专利名称：木耳菌种的组织分离方法
技术领域：
本发明涉及一种食用菌的菌种分离方法，尤其涉及一种利用组织分 离方法分离和纯化木耳菌种的方法，属于食用菌的菌种分离、纯化领域。
背景技术：
我国幅员辽阔，包含热带、亚热带、温带等气候地带。各种各样 的地形，温和、潮湿的优越条件可适合生长多种木耳，东北地区，中部
地区和南方是我国木耳的主要生长区域，黑木耳[^r/cw^Wa awr/cwh (L.) Underw.]和毛木耳[A po7/"/由(Mont.) Sacc.]是分布最广泛， 产量最高的种类。
黑木耳是我国人民喜爱的传统食品，是烹调高级莱肴不可缺少的 佐料。黑木耳肉质细腻，营养丰富，含有人体必需的多种氨基酸，肝糖、 维生素和矿质元素等。药用子实体具有降血脂、抗血栓、降血糖(范亚 明，1991, 1993 )、清肺益气，补血活血，镇静止痛等功效，是一种天 然的食药兼用菌，也是世界公认的保健品。毛木耳具有与黑木耳类似的 营养和药用价值，近年来由于其产品质量和产量均得以提高，加之在医
疗保健方面的作用，深受广大蕈菌工作者的关注和消费者的喜爱。
黑木耳在我国已有1400多年的栽培历史，目前其栽培遍布20多个 省(市、区)，产量占世界首位，在国际市场上享有较高的声誉，是国内外市场供不应求的紧缺商品。近年来，随着山区开矿和城镇建设使木耳 物种的数目日益减少甚至灭绝，对木耳种质资源的收集、保存及研究成 为 一项必不可少的基础工作，在山区发展经济和建设社会主义新农村方 面具有重要的指导意义。
一抹优良的木耳菌林经过多年的扩大生产使用，其优良特性会出 现严重的退化现象，必须进行重新分离复壮，为了保证黑木耳产业的正 常发展，不间断地选育优良菌种势在必行。
传统的选育菌种大多是通过组织分离方法，多用鲜耳直接分离或 将干耳用水泡湿后再分离。目前也有采用干耳进行分离的，但程序繁杂， 所用药品较多，条件差的地方难以做到。由于受多种药物的作用，即使 分离成功，菌丝萌发和生长也很緩慢。黑木耳的耳瓣薄，并富有胶质， 所以在过去的分离法中很少采用耳片组织分离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的干耳菌种分离方法中所存 在的操作复杂、成本高、菌丝分离成功率低、质量差等缺陷，提供一种 操作筒单，用材少(包括药品)，成本低，菌丝萌发快，长势强，浓密， 分离成功率高的干耳组织分离方法，以解决木耳的常规分离法所存在的 一系列技术问题，为广大制种工作者提供方便。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种木耳菌种的组织分离方法，包括(1 )将干木耳消毒并润湿；(2 ) 剪取耳片组织块；(3)将耳片组织块用酒精灯的火焰进行灭菌消毒；(4 )将耳片组织块插入到分离培养基中进行恒温分离培养；(5 )挑取 新生长出的菌丝作为接种块接种至纯化培养基中进行纯化培养，即得； 其中，上述各步骤都是在无菌条件下进行的操作。
其中，所述的木耳可以是黑木耳[/l"r/c"/aWa ai/r/cw/a (L.) Underw.]、毛木耳[A ，//W由(Mont.) Sacc.]或铍木耳(爿.de7/ca (Fr.) Henn.)等胶质耳；为了达到最优的效果，最好挑选朵型大、肉 质厚、无筋或少筋、颜色正、无霉、无虫害等野生或栽培的当年头茬干 木耳作为分离原材料；
其中，步骤(l)中所述的干木耳的消毒和润湿优选采用以下方式 进行用75%酒精棉球擦拭干木耳的表面2 ~ 3遍，并用酒精棉包住木耳 耳片2 3min;将干木耳剪成耳片组织块之前，需要将其消毒并进行润 湿；现有的木耳的组织分离方法中多是采用升汞进行消毒处理，升汞对 周围环境有害，对木耳也有一定的不利影响，用升汞消毒后需要用清水 进行反复冲洗；但是干木耳如果润湿过度，将其剪成耳片组织块后，由 于缺乏硬度和韧性无法将其插入到分离培养基中并将其保持竖立，这样 的结果是分离成功率非常低。本发明人通过一系列的实验发现，如果采 用75%酒精棉球擦拭干木耳的表面2 ~ 3遍，这在保证消毒的效果的同时 又兼有润湿的作用，再加上"用酒精棉包住木耳耳片2 3 min"这一方 式，可保证将木耳耳片的润湿程度控制在较为理想的状态(能将其插入 到分离培养基中并保持竖立)，这为后续的成功分离奠定了良好的基础。
步骤(2)中所述的耳片组织块优选按照以下方法剪取得到将耳 片四周边缘去掉，剪取远离耳基没有筋的平坦部位；因为发明人通过实
6验发现，远离耳基没有筋的平坦部位的耳片，相对来说， 一是杂菌污染 少，容易彻底消毒，二是该部位的活力相对来说较强。
所述的耳片组织块的大小优选为长度为O. 4 ~ 0. 6 cm,宽度为O. 1 ~ 0.3 cm;更优选的，所述的耳片组织块的大小为长度为O. 5cm，宽度 为O. 2cm;耳片组织块过大或过小都不利于组织块的分离，将耳片组织 块的大小控制为长度为O. 4~ 0. 6 cm，宽度为O. 1 ~ 0. 3 cm这一范围，不 仅有利提高分离的成功率，还能有效节约材料。
本发明人发现，使用酒精灯的火焰对耳片组织块可以进行彻底的 灭菌消毒，能够有效提高分离的成功率，但是在彻底消毒的同时又有可 能对耳片组织块造成一定程度的灼伤，这样会影响耳片组织块的萌发 力；所以采用该技术方案所要注意的是既要达到彻底消毒这一目的又不 至于将耳片组织块灼伤、烤焦以至影响耳片组织块的活力；在上述这一 准则之下如何具体进行这一操作，本领域技术人员可视情况进行掌控； 作为参考，所述的火焰灭菌消毒可按照以下方法进行用无菌镊子夹取 耳片组织块在酒精灯火焰的外焰中快速的来回穿梭2 ~ 3次，每次l ~ 2 秒；采用上述的火焰灭菌消毒方式既能达到彻底消毒的这一目的又能最 低限度的降低火焰对耳片组织块所带来的不利影响。
优选的，步骤(4)中所述的分离培养是将耳片組织块的1/3~2/3部 位插入到分离培养基中进行恒温分离培养；更优选的，将耳片组织的1/2 部位插入到斜面分离培养基的中下部位之中，在25。C的恒温条件下进行 分离培养；
优选的，步骤(4)中所述的分离培养基由各以下组分配制而成麦芽浸粉20 g，琼脂18 g,水IOOO ml; pH自然。
进一步优选的，步骤(4 )中所述的分离培养基分装为斜面培养基， 优选为分装于5 ml的离心管中(装液量为1.8 ml)高压灭菌后再将离心 管倾斜放置得到斜面分离培养基。
现有的木耳组织分离方法中，多是将配制好的分离培养基分装于 规格为200 x 25 mm的试管中，装液量为试管高度的1/5，塞上棉塞、捆 扎，经高压灭菌后再将试管倾斜放置得到斜面分离培养基；本发明人通 过大量的实验发现，将配制好的分离培养基分装于5ml的离心管中(装 液量为1.8 ml)高压灭菌后再将离心管倾斜放置得到斜面分离培养基， 用该方法制备得到的斜面分离培养基，木耳菌丝的分离成功率效果明显 要优于采用将分离培养基装在200 x 25隱的试管中的分离成功率；所以， 采用5 ml的离心管装载分离培养基这一技术方案在降低生产成本的同 时还能有效的提高木耳菌种的分离成功率和分离质量。
优选的，步骤(5)中所述的纯化培养基由各以下组分配制而成 麦芽浸粉20 g,葡萄糖20 g,琼脂18 g,磷酸二氢钾3 g,水IOOO ml; pH自然；
进一步优选的，步骤(5 )中所述的纯化培养基分装为平板(或平皿) 培养基。该培养基营养丰富，较适宜木耳菌丝的生长；实验发现，将新 生长出的菌丝作为接种块接种至于60cmx 1. 3 cm的平板纯化培养基上， 25。C恒温培养条件下长势最强的木耳菌丝6 d就可长满平板，长势中等 的需10 d,长势较弱的需10 d以上；因平板为菌丝提供了更大的生长 空间，即使接种块周围有细菌，培养l周后菌丝会长到外围空间，而得到纯化菌丝；若将纯化培养基制成上述离心管培养基，菌丝生长空间太 小，有时分辨不出混杂有细菌，从而影响菌丝纯化。
本发明人在用干耳组织分离过程中发现在挑取菌丝转管至纯化培养 基中进行纯化培养时如挑取了杂有细菌的菌落，转管后几天内细菌长势
较旺，就无法达到纯化菌丝的目的；本发明人通过实验发现，如果在转 管时将接种块(菌丝)插入到平板(皿)纯化培养基的内部使接种块的 1/4~ 1/3部位露出培养基表面(进一步优选为将接种块的l/3部位露出 培养基表面)，这样细菌在培养基内生长，待其长出表面时菌丝的生长 势已明显强于细菌，培养一周左右待菌丝长到无菌区再次转管可获得纯 菌丝。
本发明木耳菌种的组织分离方法主要具有如下优点
1) 本发明方法简便，节省材料，只需一小片耳片就能成功分离出 所需菌种。采用组织分离，又能较稳定地保持原有菌种的优良特性。
2) 本发明方法分离效率高，操作时间短，不需要用酒精或升汞等 长时间浸泡处理木耳耳片，只需要将干木耳的表面用75%酒精棉球擦拭 2~3遍，用酒精棉包住木耳耳片2 ~ 3 min;以及将耳片组织块从酒精灯 火焰的外焰中快速的来回穿梭2 ~ 3次；就能在较短的时间内达到了彻底 消毒的效果。
3) 耳片经晒干已杀灭部分杂菌，经上述再处理，消毒较为彻底， 组织块接种在母种基质上时，很快吸收基质内无菌水分、使耳片膨胀恢 复萌发菌丝能力，分离成功率高达90。/。以上(常规分离法最高的分离率仅 为80°/。左右)，菌丝生物量高。4)本发明方法应用范围广泛，适于黑木耳、毛木耳或皱木耳等各 种胶质耳的组织分离。
总之，本发明木耳菌种的组织分离方法操作简捷，生产成本低， 菌丝分离成功率高，菌丝萌发快、长势强、浓密，适用各种胶质耳的组 织分离，应用范围较广。
具体实施例方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将 会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的 范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的 精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但 这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1耳片来源
将从江西分宜大岗山、海南省陵水县吊罗山、海南省昌江县霸王岭、 重庆师范学院、武汉市黄鹤楼景区、河北涞水县北辛庄等野外采集的黑
木耳[爿i/r2'ci;/ar/a awr/cw/a (L.) Underw.]标本用清水洗干净，于室 内自然阴干或于28匸的烘箱烘干；干燥后即可进行组织分离菌种。
野外采集的黑木耳标本的共同生物学性状如下
生长在多种阔叶树倒木和腐朽木上；子实体一年生，较薄或厚，新 鲜时呈杯状，耳壳状，叶状或花瓣状，单生或簇生，棕褐色至黑褐色，柔软半透明，胶质，有弹性，中部凹陷，边缘锐，直径2~9 cm，有时 可达13 cm，厚0. 5~1 ,。背面与基质相连，无柄或具短柄。干后强 烈收缩，变硬，脆质，浸水后迅速恢复成新鲜时形态及质地。子实层面 平滑或有褶状隆起，深褐色至黑色；不孕面密被短绒毛。 2培养基的制备
1) 分离培养基麦芽浸粉20g，琼脂18g,水1000 ml， pH自然。 将分离培养基煮好后趁热分装于5 ml的离心管中，装液量为1.8 ml,
装于离心管架上，于12rC高压灭菌20 mim,灭菌后将离心管架倾斜摆 放使培养基成一斜面备用。
2) 纯化培养基麦芽浸粉20 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，磷酸二 氢钾3 g，水1000 ml, pH自然。
将纯化培养基煮好后趁热装于500 ml的三角瓶中，用牛皮纸封口后 于122。C高压灭菌20mim。灭菌后趁热移至无菌超净工作台，分装于60 cm x 1.3 cm的平皿中，装液量为13 ml,将平板水平摆放，待培养基冷 却后备用。
3组织分离培养
1) 材料准备将干黑木耳1片放入无菌操净工作台内。每号标本 准备10管斜面培养基。
2) 用具准备组织分离所用工具为剪刀和镊子，使用前在酒精灯 火焰上方消毒即可。
3) 组织分离培养将干黑木耳耳片表面用75%酒精棉球擦拭3遍， 用酒精棉包住黑木耳耳片3 min;用无菌剪刀将耳片四周边缘去掉，剪
ii取远离耳基没有筋的最平部位的耳片，得到长O. 5 cm左右，宽O. 2 cm 左右的组织块；用无菌镊子夹取该组织块在酒精灯火焰的外焰上方来回 快速穿梭2次；接着将组织块的1/3部位插入5 ml离心管中的斜面分 离培养基的中下部位之中；上述整个过程都要遵循无菌操作；将接种后 的离心管插入离心管盒中(32管/盒)，置于25。C恒温培养箱中培养； 2 3d后，就可看到白色绒毛状黑木耳菌丝，分离成功率达92°/。以上。 4菌丝纯化培养
菌丝初期生长较慢，培养5 ~ 6d后挑取远离接种块的菌丝接种于平 板纯化培养基中；若接种块周围杂有细菌应注意挑取远离细菌菌落的菌 丝插入到平板纯化培养基的内部，使接种块的1/3露出培养基表面，于 25。C恒温条件下进行纯化培养，6-10d就可长满平板，获得大量的黑木 耳纯菌丝，菌丝生物量达到131. 5mg/13mL(鲜重)，52. 6mg/13mL(干重)。
实施例2
耳片来源
将从江西分宜大岗山、海南省陵水县吊罗山、海南省昌江县霸王岭、 重庆师范学院、武汉市黄鹤楼景区、河北涞水县北辛庄等野外采集的毛 木耳[爿w/cw/aWa ; o/jtr/c力a (Mont.) Sacc.]标本用清水洗干净，于 室内自然阴干或于28。C的烘箱烘干；干燥后即可进行组织分离菌种。
野外采集的毛木耳标本的共同生物学性状如下
生长在多种阔叶树倒木和腐朽木上。子实体一年生，新鲜时呈杯状、 碟状或耳壳状，较厚，通常群生，有时单生，棕褐色至黑褐色，胶质有
12弹性，质地稍硬，中部凹陷，边缘锐且通常上巻，直径可达15 cm，厚 0.5-1.5 mm。背面中部常收缩成短柄状，与基质相连。干后收缩，变 硬，角质，浸水后可恢复成新鲜时形态及质地。子实层面平滑，深褐色 至黑色；不孕面被绒毛，暗灰色，分布较密。 培养基的制备过程与实施例1相同；
组织分离培养过程中除了剪取的毛木耳组织块长0.6 cm左右，宽 0.3 cm左右，将该组织块的1/2部位插入到5 ml离心管的分离培养基 的中下部位之中；其余与实施例l相同；2 3d后，就可看到白色绒毛 状毛木耳菌丝，分离成功率达95°/。以上。
菌丝纯化培养过程与实施例l相同，菌丝生物量达到176. 9mg/13mL (鲜重)，70. 8mg/13mL (干重)。
实施例3 耳片来源
将从江西分宜大岗山、(海南省陵水县吊罗山、昌江县霸王岭)、 重庆师范学院、武汉市黄鹤楼景区、河北涞水县北辛庄等野外釆集的皱 木耳(Jw/cWar/a (Fr.) Henn.)标本用清水洗干净，于室
内自然阴干或于28。C的烘箱烘干；干燥后即可进行组织分离菌种。
野外采集的皱木耳标本的共同生物学性状如下 多生在赤杨，千年桐等阔叶树枯腐木上；子实体一般较小，胶 质，稍坚韧，耳形或圓盘形，无柄，群生，直径1. 5 ~ 7cm x 1 ~ 4cm。 紫褐色或紫红色，干时色变深。子实层生下表面，淡红褐色，有白色粉末，有明显皱褶并形成网格，外面稍皱。不肓面深栗褐色至略带紫黑色，密生短细绒毛。
培养基的制备过程与实施例l相同；
组织分离培养过程中除了将干的皱木耳耳片表面用7 5%酒精棉球擦拭2遍，用酒精棉包住耳片2min;剪取的毛木耳组织块长0. 4cm左右，宽0. lcm左右，将该组织块的2/3部位插入到5 ml离心管的斜面分离培养基的中下部位之中之外，其余与实施例l相同；2 3d后，就可看到白色绒毛状皱木耳菌丝，分离成功率达90%以上。
菌丝纯化培养过程与实施例1相同，菌丝生物量达到100. 2mg/13mL(鲜重),復lmg/13mL (干重)。
1权利要求
1、一种木耳菌种的组织分离方法，包括(1)将干木耳消毒并润湿；(2)剪取耳片组织块；(3)将耳片组织块用酒精灯火焰进行灭菌消毒；(4)将耳片组织块插入到分离培养基中进行恒温分离培养；(5)挑取新生长出的菌丝作为接种块接种至纯化培养基中进行纯化培养，即得；其中，上述各步骤都是在无菌条件下进行的操作。
2、 按照权利要求1所述的组织分离方法，其特征在于所述的木耳选 自黑木耳[爿"Wc"/ar/a ayric"7a (L.) Underw.]、 毛木耳[爿wric"/ar/a /70//ZWc/ a (Mont.) Sacc.]或铍木耳(^wr/cw/ar/a 〃e7/ca (Fr.) Hemi.)。
3、 按照权利要求1所述的组织分离方法，其特征在于步骤(2)中所 述的耳片组织块按照以下方法得到将耳片四周边缘去掉，剪取远离耳 基没有筋的平坦部位多块，得到耳片组织块。
4、 按照权利要求1所述的组织分离方法，其特征在于所述的用酒精 灯进行灭菌消毒是用无菌镊子夹取耳片组织块在酒精灯火焰的外焰中 快速的来回穿梭2 ~ 3次，每次1 ~ 2秒。
5、 按照权利要求1所述的组织分离方法，其特征在于所述的耳片组 织块的长度为0.4-0.6 cm，宽度为0.1-0.3 cm;优选的，所述的耳 片组织块的长度为0. 5 cm，宽度为0. 2 cm。
6、 按照权利要求1所述的组织分离方法，其特征在于步骤(4)中所 述的分离培养基由各以下组分配制而成麦芽浸粉20 g,琼脂18 g， 水1000 ml; pH自然。
7、 按照权利要求1所述的组织分离方法，其特征在于所述的分离培 养基是分装于5 ml的离心管中，其装液量为1. 8 ml的斜面培养基。
8、 按照权利要求1所述的组织分离方法，其特征在于步骤(5)中所 述的纯化培养基由以下各组分配制而成麦芽浸粉20 g，葡萄糖20g, 琼脂18 g,磷酸二氢钾3 g,水IOOO ml; pH自然。
9、 按照权利要求1所述的组织分离方法，其特征在于所述的纯化培 养基为平板培养基。
10、 按照权利要求1所述的组织分离方法，其特征在于步骤(5)中 挑取新生长出的菌丝作为接种块将其插入到纯化培养基的内部，使接种 块的1/4 ~ 1/3部位露出培养基表面即可。
全文摘要
本发明公开了一种木耳菌种的组织分离方法。该方法包括(1)将干木耳消毒并润湿；(2)剪取耳片组织块；(3)将耳片组织块用酒精灯火焰进行灭菌消毒；(4)将耳片组织块插入到分离培养基中进行恒温分离培养；(5)挑取新生长出的菌丝作为接种块接种至纯化培养基中进行纯化培养，即得；本发明木耳菌种的组织分离方法具有操作简捷，生产成本低，菌丝分离成功率高，菌丝萌发快、长势强等优点。本发明方法应用广泛，可适用于各种胶质耳的组织分离。
文档编号A01G1/04GK101473758SQ20091007705
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者崔宝凯, 戴玉成, 萍 杜 申请人:北京林业大学