专利名称：富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系的培育方法
富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系的培育
方法
技术领域：
本发明涉及一种贝类遗传育种研究中选择育种和遗传改良技术，具体地说，是一种华贵栉孔扇贝新品系的培育方法。
背景技术：
类胡萝卜素(carotenoid)也称脂色素，属于类萜化合物。通常是指40碳的碳氢 化合物，即是胡萝卜素，以及胡萝卜素的氧化衍生物，即是叶黄素。类胡萝卜素就是这两大 类色素的总称。类胡萝卜素主要是由高等植物、藻类和微生物合成，以黄色、橙红色或红色 等色素的形式存在于自然界。迄今为止，已被发现类胡萝卜素650多种(MatSUno，2001 ；任 永霞等，2003)。动物无法通过自行合成类胡萝卜素，但动物可以通过摄食外界的天然类胡 萝卜素而贮存在动物体内，因此类胡萝卜素广泛地存在于动、植物和微生物中。类胡萝卜素不但可以作为着色剂、膳食补充剂、饲料添加剂，而且还能够清除自由 基抗氧化、延缓衰老，猝灭单线态氧、防癌抗癌，增加免疫系统中B细胞的活力、增强机体 免疫，作为维生素A的前体、治疗光敏性疾病和防止白内障发生等重要的保健、抗病作用 (Nishino, 1998 ；Zeegers et al. ,2001 ；Sesso et al. ,2004 ；Wu et al.，2004)。因此，类 胡萝卜素不但具有重要的经济价值，而且还具有医疗、保健等价值。软体动物本身不能够合成类胡萝卜素，但它们通过摄食富含类胡萝卜素的藻类而 在体内不同组织中积累大量的类胡萝卜素，并作为重要的食物源被鱼类、海鸟、海洋哺乳动 物和人类摄食，从而使类胡萝卜素进入脊椎动物体内(Kantha，1989)。因此，在食物链中，软 体动物是类胡萝卜素进入人等高等脊柱动物体内非常重要的一环。华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis Reeve)为暖水性海产双壳类(齐钟彦，1998; 蔡英亚等，2006)，以营养丰富、味道鲜美、肉质细嫩而著称，其闭壳肌干制品俗称为干贝，是 著名的海产八珍之一。自上世纪七十年代末以来，在我国南方开始人工养殖华贵栉孔扇贝， 八十年代中后期就发展成为南方沿海重要的海水养殖种类之一。我们研究发现，华贵栉孔 扇贝不仅在贝壳上具有金黄、橙褐、紫褐、浅褐等多种外部颜色，而且在外套膜、闭壳肌、成 熟的性腺等内部组织的颜色上也有不同，如金黄色个体的外套膜通常为金黄色、20 30% 个体的闭壳肌也为金黄色，而褐色个体的外套膜、闭壳肌则全部是白色；这种金黄色的闭壳 肌、外套膜等组织富含类胡萝卜素，并且受到遗传控制。因此，通过人工选育完全可以培育 出外部色泽美观、商品价格较高的富含天然类胡萝卜素新品种。由于这一新品种金黄色的 外观色泽符合我国广大消费者的习惯，其高含量的类胡萝卜素又具有较高的经济、医疗和 保健等价值，因此，产品的价高将成倍地被提高。这样不仅解决了目前华贵栉孔扇贝养殖业 遭遇的产品价格贱、产值低等问题，而且也可以进一步丰富我国海水养殖业的多品种需求。 尽管，以贝壳颜色为育种目标已培育出“蓬莱红”栉孔扇贝(品种登记号GS-02-001-2005) 和“中科红”海湾扇贝(品种登记号GS-01-004-2006)两个贝类新品种。然而，迄今为止尚 未见到任何有关依据内部色泽和体内营养为育种目标培育贝类新品种的报道。
发明内容本发明的技术方案是通过精心选种、单个个体催产、单配授精建立家系、苗种培 育、中间育成和养成、颜色纯度检查、新品系筛选和纯化、总类胡萝卜素含量检测等过程，经 连续2代定向选育，培育出富含类胡萝卜素华的贵栉孔扇贝金黄色新品系，其操作步骤为(1)选种挑选贝壳、闭壳肌和外套膜的颜色均为金黄色的，年龄为1龄或2龄的， 健康且性腺发育饱满的雌种贝和雄种贝；(2)单个诱导催产将所述雌、雄种贝阴干10分钟之后，用微量注射器向所述雌、 雄种贝的卵巢和精巢内注射0. 02-lmM的5-羟色胺溶液0. 1-0. 5ml/枚种贝，再立即将雌、 雄种贝单个地放入盛有砂滤海水的不同容器中，该雌、雄种贝在10分钟后产卵、排精，再分 别收集卵子和精子；(3)单配授精建立家系用单个个体少量的精子与单个个体全部的卵子进行单配 授精，受精卵放在塑料桶中孵化。孵化水温为24 27°C，适宜盐度为29 33。受精后 18 24h，D-形幼虫孵出，收集幼虫后分别放入幼虫培育桶中进行培育，从而建立起不同的 家系；(4)苗种培育幼虫培育的初始密度为2 3个/ml，每天全换水一次，并用增氧机 向水体连续增加氧气；幼虫饵料第1周为金藻，1周后为金藻和扁藻；日投饵量随幼虫的生 长而逐渐增加，第1天为3000 4000个藻类细胞/ml，5天后逐渐增加到50000 60000 个藻类细胞/ml ；投饵次数第1天的2次/天，5天后逐渐增加到6次/天；每天取样镜检幼 虫的摄食和生长情况，每两天对幼虫培养密度进行定量，并通过调节培养水体以使每个培 育桶中的幼虫密度基本一致。幼虫培育期间不加抗生素。当20% 30%的幼虫出现眼点 时，投放处理好的棕绳采苗器，投放量按每根棕绳附着2000 3000粒苗为宜。当水体中的 浮游幼虫全部附着变态后，继续在室内培养一周左右，然后将附有幼苗的棕绳放入60目的 聚乙烯网中，做好标记后，在天气晴朗的下午出池，挂到海上进行中间育成和养成；(5)中间育成和养成幼苗放到海上养殖后，进入中间育成和养成阶段，定期检查 幼苗的生长和存活情况，当幼苗生长到一定规格时，及时分苗并更换网目较大的养殖笼，随 着幼苗的生长，养殖密度有初始的300 400个/层逐渐减少到100个/层，最后的养殖密 度为30 40个/层；网目也由初始的60目逐渐更换为20目，由孔径1. 3cm的养殖笼更换 为3cm的养殖笼；(6)颜色纯度检查包括贝壳颜色、闭壳肌颜色和外套膜颜色，在扇贝生长到2 3cm时，检查每个家系中贝壳颜色，在扇贝生长到4 6cm时，检查闭壳肌的颜色和外套膜的 颜色；(7)新品系筛选和纯化从贝壳、闭壳肌色泽纯度达95%以上F1家系中筛选种贝， 通过建立家系或群体繁育F2，从而培育出性状稳定的金黄色新品系。8)总类胡萝卜素含量检测包括闭壳肌、外套膜、生殖腺三部分组织。从新品系中 各取10个性腺饱满的雌性个体和雄性个体，活体解剖取其闭壳肌、外套膜及生殖腺，真空 冷冻干燥并研磨粉碎，然后按Yanar等(2004)方法提取各样品中的总类胡萝卜素，用分光 光度计进行光谱扫描，最后参照Foss等(1984)方法计算各样品中的总类胡萝卜素；同时， 从养殖群体中也各取10个其他壳色的雌性个体和雄性个体作为对照，活体解剖取其闭壳肌、外套膜及生殖腺，按上述程序测定各样品中的总类胡萝卜素。金黄色新品系的总类胡萝 卜素含量显著高于对照组。步骤(2)中，用微量注射器向所述雌、雄种贝的卵巢和精巢内注射0.06mM的5-羟 色胺溶液0. 3ml/枚种贝。步骤(3)中，孵化水温为26°C，适宜盐度为30。步骤(4)中，幼虫培育的初始密度为3个/ml，每天全换水一次，并用增氧机向水体 连续增加氧气，幼虫饵料第1周为金藻，1周后为金藻和扁藻；日投饵量随幼虫的生长而逐 渐增加，第1天为3500个藻类细胞/ml，5天后逐渐增加到55000个藻类细胞/ml。步骤(5)中，养殖密度有初始的350个/层逐渐减少到100个/层，最后的养殖密 度为35个/层；网目也由初始的60目逐渐更换为20目，由孔径1. 3cm的养殖笼更换为3cm的养殖笼。本发明的优点和积极效果如下1)2代选育就可获得理想的目标性状，加速了新品系培育进程。2)从感官色泽、营养角度培育养殖贝类新品系，开辟了贝类品种培育的新途径，为其他贝类新品种的培育起到了示范作用。3)富含类胡萝卜素的新品系还具有医疗、保健价值，提高了产品的附加值，市场销 售价格成倍增长，增加了养殖企业和养殖户的收入，市场前景广阔。4)不需要转基因既可在短时间内培育出新品系，可广泛应用其他贝类。本发明是富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色品系的育种方法，通过这种 技术培育出来的金黄色新品系扇贝不但具有明显的表型特征——色泽美观，具有金黄色的 贝壳、金黄色的闭壳肌、金黄色的外套膜，而且体内组织还富含天然类胡萝卜素，由于色泽 美观、且富含天然类胡萝卜素，这种金黄色品系的扇贝深受消费市场喜爱，不但具有较高的 经济价值，而且还具有医疗和保健等价值。通过本发明可提高扇贝的质量和市场价格，有效 地遏制目前养殖业产品价格贱、产值低等问题，为扇贝养殖业的发展提供一条新途径。本发 明不需要通过转基因、药物处理等复杂技术，因此该产品对生物和环境安全没有影响。
具体实施方式下面对本发明作进一步详述，但不构成对本发明保护范围的限制。实施例1 富含类胡萝卜素华贵栉孔扇贝金黄色新品系F1的培育时间2008年4月，地点汕头大学南澳临海海洋生物试验站。种贝2龄，壳长78. 6mm、壳高85. 2mm、壳宽26. 8mm、活体重78. 9g。通过精心选种， 单个诱导催产，单配授精建立家系，苗种培育、中间育成和养成，颜色纯度检查，新品系筛选 和扩繁，总类胡萝卜素含量检测，其操作步骤为1)精心选种挑选的雌、雄种贝都必须具有金黄色的贝壳、金黄色的闭壳肌、金黄色的外套膜，年龄为2龄、健康、性腺发育饱满，雌、雄个体各18个，所有种贝来自于同一个
养殖群体。2)单个诱导催产种贝阴干10分钟后，用微量注射器向种贝的卵巢或精巢内注 射微量低浓度的5-羟色胺溶液，再立即将雌、雄种贝单个地放入盛有砂滤海水的不同容器 中，10分钟后产卵、排精，分别收集卵子和精子。
3)单配授精建立家系用单个个体少量的精子与单个个体全部的卵子进行单配 授精，受精卵放在60L的塑料桶中孵化。孵化的适宜水温为23 28°C，适宜盐度为28 33。受精后18 24h，D-形幼虫孵出，收集幼虫后分别放入220L的培育桶中进行幼虫培 育，共建立起9个家系。4)苗种培育幼虫培育的初始密度为2 3个/ml，每天全换水一次，连续充气；早 期投喂金藻饵料，后期投喂金藻+扁藻，投饵量随幼虫的生长而逐渐增加，由初始的3000 4000个藻类细胞/ml逐渐增加到50000 60000个藻类细胞/ml，投饵次数也由初始的2次 /天增加到6次/天；每天取样镜检幼虫的摄食和生长情况，每两天对幼虫培养密度进行定 量，并通过调节培养水体以使每个培育桶中的幼虫密度基本一致。幼虫培育期间不加抗生 素，而是适时地添加5 IOppm大蒜浸出液用来预防水体中病原微生物的繁殖。当20% 30%的幼虫出现眼点时，投放处理好的棕绳采苗器，投放量按每根棕绳附着2000 3000粒 苗为宜。当水体中的浮游幼虫全部附着变态后，继续在室内培养一周左右，然后将附有幼苗 的棕绳放入60目的聚乙烯网中，做好标记后，出池并挂到海上进行中间育成和养成。共生 产苗种55. 8万粒。5)中间育成和养成幼苗放到海上养殖后，进入中间育成和养成阶段。定期检查 幼苗的生长和存活情况，当幼苗生长到一定规格时，及时分苗并更换网目较大的养殖笼。随 着幼苗的生长，养殖密度有初始的300 400个/层 逐渐减少到100个/层，最后的养殖密 度为30 40个/层；网目也由初始的60目逐渐更换为20目、由孔径1.3cm的养殖笼更换 为3cm的养殖笼。共生产1龄成贝12. 6万枚。6)颜色纯度检查包括贝壳颜色、闭壳肌颜色和外套膜颜色。在扇贝生长到3 4cm时，检查所有家系中贝壳颜色、金黄色个体平均达92% ；在扇贝生长到5 6cm时，检查 闭壳肌的颜色和外套膜的颜色，闭壳肌是金黄色的个体平均达88%，外套膜是金黄色的个 体平均达96%。7)新品系筛选和纯化从贝壳、闭壳肌、外套膜的色泽纯度达95%以上F1家系中 筛选种贝，通过家系或群体繁育F2，培育出金黄色新品系。8)总类胡萝卜素含量检测包括闭壳肌、外套膜、生殖腺三部分组织。从新品系 中各取10个性腺饱满的雌性个体和雄性个体，活体解剖取其闭壳肌、外套膜及生殖腺，真 空冷冻干燥并研磨粉碎，然后按Yanar等(2004)方法提取各样品中的总类胡萝卜素，用 UV2501PC型分光光度计(日本，岛津)进行光谱扫描，最后参照Foss等(1984)方法计算各 样品中的总类胡萝卜素；同时，从养殖群体中也各取10个未经选育的雌性个体和雄性个体 作为对照，活体解剖取其闭壳肌、外套膜及生殖腺，按上述程序测定各样品中的总类胡萝卜 素。新品系F1的总类胡萝卜素含量是对照组的2. 3 5. 2倍。本实施例说明，通过精心挑选种贝、单个催产和单配授精等技术能够快速地培育 出富含类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色品系。实施例2 富含类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系F2的培育时间2009年3月，地点汕头大学南澳临海海洋生物试验站与实施例1不同之处在于种贝为1龄贝，且来自于F1家系，壳长58. 5mm、壳高 62. 6mm、壳宽20. 8mm、活体重35. 2g。通过精心选种，单个诱导催产，单配授精建立家系和家 系内随机交配建立群体，苗种培育、中间育成和养成，颜色纯度检查，新品系筛选和扩繁，总类胡萝卜素含量检测，其操作步骤为1)精心选种同实施例1的操作步骤1)，518枚种贝均来自于F1家系1龄贝。2)催产同实施例1的操作步骤2)。3)建立家系和群体同实施例1的操作步骤3)，共建立起9个F2家系和1个F2群体。4)苗种培育同实施例1的操作步骤4)，共成功培育出4个F2家系和1个F2群 体，获得健康苗种258万粒。5)中间育成和养成同实施例1的操作步骤5)。6)颜色纯度检查同实施例1的操作步骤6)，新品系性状稳定，平均98%个体具 有金黄色贝壳、96%个体具有金黄色闭壳肌、99%的个体具有金黄色外套膜。7)总类胡萝卜素含量检测同实施例1的操作步骤8)，新品系的总类胡萝卜素含 量是对照组的4. 4 13. 7倍。本实施例说明，通过连续选择能够使新品系的性状得到进一步纯化和提高。另外，凡通过内部组织色泽与类胡萝卜素培育贝类新品系也为本发明所述创意思 想之所及。
权利要求
一种富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系的培育方法，包括下列步骤(1)选种挑选贝壳、闭壳肌和外套膜的颜色均为金黄色的，年龄为1龄或2龄的，健康且性腺发育饱满的雌种贝和雄种贝；(2)单个诱导催产将所述雌、雄种贝阴干10分钟之后，用微量注射器向所述雌、雄种贝的卵巢和精巢内注射0.02-1mM的5-羟色胺溶液0.1-0.5ml/枚种贝，再立即将雌、雄种贝单个地放入盛有砂滤海水的不同容器中，该雌、雄种贝在10分钟后产卵、排精，再分别收集卵子和精子；(3)单配授精建立家系用单个个体少量的精子与单个个体全部的卵子进行单配授精，受精卵放在塑料桶中孵化，孵化水温为24～27℃，适宜盐度为29～33，受精后18～24h，D-形幼虫孵出，收集幼虫后分别放入幼虫培育桶中进行培育，从而建立起不同的家系；(4)苗种培育幼虫培育的初始密度为2～3个/ml，每天全换水一次，并用增氧机向水体连续增加氧气，幼虫饵料第1周为金藻，1周后为金藻和扁藻；日投饵量随幼虫的生长而逐渐增加，第1天为3000～4000个藻类细胞/ml，5天后逐渐增加到50000～60000个藻类细胞/ml，投饵次数第1天的2次/天，5天后逐渐增加到6次/天，每天取样镜检幼虫的摄食和生长情况，每两天对幼虫培养密度进行定量，并通过调节培养水体以使每个培育桶中的幼虫密度基本一致，幼虫培育期间不加抗生素，当20％～30％的幼虫出现眼点时，投放处理好的棕绳采苗器，投放量按每根棕绳附着2000～3000粒苗为宜，当水体中的浮游幼虫全部附着变态后，继续在室内培养一周左右，然后将附有幼苗的棕绳放入60目的聚乙烯网中，做好标记后，在天气晴朗的下午出池，挂到海上进行中间育成和养成；(5)中间育成和养成幼苗放到海上养殖后，进入中间育成和养成阶段，定期检查幼苗的生长和存活情况，当幼苗生长到一定规格时，及时分苗并更换网目较大的养殖笼，随着幼苗的生长，养殖密度有初始的300～400个/层逐渐减少到100个/层，最后的养殖密度为30～40个/层；网目也由初始的60目逐渐更换为20目，由孔径1.3cm的养殖笼更换为3cm的养殖笼；(6)颜色纯度检查包括贝壳颜色、闭壳肌颜色和外套膜颜色，在扇贝生长到2～3cm时，检查每个家系中贝壳颜色，在扇贝生长到4～6cm时，检查闭壳肌的颜色和外套膜的颜色；(7)新品系筛选和纯化从贝壳、闭壳肌色泽纯度达95％以上F1家系中筛选种贝，通过建立家系或群体繁育F2，从而培育出性状稳定的金黄色新品系。
2.根据权利要求1所述富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系培育方法， 其特征是在步骤(2)中，用微量注射器向所述雌、雄种贝的卵巢和精巢内注射0.06mM的 5_羟色胺溶液0. 3ml/枚种贝。
3.根据权利要求1所述富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系培育方法， 其特征是在步骤(3)中，孵化水温为26°C，适宜盐度为30。
4.根据权利要求1所述富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系培育方法， 其特征是在步骤(4)中，幼虫培育的初始密度为3个/ml，每天全换水一次，并用增氧机向 水体连续增加氧气，幼虫饵料第1周为金藻，1周后为金藻和扁藻；日投饵量随幼虫的生长而逐渐增加，第1天为3500个藻类细胞/ml，5天后逐渐增加到55000个藻类细胞/ml。
5.根据权利要求1所述富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系培育方法， 其特征是步骤(5)中，养殖密度有初始的350个/层逐渐减少到100个/层，最后的养殖 密度为35个/层；网目也由初始的60目逐渐更换为20目，由孔径1.3cm的养殖笼更换为 3cm的养殖笼。
6.根据权利要求1至5的任一权利要求所述富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄 色新品系培育方法，其中新品系性状稳定，不但具有明显的表型特征——色泽美观金黄色 的贝壳、金黄色的闭壳肌、金黄色的外套膜，而且体内组织还富含天然类胡萝卜素。
全文摘要
一种富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系培育方法。步骤包括选种、单个个体催产、单配授精建立家系、苗种培育、中间育成和养成、颜色纯度检查、新品系扩繁和连续选育等过程，经过2代定向选育，培育出富含天然类胡萝卜素的华贵栉孔扇贝金黄色新品系。新品系性状稳定，不但具有金黄色的贝壳、闭壳肌和外套膜，且富含天然类胡萝卜素，平均98％个体具有金黄色贝壳、96％个体具有金黄色闭壳肌、99％的个体具有金黄色外套膜，总类胡萝卜素含量是未选育群体的4.4～13.7倍。本发明从感官色泽、营养角度培育养殖贝类新品系，培育的华贵栉孔扇贝新品系不但色泽美观、而且还富含天然类胡萝卜素，具有显著的经济价值、保健价值和药用价值，市场前景广阔。
文档编号A01K61/00GK101828532SQ200910214390
公开日2010年9月15日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者刘合露, 孙泽伟, 张涛, 李远友, 王树启, 王迪文, 郑怀平 申请人:汕头大学