTACG陽3，；具有Xbal位点)和？I物PGBB(5，-GGATCCTGGAGGAGATGAGTAAAAGTTA-3，；具有BamHI位点)。这些引物用在以pWAM200DNA为模板的PCR中。载体pWAM200包含与载体pWAMlOO(vanderLeij等，1991a)相同但克隆在pMTL24(Chambers等，1988)中的GBSSI基因组DNA的6.5-kbBglII片段。将1528-bpPCR产物克隆到pGEM-T并测序。根据vanderLeij等(1993)(登录号X66826)公布的序列设计GBBSI终止子和下游序列的引物。引物TGBB(5，-GGATCCAAACGTATTTACTAGCGAACT-3，；具有BamHI位点)和DTGBK(5,-GGTACCAAAGAGACAGGTGCCGTTAT-3，；具有Kpnl位点)扩增出658-bpPCR产物，其包含来自质粒pWAM200的GBSSI终止子和下游序列。将此产物克隆到pGEM-T并测序。用Xbal和BamHI消化从pGEM-T载体中释方文延长的GBSSI启动子。用BamHI和Kpnl消化从pGEM-T载体中释放延长的GBSSI终止子。将这两个片段与Xbal/Kpnl消化的pUC28连接(BeneS等，1993),得到质粒pUC28-PTGB。随后用Xbal和Kpnl消化质粒pUC28-PTGB,并将释力文的片段与Xbal/Kpnl消化的pBINAW2a载体连接(参见实施例1)。在得到的载体pBINAW3中，延长的GBSSI启动子侧翼于LB且GBSSI终止子侧翼于RB。从载体pIRMAS中分离1390-bpBamHI片段，其包含GBSSIcDNA中部的反向重复，具有由马铃薯GBSSIcDNA组成的间隔子序列(Heilersig等，2006)。将此片段克隆到BamHI消化的pBINAW3。得到的二元载体pBINAW4包含GBSSI基因的反义-正义反向重复，其位于pBIN19LB和RB序列紧邻侧的延长的GBSSI启动子和延长的GBSSI终止子之间。使用辅助质粒pRK2013通过三亲交配将二元载体pBINAW4转化到才艮癌农杆菌菌株AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。马铃薯的转化和转化体的选择才艮据Visser等(1991a)描述的方法，将来自马铃薯栽培种'Aventra'或'Aveka'的体外生长植物叶片的节间插条通过根癌农杆菌共培养进行转化。没有进行选择。在4周后，收获第一个枝条并连续收获枝条约3个月。每个茎外植体收获了不超过两个再生体，并使枝条生长于玻璃罐(直径10cm)或塑料罐(直径15cm)中的MS30培养基上。每个罐包含8个插条。在插条和罐的内壁间留出2至3cm的空间。AvekaGBSS-IR转化体的PCR选择1至2周后，收集8个或更多独立枝条的叶或茎材料并建库(库的大小依据所期望转化体的频率)。根据Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分离方法在96孔微量滴定板中分离这些库中枝条的DNA。使用引物AMYMLF(5，-AGATAAGCTTTCTCATTCCTTGC-3，)和AMYMLR(5'-TCCTCCAGGATCCTTCTGG-3，)对分离自再生体库的DNA进行PCR分析，以检测转化体的存在。在PCR阳性库中，在96孔微量滴定板中收集单个枝条的叶片和/或茎材料，并使用CTAB基因组DNA分离步骤分离基因组DNA。使用引物AMYMLF(5，-AGATAAGCTTTCTCATTCCTTGC-3，)和AMYMLR(5，-TCCTCCAGGATCCTTCTGG-3,)对分39离自单个再生体的DNA进行PCR分析，以检测转化体的存在。体外块茎形成向PCR阳性枝条中加入20ml液体培养基，所述培养基由加有325g/L蔗糖和1.75g/LCCC(氯化氯胆碱，或矮壮素)的KI培养基('knolinducerend，(=块茎诱导)培养基，Duchefa)组成。将盆置于18。C的黑暗生长室中。在2至4周后大多数枝条上发育出小块茎。淀粉染色将小块茎切下并用碘溶液染色以评估淀粉颗粒中直链淀粉的存在。使用显微镜检查淀粉颗粒的染色。马铃薯栽培种Aveka的无标记GBSS-IR转化效率用根癌农杆菌AGL-1中的pBINAW4接种约2,000个马铃薯栽培种Aveka的茎节间或叶外植体。总共收获了3787个枝条，在其中获得了28个PCR阳性枝条(0.74%)。在这28个枝条中，72%不含直链淀4分表型。DNA分析根据Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分离方法从体外枝条中分离DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列号1、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)进行PCR，以研究转化体中骨架载体DNA的存在。用BamHI、HindIII和EcoRI消化4fig的转化体DNA,通过凝月交电泳分离片段，并进行Southern印迹。使用GBSS终止子探针与印迹杂交，以检验T-DNA插入的数量。单拷贝且不含载体DNA的转化体的选择对于基因内转化体的一个要求应该是其不具有载体DNA或多个T-DNA的插入物。使用针对pBIN19载体四个开放阅读框的引物通过PCR分析18个所选不含标记和直链淀粉的Aveka转化体中骨架载体DNA的存在。在18个测试的R3a抗性马铃薯转化体中，8个转化体对全部5条DNA片段均为阴性。使用GBSS终止子序列作为探针通过Southern印迹杂交进一步分析这8个不含载体DNA的转化体。这些分析显示全部转化体包含1或2个拷贝的T-DNA插入。此外，在所分析的8个转化体中，5个包含单个T-DNA插入。这表明不使用选择标记基因来获得不含骨架载体DNA,仅包含一个T-DNA插入物的GBSS-IR转化体是可行的。不含边界的转化体对边界序列进行PCRT-DNA的右边界和左边界序列并非源自茄属植物，而是从pBIN19(pTiT37边界)中获得。进行PCR以分析这些边界序列是否存在于转化体中。使用以下各套引物分析右边界对于右边界分析參AmyMLRB:5'-TCAGGTACCAAAGAGACAGG-3'和AmyMLsenseterm:5'-GGAGCAGAAGGATCCAAACG-3，作为一套引物联合用于PCRAmyMLterml:5'-TGCCGTTATGTAAAGGAG-3，和AmyMLsenseterm:5，-GGAGCAGAAGGATCCAAACG-3，作为一套引物联合用于PCR參AmyMLterm2:5'-AGCTTCTTTCATATGACCAACC-3，和AmyMLsenseterm:5'画GGAGCAGAAGGATCCAAACG画3，作为一套引物联合用于PCR对于左边界分析41參AmyMLLB:5，-CAGGATATATTGTGGTGTAAACTC-3，和GBSS23:5，-TCAATGTTTGTTACATTTCTTCC-3，作为一套引物联合用于PCR參AmyMLp腿l:5'-TATCTTTGCTCAGGACCCTG-3，和AmyMLas-proml:5'-GCAGAAGGATCCTGGAGG-3，作为一套引物联合用于PCR參AmyMLprom2:5，-AACTCGAAGTCAGCCTGCG-3，和AmyMLas-proml:5'-GCAGAAGGATCCTGGAGG画3，作为一套引物联合用于PCR參GBSS9:5'-CAAATGCAACAGTATCTTGTACC-3'和GBSSO:5'陽ACCGCTACCACTTGACATTCC-3作为一套引物联合用于PCR遞^差^逸#移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以从转化体获得T-DNA侧翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化转化体的DNA。基因组步移适配子与获得的片段连接来构建酶特异性文库。使用适配子引物API(5，-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGW1(5，-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)进行第一PCR以获得RB侧翼DNA。使用适配子引物AP2(5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5'陽GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)进行巢式PCR。使用适配子引物API和引物GBSSIGW1(5'-TTTACTCATCTCCTCCAGGATCCTTCT-3，)进行第一PCR以获得LB侧翼DNA。使用适配子引物AP2和引物GBSSIGW2(5'-ATCTCCTCCAGGATCCTTCTGCTCCTC-3，)进行巢式PCR。基因内GBSS-IR转化体的选择如上所述使用PCR分析来分析5个不含标记和载体DNA的单拷贝GBSS-IR转化体中不存在边界序列。5个转化体中有2个转化体不含任何右边界序列，然而这些转化体显示出大的左边界序列的删除。在分析的5个转化体中有2个转化体不含任何源自农杆菌的T-DNA边界序列。这些转化体是基因内的，所依据的定义是它们不包含任何非马铃薯来源的序列(参见图7)。实施例4不含标记的R3a-GBSS-IR构建体全部马铃薯R3a-GBSS-IRT-DNA载体的构建T-DNA序列完全源于马铃薯GBSSI基因组序列。为了克隆延长的GBSSI启动子，确定了通常所用启动子的HindIII位点上游(Visser等，1991b;vanderLeij等，1991a;登录号X58453)直到BglII位点0.6kb上游(vanderLeij等，1991a)的序列。使用质粒pWAMlOl的DNA(vanderLeij等，1991b)作为才莫板，通过引物GBSS-0(5'-TACCGCTACCACTTGACATTC-3，)和BINMCS(5'-GCACCCCAGGCTTTACACTTT-3，)进行此PCR。在BglII和HindIII之间的738-bp序列与Dai等(1996)(登录号X83220)公布的序列具有高度同源性(98%—致)。设计引物来扩增GBSSI启动子和上游区域引物UPGBX(5，-CTCTAGAAGTTCGAGACACTGGCTACG-3，；具有Xbal4立点)和引物PGBB(5，-GGATCCTGGAGGAGATGAGTAAAAGTTA-3';具有BamHI位点)。这些引物用在以pWAM200DNA为模板的PCR中。载体pWAM200包含与载体pWAMlOO(vanderLeij等，1991a)相同但克隆在pMTL24(Chambers等，1988)中的GBSSI基因组DNA的6.5-kbBglII片段。将1528-bpPCR产物克隆到pGEM-T并测序。根据vanderLeij等(1993)(登录号X66826)公布的序列设计GBBSI终止子和下游序列的引物。引物TGBB(5，-GGATCCAAACGTATTTACTAGCGAACT陽3，；具有BamHI位点)和DTGBK(5，-GGTACCAAAGAGACAGGTGCCGTTAT-3，；具有Kpnl位点)扩增出658-bpPCR产物，其包含来自质粒pWAM200的GBSSI终止子和下游序列。将此产物克隆到pGEM-T并测序。用Xbal和BamHI消化从pGEM-T载体中释放延长的GBSSI启动子。用BamHI和Kpnl消化从pGEM-T载体中释放延长的GBSSI终止子。将这两个片段与Xbal/Kpnl消化的pUC28连接(BeneS等，1993),得到质粒pUC28-PTGB。随后用Xbal和Kpnl消化质粒pUC28-PTGB,并将释》文的片段与Xbal/Kpnl消化的pBINAW2a载体连接(参见实施例1)。在得到的载体pBINAW3中，延长的GBSSI启动子侧翼于LB且GBSSI终止子侧翼于RB。从载体pIRMAS中分离13卯-bpBamHI片段，其包含GBSSIcDNA中部的反向重复，具有由马铃薯GBSSIcDNA组成的间隔子序列(Heilersig等，2006)。将此片段克隆到BamHI消化的pBINAW3。得到的二元载体pBINAW4包含GBSSI基因的反义-正义反向重复，其位于pBIN19LB和RB序列紧邻侧的延长的GBSSI启动子和延长的GBSSI终止子之间。载体pBINAW4a源于载体pBINAW4。将具有两个Kpnl粘末端的双链寡核苷酸与pBINAW4的Kpnl位点连接。此双链寡核苷酸具有Ascl、Smal和PvuI的限制性位点。寡核苷酸可能有两个方向一种是AscI位点最靠近RB，而另一种是PvuI位点最靠近RB。选择第一种方向。通过将SH23-2的Pacl/Ascl基因组DNA片段克隆到Pvul/Ascl消化的pBINAW4a得到载体pBINAW4a::R3a。SH23-2是细菌人工染色体(BAC)SH23的亚克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并将7-10kb部分连接到载体pBINPLUS的BamHI位点。使用限制性酶Pacl和Ascl,从pBINPLUS::R3a上切下9-kb片段(截短的SH23-2)并将此片段与pBINAW4a的Pvul和Ascl位点连才妾。T-DNA包含SH23-2的片段，R3a基因的编码序列(CDS)位于其中。此CDS(在植物转化后)受同样存在于SH23-2中R3a最初的启动子和终止子的调控。从二倍体马铃薯克隆SH83-92-488中分离基因组片段SH23-2(Huang等，2005)。使用辅助质粒pRK2013通过三亲交配将二元载体pBINAW4a::R3a(图6)转化到根癌农杆菌菌林AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。马發#的脊^和^必傳的这举根据Visser等(1991a)描述的方法，将来自马铃薯栽培种'Desiree'、'Aventra'或'Aveka'的体外生长植物的节间插条通过根癌农杆菌共培养进行转化。根据相同的方法用根癌农杆菌菌株AGL-1中pBINAW4a::R3a转化马铃薯栽培种'Desiree'。没有进行选择。在4周后，收获第一个枝条并连续收获枝条约3个月。每个茎外植体收获了不超过两个再生体，并使枝条生长于玻璃罐(直径10cm)或塑料罐(直径15cm)中的MS30培养基上。每个罐包含5个插条。在插条和罐的内壁间留出2至3cm的空间。用于疾病测试的体外试验使体外植抹在24。C和16小时光/8小时黑暗下生长。将带有3至4片完全发育叶片的植抹用于体外接种。根据马铃薯基因型，在2至4周后可以对植抹进行接种。通过吸取10pl液滴的游动孢子悬液(2.5x104孢子/ml)在近轴侧接种每个体外植抹的3个最大叶片(每叶片l个斑点)。在无菌条件下进行接种物制备和接种。排除接触罐或培养基的内壁或盖的叶片，因为我们发现这些叶片比相同植物的其它叶片的易感性更高。在与带有被接种脱离叶片的盘相同的气候室中孵育接种有体外植抹的罐。将表现出易感性相互作用的非转化植抹记为S(具有大量孢子形成的扩展伤口)或类别SQ(没有或很少孢子形成的扩展伤口)。将表现出抗相互尾的HR坏死)。将推定转化体移至新培养基中和/或移至温室的盆栽土中。45向PCR阳性枝条中加入20ml液体培养基，所述培养基由加有325g/L蔗糖和1.75g/LCCC(氯化氯胆碱，或矮壮素)的KI培养基('knolinducerend'(=块茎诱导)培养基，Duchefa)组成。将盆置于18°C的黑暗生长室中。在2至4周后大多数枝条上发育出小块茎。淀粉染^将小块茎切下并用碘溶液染色以评估淀粉颗粒中直链淀粉的存在。使用显微镜检查淀粉颗粒的染色。DiVJ为、浙根据Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分离方法从体外枝条中分离DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列号1、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)进行PCR,以研究转化体中骨架载体DNA的存在。用HindlII消化4iig的转化体DNA,通过凝胶电泳分离片段，并进行Southern印迹。使用R3a探针与印迹杂交，以检验T-DNA插入的数量。不含边界的转化体T-DNA的右边界和左边界序列并非源自茄属^t物，而是从pBIN19(pTiT37边界)中获得。进行PCR以分析这些边界序列是否存在于转化体中。使用以下引物分析右边界引物RBcheckl(5，-CCAATATATCCTGTCAGGTA-3，)和引物SHcisl(5，-CATCATCATCCCAAGTACAA-3，)。当用载体pBINAW4a::R3a的DNA作为模板时，使用这些引物预期得到795bp的片段。使用引物GBSSIcisl(5，-CTCTGTCAACAGCCAAATAG-3，)和引物LBcheckl(5，-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的组合分析左边界。当用载体pBINAW4a::R3a的DNA作为模板时，使用这些引物预期得到836bp的片段。遽^差茵邀步移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以从转化体获得T-DNA侧翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化转化体的DNA。基因组步移适配子与获得的片段连接来构建酶特异性文库。使用适配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGWl(5'隱TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)进行第一PCR以获得RB侧翼DNA。使用适配子引物AP2(5，-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5'-GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)进行巢式PCR。使用适配子引物API和引物GBSSIGW1(5'-TTTACTCATCTCCTCCAGGATCCTTCT-3，)进行第一PCR以获得LB侧翼DNA。使用适配子引物AP2和引物GBSSIGW2(5'-ATCTCCTCCAGGATCCTTCTGCTCCTC-3，)进行巢式PCR。实施例5不含标记的同种源基因R3a-blbl构建体载体pBINAW2b::blbl-R3a是T-DNA中没有选择基因的二元质粒，且其源自载体pBINAW2b::R3a。通过将SH23-2的Pacl/Ascl基因组DNA片段克隆到Pvul/Ascl消化的pBINAW4a得到载体pBINAW4a::R3a。通过使用限制性酶PacI和AscI从亚克隆中克隆SH23-2片段，并将其与pBINAW2b的Pacl和Ascl位点连接来构建载体pBINAW2b::R3a(参见实施例1)。SH23-2是细菌人工染色体(BAC)SH23的亚克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并将7-10kb部分连接到载体pBINPLUS的BamHI位点。在构建pBINAW2b::R3a后，使用限制性酶Ascl和Sbfl将RGC2片段置于Ascl位点和右边界之间。RGC2是pBINPLUS亚克隆，且与SH23-2类似，其也是通过将Sau3AI部分消化BAC得到的7-10kb部分(SPB4)(vanderVossen等，2003)克隆进pBINPLUS的BamHI位点来构建的。使用聚合酶链式反应(PCR)来扩增6.5-kb的RGC2片段。所用的引物延长具有Ascl和Sbfl位点。因此扩增的片段可以被这些酶消化，且随后将此片段与pBINAW2b::R3a的Ascl和Sbfl位点连接。全部pBINAW2b::blbl-R3a构建体的大小为23,147bp。T-DNA侧翼于边界；左边界(LB)和右边界(R)。这些边界源自农杆菌，并起用于农杆菌区分载体和T-DNA间边界的信号作用。此T-DNA通过农杆菌被整合到马铃薯基因组中。T-DNA包含SH23-2和RGC2pBINPLUS亚克隆的片段，其中R3a的编码序列(CDS)位于SH23-2上且Rpi-blbl的CDS位于RGC2上。T-DNA包含SH23-2的片段，R3a基因的编码序列(CDS)位于其中。这些CDS(在植物转化后)受同样存在于SH23-2和RGC2中R3a和Rpi-blbl最初的启动子和终止子的调控。从二倍体马铃薯克隆SH83-92-488中分离基因组片段SH23-2(H腿g等，2005)，且从5b/謹附W6ocas她應中分离基因组片段RGC2。T-DNA中不存在用于选择转基因植物的选择基因(如NPTII)。只有基因组SH23-2片段、基因组RGC2片段和边界序列将被整合进入植物基因组。<吏用辅助质4立pRK2013通过三亲本交配将二元载体pBINAW2b::blbl-R3a转化到根癌农杆菌菌抹AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。马發#^脊化和餘^#的遂#根据Visser等(1991a)描述的方法，将来自马铃薯栽培种'Desiree'的体外生长植物的节间插条通过根癌农杆菌共培养进行转化。用根癌农杆菌菌抹AGL-1中pBINAW2b::blbl-R3a转化马铃薯栽培种'Desiree'。没有进行选择。在4周后，收获第一个枝条并连续收获枝条约3个月。每个茎外植体收获了不超过两个再生体，并使枝条生长于玻璃罐(直径10cm)或塑料罐(直径15cm)中的MS30培养基上。每个罐包含5个插条。在插条和罐的内壁间留出2至3cm的空间。通过avr3进行体外选择使体外植林在24'C和16小时光/8小时黑暗下生长。将带有3至4片完全发育叶片的植抹用于体外接种。根据马铃薯基因型，在2至4周后可以对植抹进行接种。通过吸取10(il液滴的游动孢子悬液(2.5x104孢子/ml)在近轴侧接种每个体外植株的3个最大叶片(每叶片l个斑点)。在无菌条件下进行接种物制备和接种。排除接触罐或培养基的内壁或盖的叶片，因为我们发现这些叶片比相同植物的其它叶片的易感性更高。在与带有被接种脱离叶片的盘相同的气候室中孵育接种有体外植株的罐。将表现出易感性相互作用的非转化植抹记为S(具有大量孢子形成的扩展伤口)或类别SQ(没有或很少孢子形成的扩展伤口)。将表现出抗相互作用的推定转化体记为类别R(无症状或局部的HR样坏死)或类别RQ(拖尾的HR坏死)。将推定转化体移至新培养基中和/或移至温室的盆栽土中。针对blbl基因表达再次分析推定转化体。因此，用IpOl接种或体外植物或温室植物叶片。对于分离的叶片分析，从温室生长植物上切下第三至第五完全发育的叶片(从顶端算起)并将其置于盘中水饱和的种花泡沫(Oasis,Grtinstadt,Germany)中。根据茄属植物叶片的形状和大小，将一个或多个叶片用于接种。通常，通过吸取10pl液滴的游动孢子悬液(5x104孢子/ml)在近轴侧对每个基因型接种IO个斑点。随后将盘用透明盖子盖住(有盖的盘)，转移至气候室中，并在16。C和16小时/8小时白天夜晚光周期下孵育。通过测定伤口大小(LS)、宏观评分或二者相结合来确定抗性水平。通常点接种6天后在使用与计算机相连的电子卡尺测定LS。从10次重复实验中计算平均LS。基于平均伤口大小，相对Bintje指定从0-9的相对分数(表2)。也检查伤口表型。此外根据以下进行宏观评分。将相容的相互作用分为S(具有大量孢子形成的易感性扩展伤口)或SQ(没有或很少孢子形成的扩展伤口)。将不相容的相互作用记为R(抗性的，无症状或局部的HR样坏死)或RQ(拖尾的HR坏死)。也观察到相容和不相容相互作用之间的中间表型(Q),如在每片复叶的2至3片小叶上的孢子形成和在其它小叶上的局部HR。Z)M4为、浙根据Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分离方法从体外一支条中分离DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列号l、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)进行PCR,以研究转化体中骨架载体DNA的存在。用HindIII消化4(ig的转化体DNA,通过凝胶电泳分离片段，并进行Southern印迹。使用R3a探针与印迹杂交，以检验T-DNA插入物的数量。不含边界的转化体对3##/{/迷存尸0T-DNA的右边界和左边界序列并非源自茄属才直物，而是从pBIN19(pTiT37边界)中获得。进行PCR以分析这些边界序列是否存在于转化体中。使用以下引物分析右边界引物RBcheckl(5'-CCAATATATCCTGTCAGGTA-3，)和引物RGCcisl(5，-CGCTTTCAGAATCTATTACT-3，)。当用载体pBINAW2b::blbl-R3a的DNA作为才莫板时，使用这些引物预期得到693bp的片段。使用引物SHcis2(5，-AAGGGCAAACATAACCATTC-3，)和引物LBcheckl(5'-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的组合分析左边界。当用载体pBINAW2b::blbl-R3a的DNA作为模板时，使用这些引物预期得到1084bp50的片段。遞^7差^遂,移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以从转化体获得T-DNA侧翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化转化体的DNA。基因组步移适配子与获得的片段连接来构建酶特异性文库。使用适配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物RGCGW1(5'-ATTTCATGCGCATATTCCCGATCAAAC-3，)进行第一PCR以获得RB侧翼DNA。使用适配子引物AP2(5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物RGCGW2(5'-TCCCGATCAAACTTAAATTACTAGACT-3，)进行巢式PCR。使用适配子引物API和引物SHGW3(5'-GTATGTATGTGTAGTTAATGGGGTAGT-3，)进行第一PCR以获得LB侧翼DNA。使用适配子引物AP2和引物SHGW4(5'陽ACGGTTTCTAAATTAACGTAGCCAATA-3,)进行巢式PCR。实施例6不含标记的R3a::蒸煮型不含标记的转化-选择不含直链淀粉-选择不含载体DNA和边界的转化体不含标记的R3a::蒸煮型基因StTLRP不含标记的转化-选择R3a-选择不含载体DNA和边界的转化体使用PCR引物LTF1(5，-GGATCCATGGGTTCCAAGGCAATTATGTT-3，)和LTR1(5，-GGATCCGAATGGCTTTATTCATACTTGTT-3，)扩增蒸煮型基因StTLRP(Klooste醒n2006)的编码序列。将360-bpPCR片段克隆进pGEM-T载体，并随后用BamHI消化。从琼脂糖凝胶中分离BamHI插入物，并将其与载体pBINAW4的大BamHI片段连接(参见实施例2)，因此将GBSSIcDNA反向重复替换为StTLRPcDNA序列。选择在GBSSI启动子和GBSSI终止子间StTLRPcDNA为正义方向的克隆，并将其命名为200880003086.6说明书第49/60页pBINAW7。将具有两个Kpnl粘末端的双链寡核苷酸与pBINAW7的Kpnl位点连接。此双链寡核苷酸具有Ascl、Smal和Pvul的限制性位点。寡核苷酸可能有两个方向一种是Ascl位点最靠近RB,而另一种是PvuI位点最靠近RB。选捧第一种方向。将得到的载体命名为pBINAW7a。通过将SH23-2的Pacl/Ascl基因组DNA片段克隆到Pvul/Ascl消化的pBINAW7a得到pBINAW7a::R3a。SH23-2是细菌人工染色体(BAC)SH23的亚克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC,并将7-10kb部分连接到载体pBINPLUS的BamHI位点。使用限制性酶Pacl和Ascl,从pBINPLUS::R3a上切下9-kb片段(截短的SH23-2)并将此片段与pBINAW7a的Pvul和Ascl^f立点连才妻。T-DNA包含SH23-2的片段，R3a基因的编码序列(CDS)位于其中。此CDS(在^i物转化后)受同样存在于SH23-2中R3a最初的启动子和终止子的调控。从二倍体马铃薯克隆SH83-92-488中分离基因组片段SH23-2(H腿g等，2005)。使用辅助质粒pRK2013通过三亲交配将二元载体pBINAW7a::R3a转化到根癌农杆菌菌林AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。马發多的脊化和發化傳的遂斧根据Visser等(1991a)描述的方法，将来自马铃薯栽培种'Desiree'、'Aventra'或'Aveka'的体外生长植物的节间插条通过根癌农杆菌共培养进行转化。根据相同的方法用根癌农杆菌菌株AGL-1中pBINAW4a::R3a转化马铃薯栽培种'Desiree'。没有进行选择。在4周后，收获第一个枝条并连续收获枝条约3个月。每个茎外植体收获了不超过两个再生体，并使枝条生长于玻璃罐(直径10cm)或塑料罐(直径15cm)中的MS30培养基上。每个罐包含5个插条。在插条和罐的内壁间留出2至3cm的空间。用于疾病测试的体外试验使体外植林在24。C和16小时光/8小时黑暗下生长。将带有3至4片完全发育叶片的植株用于体外接种。根据马铃薯基因型，在2至4周后可以对植抹进行接种。通过吸取10pl液滴的游动孢子悬液(2.5x104孢子/ml)在近轴侧接种每个体外植抹的3个最大叶片(每叶片1个斑点)。在无菌条件下进行接种物制备和接种。排除接触罐或培养基的内壁或盖的叶片，因为我们发现这些叶片比相同植物的其它叶片的易感性更高。在与带有被接种脱离叶片的盘相同的气候室中孵育接种有体外植抹的罐。将表现出易感性相互作用的非转化植抹记为S(具有大量孢子形成的扩展伤口)或类别SQ(没有或很少孢子形成的扩展伤口)。将表现出抗相互作用的推定转化体记为类别R(无症状或局部的HR样坏死)或类别RQ(拖尾的HR坏死)。将推定转化体移至新培养基中和/或移至温室的盆栽土中。蕃;^藝W》浙在对质构进行可视评分并在范围从坚实的/非粉状块茎(1)到极度粉状块茎(6)的公称值上进行分类后，将每种样品的三个块茎去皮并蒸汽蒸煮20分钟。D假为、浙根据Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分离方法从体外枝条中分离DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列号l、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)进行PCR,以研究转化体中骨架载体DNA的存在。用HindIII消化4的转化体DNA,通过凝月交电泳分离片段，并进行Southern印迹。使用R3a探针与印迹杂交，以检验T-DNA插入的数量。不含边界的转化体义,遂#淨/{/遽/户尸CWT-DNA的右边界和左边界序列并非源自茄属植物，而是从pBIN19(pTiT37边界)中获得。进行PCR以分析这些边界序列是否存在于转化体中。使用以下引物分析右边界引物RBcheckl(5，-CCAATATATCCTGTCAGGTA誦3，)和引物SHcisl(5，-CATCATCATCCCAAGTACAA-3，)。当用载体pBINAW4a::R3a的DNA作为模板时，使用这些引物预期得到795bp的片段。使用引物GBSSIcisl(5'-CTCTGTCAACAGCCAAATAG-3，)和引物LBcheckl(5，-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的组合分析左边界。当用载体pBINAW4a::R3a的DNA作为模板时，使用这些引物预期得到836bp的片段。遞^差^逸#移使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以从转化体获得T-DNA侧翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化转化体的DNA。基因组步移适配子与获得的片段连接来构建酶特异性文库。使用适配子引物API(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGWl(5，-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)进行第一PCR以获得RB侧翼DNA。使用适配子引物AP2(5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5，-GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA-3，)进行巢式PCR。使用适配子引物API和引物GBSSIGW3(5'-ATTGCCTTGGAACCCATGGATCCTTCT-3，)进行第一PCR以获得LB侧翼DNA。使用适配子引物AP2和引物GBSSIGW4(5'-TGGAACCCATGGATCCTTCTGCTCCTC-3，)进行巢式PCR。实施例7具有减弱区的不含标记的同种源基因R3aGBSS-IR构建体构建具有LB外序列以防止骨架栽体DNA整合的全马铃薯T-DNA载体骨架载体(非T-DNA)序列在植物基因组中的整合通常发生在根癌农才干菌專争4匕期间(Kononov等，1997;Ramanathan禾口Veluthambi,1995;VanderGraaff等，1996;Wenck等，1997;Wolters等，1998b)。Wang等(1987)报道了"边界重复的旁侧序列增强(在右侧)或减弱(在左侧)它们的活性"。他们定义了'减弱区，靠近质粒pTiC58的LB的T-DNA的363-bp富含AT的EcoRI/BclI片段。DeBuck等(2000)指出"有可能删除内部边界区(存在于载体来源的最初Ti质粒的一段T-DNA)会引起LB重复的无效缺口，导致位于下游的载体序列连读通过LB和转移"。Kuraya等(2004)报道"来自对照载体的'载体骨架，的转移主要是因为T-DNA转移中间产物形成的无效终止，且其它LB序列有效地抑制此转移"。基于这些报道，我们已经克隆了额外的胭脂碱型LB以及在二元载体的LB外的侧翼减弱区，以防止骨架载体载体向植物基因组中的整合。从根癌农杆菌菌枒、LBA958(由P.Hooykaas博士4是供，LeidenUniversity,TheNetherlands)中分离Ti质粒pTiC58Cl。Gielen等(1999)公布了此Ti质粒的T-DNA区域的完整序列。使用引物LB2(5，-TAAGCGAGAAATGAATAAGAAG-3，)和LBatt(5，-GCGAGACAGATGAAACGAAGTA-3，)通过PCR从此Ti质粒中扩增出8S5-bp片段。将此片段克隆到pGEM-T并测序。随后将此质粒(pAttl-1)转化到为danf和dcm—的大肠杆菌菌抹GM2163(Fermentas)中。用Bell消化从此菌林中分离的质粒DNA,释放出包含减弱区和LB序列的Bell片段。将此片段克隆到经Bell消化和碱性磷酸酶处理的pBINAW2a质粒DNA中，所述pBINAW2a质粒DNA分离自大肠杆菌菌株GM2163转化的培养物。分析一些菌落是否存在右方向的Bell片段。这样产生了二元载体pBINAW5。随后，将来自于包含延长的GBSSI启动子、GBSSI反向重复和延长的GBSSI终止子的载体pBINAW4(参见实施例2)的Xbal/Kpnl片段克隆到pBINAW5的Xbal和Kpnl位点，得到二元载体pBINAW6。载体pBINAW6a源自载体pBINAW6。将具有两个Kpnl粘末端的双链寡核苦酸与pBINAW6的Kpnl位点连接。此双链寡核苷酸具有Ascl、Smal和PvuI的限制性位点。寡核苷酸可能有两个方向一种是AscI位点最靠近RB,而另一种是PvuI位点最靠近RB。选择第一种方向。通过将SH23-2的Pacl/Ascl基因组DNA片段克隆到Pvul/Ascl消化的pBINAW6a得到pBINAW6a::R3a。SH23-2是细菌人工染色体(BAC)SH23的亚克隆(Huang等，2005)。用Sau3AI部分消化此BAC，并将7-10kb部分连接到载体pBINPLUS的BamHI位点。使用限制性酶Pacl和Ascl,从pBINPLUS::R3a上切下9-kb片段(截短的SH23-2)并将此片段与pBINAW6a的Pvul和Ascl位点连孑妄。T-DNA包含SH23-2的片段，R3a基因的编码序列(CDS)位于其中。此CDS(在^f直物转化后)受同样存在于SH23-2中R3a最初的启动子和终止子的调控。从二倍体马铃薯克隆SH83-92-488中分离基因组片段SH23-2(H腿g等，2005)。使用辅助质粒pRK2013通过三亲交配将二元载体pBINAW6a::R3a转化到根癌农杆菌菌抹AGL-1中(Figurski和Helinski，1979)。马發J1W^化和脊^沐的遞脊根据Visser等(1991)描述的方法，将来自马铃薯栽培种'Desiree'、'Aventra'或'Aveka'的体外生长植物的节间插条通过根癌农杆菌共培养进行转化。用根癌农杆菌菌才朱AGL-1中pBINAW6a::R3a转化马铃薯栽培种'Desiree'。没有进行选择。在4周后，收获第一个枝条并连续收获枝条约3个月。每个茎外植体收获了不超过两个再生体，并使枝条生长于玻璃罐(直径10cm)或塑料罐(直径15cm)中的MS30培养基上。每个罐包含5个插条。在插条和罐的内壁间留出2至3cm的空间。用于疾病测试的体外试验使体外植抹在24。C和16小时光/8小时黑暗下生长。将带有3至4片完全发育叶片的植抹用于体外接种。根据马铃薯基因型，在2至4周后可以对植株进行接种。通过吸取10pi液滴的游动孢子悬液(2.5x104孢子/ml)在近轴侧接种每个体外植抹的3个最大叶片(每叶片1个斑点)。在无菌条件下进行接种物制备和接种。排除接触罐或培养基的内壁或盖的叶片，因为我们发现这些叶片比相同植物的其它叶片的易感性更高。在与带有被接种脱离叶片的盘相同的气候室中孵育接种有体外植林的罐。将表现出易感性相互作用的非转化植株记为S(具有大量孢子形成的扩展伤口)或类别SQ(没有或很少孢子形成的扩展伤口)。将表现出抗相互作用的推定转化体记为类别R(无症状或局部的HR样坏死)或类别RQ(拖尾的HR坏死)。将推定转化体移至新培养基中和/或移至温室的盆栽土中。谬^块^多成向PCR阳性枝条中加入20ml液体培养基，所述培养基由加有325g/L蔗糖和1.75g/LCCC(氯化氯胆碱，或矮壮素)的KI培养基('knolinducerend，(=块茎诱导)培养基，Duchefa)组成。将盆置于18°C的黑暗生长室中。在2至4周后大多数枝条上发育出小块茎。将小块茎切下并用碘溶液染色以评估淀粉颗粒中直链淀粉的存在。使用显微镜检查淀粉颗粒的染色。，D福为、浙根据Rogers和Bendich(1988)所述的CTABDNA分离方法从体外枝条中分离DNA。使用引物NPT1和NPT2、trfAl和trfA2、insBl和insB2(序列号l、2、5、6、7和8;Wolters等，1998a)进行PCR,以研究转化体中骨架载体DNA的存在。用HindIII消化4|ig的转化体DNA，通过凝胶电泳分离片段，并进4亍Southern印迹。使用R3a探针与印迹杂交，以检验T-DNA插入的数量。不含边界的转化体对遂##/{/迷存PCiT-DNA的右边界和左边界序列并非源自茄属植物，而是从pBIN19(pTiT37边界)中获得。进行PCR以分析这些边界序列是否存在于转化体中。使用以下引物分析右边界引物RBcheckl(5'-CCAATATATCCTGTCAGGTA-3，)和引物SHcisl(5，-CATCATCATCCCAAGTACAA-3，)。当用载体pBINAW6a::R3a的DNA作为模板时，使用这些引物预期得到795bp的片段。使用引物GBSSIcisl(5'-CTCTGTCAACAGCCAAATAG-3，)和引物LBcheckl(5'-GGATATATTGTGGTGTAAAC-3，)的组合分析左边界。当用载体pBINAW6a::R3a的DNA作为模板时，使用这些引物预期得到836bp的片段。使用UniversalGenomeWalkerKit(Clontech)以从转化体获得T-DNA侧翼序列。用Dral、EcoRV、PvuII、Seal和Stul消化转化体的DNA。基因组步移适配子与获得的片段连接来构建酶特异性文库。使用适配子引物API(5，-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)和引物SHGWl(5，-TAAGTTTAATCAGAAGTTGGGTAGGAA-3，)进行第一PCR以获得RB侧翼DNA。使用适配子引物AP2(5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3，)和引物SHGW2(5'誦GTTGGGTAGGAAGCCTGCTCTTGGAAA陽3，)进行巢式PCR。使用适配子引物API和引物GBSSIGW1(5，-TTTACTCATCTCCTCCAGGATCCTTCT-3，)进行第一PCR以获得LB侧翼DNA。使用适配子引物AP258和引物GBSSIGW2(5'-ATCTCCTCCAGGATCCTTCTGCTCCTC-3，)进^f亍巢式PCR。表格表1.所报道的野生茄属物种晚疫病抗性的R基因和数量性状座位<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>参考文献Bene§V,Hostoms坊Z，ArnoldL,Pa￡esV(1993)Ml3andpUCvectorswithnewuniquerestrictionsitesforcloning.Gene130:151-152DeBuckS，DeWildeC，VanMontaguM，DepickerA(2000)T-DNAvectorbackbonesequencesarefrequentlyintegratedintothegenomeoftransgenicplantsobtainedbyAgrobacterium-mediatedtransformation.MolBreed6:459-468ChambersSP，PriorSE,BarstowDA，MintonNP(1988)ThepMTLnic—cloningvectors.I.ImprovedpUCpolylinkerregionstofacilitatetheuseofsonicatedDNAfornucleotidesequencing.Gene68:139-149DaiWL,DengW，CuiWY，ZhaoSY,WangXM(1996)Molecularcloningandsequenceofpotatogranule-boundstarchsynthasegene.ActaBotanicaSinica38:777-784FigurskiDH,HelinskiDR(1979)Replicationofanorigin-containingderivativeofplasmidRK2dependentonaplasmidfunctionprovidedintrans.ProcNatlAcadSciUSA76:1648-1652GielenJ，TerrynN,VillarroelR，VanMontaguM(1999)CompletenucleotidesequenceoftheT-DNAregionoftheplanttumour-inducingAgrobacteriumtumefaciensTiplasmidpTiC58.JExpBot50:1421-1422HeilersigHJB，LoonenA，BergervoetM,WoltersAMA,VisserRGF(2006)Post-tmnscriptionalgenesilencingofGBSSIinpotato:effectsofsizeandsequenceoftheinvertedrepeats.PlantMolBiol60:647-662HuangS,vanderVossenEAG,KuangH,VleeshouwersVGAA，ZhangN,BormTJA,vanEckHJ,BakerB,JacobsenE,VisserRGF(2005)ComparativegenomicsenabledtheisolationoftheR3alateblightresistancegeneinpotato.PlantJ42:251-261.KloostermanB(2006)Transcriptomicanalysisofpotatotuberdevelopmentandtuberqualitytraitsusingmicroarraytechnology.Insearchofcandidategenes.PhDThesis,WageningenUniversity,TheNetherlands.ISBN90-8504-454-5KononovME，BassunerB，GelvinSB(1997)IntegrationofT-DNAbinaryvector'backbone'sequencesintothetobaccogenome:evidenceformultiplecomplexpatternsofintegration.PlantJ11:945-957KurayaY,OhtaS,FukudaM，HieiY，MumiN,HamadaK，UekiJ,ImasekiH，KomariT(2004)Suppressionoftransferofnon-T-DNA'vectorbackbone'sequencesofhigherplantsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.MolBreed14:309-320RamanathanV,VeluthambiK(1995)Transferofnon-T-DNAportionsoftheAgrobacteriumtumefaciensTiplasmidpTiA6fromtheleftterminusofTL-DNA.PlantMolBiol28:1149-1154RogersSO,BendichAJ(1988)ExtractionofDNAfromplanttissues.In:PlantMolecularBiologyManual(GelvinSB,SchilperoortRA，eds).KluwerAcademicPubl，Dordrecht,pp.A6/1-A6/10TortoT.etal.(2003)ESTminingandfunctionalexpressionassaysidentifyextracellulareffectorproteinsfromPhytophthorta.GenomeRes.13:1675-1685.VanderGmaffE,denDulk-RasA，HooykaasPJJ(1996)DeviatingT-DNAtransferfromAgrobacteriumtumefacienstoplants.PlantMolBiol31:677-681VanderLeijFR，VisserRGF,PonsteinAS,JacobsenE,FeenstraWJ(1991a)Sequenceofthestructuralgeneforgranule-boundstarchsynthaseofpotato(SolanumtuberosumL.)andevidenceforasinglepointdeletionintheamfallele.MolGenGent228:240-248VanderLeijFR,VisserRGF,OosterhavenK，vanderKopDAM,JacobsenE，FeenstraWJ(1991b)Complementationoftheamylose-freestarchmutantofpotato(Solanumtuberosum)bythegeneencodinggranule-boundstarchsynthase.TheorApplGenet82:289-295VanderLeijFR,AbelnECA,Hesseling-MeindersA,FeenstraWJ(1993)AputativeB-glucanasepseudogenebehindthepotatoGBSSgene.PlantMolBiol21:567-571VanderVossenE,SikkemaA,teLintelHekkertB,GrosJ,StevensP，MuskensM，WoutersD,PereiraA,StiekemaW，AllefsS(2003)AnancientRgenefromthewildpotatospeciesSolanumbulbocastanumconfersbroad-spectrumresistancetoPhytophthorainfestansincultivatedpotatoandtomato.PlantJ36:867-882VisserRGF,SomhorstI,KuipersGJ,RuysNJ,FeenstraWJ,JacobsenE(1991a)Inhibitionoftheexpressionofthegeneforgranule-boundstarchsynthaseinpotatobyantisenseconstructs.MolGenGenet225:289-296VisserRGF,StolteA，JacobsenE(1991b)Expressionofachimaericgranule-boundstarchsynthase-GUSgeneintransgenicpotatoplants.PlantMolBiol17:691-699WangK，GenetelloC，VanMontaguM,ZambryskiPC(1987)SequencecontextoftheT-DNAborderrepeatelementdeterminesitsrelativeactivityduringT-DNAtransfertoplantce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