专利名称：一种外生菌根菌菌种保藏方法
技术领域：
本发明涉及真菌的技术领域，具体地说是一种保藏用于生产菌根食用菌子实体为 目的的菌种的方法。
背景技术：
目前菌根菌的大多数可食用子实体都是著名的食用菌，其价格极其昂贵。如松 □蘑(Tricholoma matsutake)、黑孢块菌(Tubermelanosporum Vitt.)、意大禾丨J 白块菌 (Tuber magnatum)、松乳 (Lactarius deliciosus)、红汁乳 (L. hatsudake)、美味牛 月干lif (Boletus edulis)lif (Amatanita caesarea) > φ^pi^M (Tuber sinense K. Tao et Liu)、印度块菌(Tuber indicum Cooke etMassee)、鸡油菌(Cantharellus cibarius Fr.) > zP Ei lif (The 1 ephoraganbajun Zang) > Χ 1 1 |if (Clavulinopsis miyabeana(Ito. )Ito.)、褐环乳牛肝菌(Suillus luteus (L. :Fr.) Gray)、厚环乳牛肝菌 (Suillus greviller (KL.) sing.)、变绿红 (Russulavirescens (schaeff.) Fr.)、澄盖 鹅膏(Amanita caesarea (Scop :Fr. )Pers. ex schw.)、玉蕈离裙伞(Lyophyllum shimeji (kawam. )Hongo)、烟色离褶伞(Lyophyllum fumosum(Pers. :Fr. )0rton)等，还有灰花纹鹅 膏(Amanita fuliginea Hongo)、亚稀裙黑 (Russula subnigricans Hongo)等极具经济 价值的毒菌。但是对其菌种的保藏一直是一个难题，但是因其独具的特性，在现有的技术条件 下，不能象广泛栽培的腐生食用菌(如香菇、木耳等)那样进行保藏，液氮超低温保藏法 是目前微生物菌种普遍采用的有效的保藏方法，(大型真菌菌种保藏技术规程，2004)，法 国、日本、美国的ATCC等菌物保藏中心都试验过用液氮超低温保藏法保藏外生菌根菌， 但至今没有获得成功的突破，众多试验表明仅有少数几个菌种的个别菌株能存活下来， 如双色蜡蘑 S238N 菌株(C0RBERY Y. and LE TACON F. , Storage of ectomycorrhizal fungiby freezing. Annales des Sciences Forestieres,54,211-217,1997), 鸡 油 菌的 SNGT2-A(ATCC 74488)菌株(Danell Ε. , Flygh G. , Cryopreservation of the ectomycorrhizal mushroom Cantharellus cibarius. Mycol.Res.106(11) 1340-1342, 2002).中国菌物保藏中心食用菌分中心经过多年的实践经验也表明，在目前的保藏方法 中，用液氮超低温保藏法保藏的外生菌根菌种98%以上都死亡，采取斜面低温传代法保 藏菌种也良莠不齐，菌种严重退化，且经多年转管，有些已面貌全非。目前国外大多采用 25°C移接繁殖保藏的方法保存外生菌根菌(如松茸、美味牛肝菌等)，部分采取斜面低温 传代法保藏菌种，一般2-3个月就需要转管一次，这不仅费时费力，而且菌种退化严重，容 易造成菌种性状丢失，甚至在保藏或转管过程中污染而造成损失。中国专利CN1321172C 公开了一种食用菌液体菌种的保存方法。将腐生食用菌液体菌种先经过快速冷冻降温 到-40°C -20°C后，再在-40°C -20°C温度下进行保藏，经冷冻保存7个月后的液体菌种 经解冻活化，接种于固体培养基后75%以上能正常萌发，但没有做过菌根食用菌菌种保藏 的实验。中国专利CN92108733. O公开了一种食用菌液体菌种的储存方法，液体菌种储存于一种密闭容器的内腔中，储存温度为rc 25°C，储存时间最长可以达到90天。
发明内容
本发明的目的在于提供一种菌根食用菌菌种的保藏方法，它可填补现有外生菌根 菌菌种保藏技术的空白。为了实现上述目的，本发明的技术方案是一种外生菌根菌菌种的保藏方法，其特 征在于所述的菌根菌菌种的保藏方法包括如下步骤a、将菌根菌的孢子或子实体组织放 入经改良的琼脂培养基中培养菌丝体；b、将琼脂培养基中培养的菌丝体接入液体培养基中 培养；C、将上述培养的菌丝体经勻质器勻质并再次接入液体培养基中培养，直到菌丝体的 菌丝球直径达到0. 2-1. 5cm为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃管中密封保 藏，保藏温度1_25°C、湿度55 75%。使用时，本发明的方法经多种菌根食用菌菌种的保藏实验表明，是一种操作简单 有效，效率高的方法，很适宜于在大量外生菌根菌菌种的保藏中推广应用，具有显著的经济 效益。
图1为两种菌种保藏方法对比效果图
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述。本发明一种外生菌根菌菌种的保藏方法，其特征在于所述的外生菌根菌菌种的 保藏方法包括如下步骤a、将菌根菌的孢子或子实体组织放入改良的琼脂培养基中培养菌 丝体；其中经改良的琼脂培养基的组成如下=Cacl2,0. 03 0. 07g ；Nacl, 0. 018 0. 03g ； KH2Po4,0. 4 0. 65g ；MgSo4 · 7Η20，0· 13 0. 2g ；维生素 B1JO 200 μ g ；Fecl3 · 6H20, 0. 012 0. 036g ； (NH4) 2ΗΡο4，0. 23 0. 27g ；葡萄糖，10 30g ；大麦芽汁 250 450mL ；琼 脂条，15 20g ；补蒸馏水至lOOOmL，pH值5. 1 5. 8 ；b、将菌丝体接入液体培养基中培 养；其中液体培养基的组成如下=Cacl2,0. 03 -0. 07g ；Nacl，0. 018 0. 03g ；KH2Po4,0.4 0. 65g ；MgSo4 · 7Η20，0· 13 0. 2g ；维生素 B1JO 200 μ g ；Fecl3 · 6Η20，0· 012 0. 036g ； (NH4)2HPo4jO. 23 0. 27g ；葡萄糖，10 30g ；大麦芽汁250 450mL ；补蒸馏水至IOOOmL, pH值5. 1 5. 8 ;c、将上述培养的菌丝体经勻质器勻质并再次接入液体培养基中培养，直到 菌丝体的菌丝球直径达到0. 2-1. 5cm为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃管中 或连同培养容器一起密封保藏。a步骤中，将菌根菌的孢子或子实体组织放在琼脂培养基 上，放入培养室中培养，培养室的温度为15-25°C，菌丝的生长速度为25-45天，直到菌丝体 长满培养基表50-80 %，b步骤中，将菌丝体接入液体培养基中，并放在往返式摇床上培养， 培养条件为2048°C、湿度55 75%、120-180转/分钟，培养7_21天。c步骤中，将菌丝 体勻质并接入与b步骤中相同的液体培养基中并放置于震荡培养箱内培养，培养条件为为 温度1548°C、湿度55 75%，转速120-180转/分钟，培养7_21天，直到菌丝球直径达到 0.2-1. 5cm左右为止。d步骤中，将培养好的菌丝球放入螺口玻璃管中，将菌丝球与终培养 液一同放入螺口玻璃管中保藏，保藏温度1_25°C、湿度55-75%。
本发明者在试验过程中发现，我们根据这一发现发明设计了这样一种菌根食用菌 菌种的保藏方法。实施例1松口蘑菌种的保藏方法具体操作步骤如下a、先将新鲜松口蘑的子实体组织放入改良的琼脂培养基 中培养菌丝体，直到菌丝体的菌丝体长满培养基表50%，经改良的琼脂培养基的组成 如 T :Cacl2,0. 05g ；Nacl,0. 02g ；KH2Po4,0. 5g ；MgSo4 ‘ 7H20,0. 18g ；维生 B1, 200 μ g ； Fecl3 · 6Η20，0· 02g ； (NH4) 2ΗΡο4, 0. 25g ；葡萄糖，20g ；大麦芽汁 350mL ；琼脂条，20g ；补蒸馏 水至lOOOmL，pH5. 5 ；培养室的温度为25°C，正负2°C，菌丝的生长速度为培养30天；b、将 琼脂菌丝体接入液体培养基中培养，液体培养基的组成如下，Cacl2,0. 05g ；Nacl,0. 02g ； KH2Po4,0. 5g ；MgSo4 ·7Η20，0· 18g ；维生素 B1, 200 μ g ；Fecl3 · 6H20，0. 02g ； (NH4)2HPo4,0. 25g ； 葡萄糖，20g ；大麦芽汁350mL ；补蒸馏水至lOOOmL，pH5. 5 ；并放在往返式摇床上培养，培养 条件为23°C、湿度65%，转速150转/分钟，培养14天；C、将菌丝体勻质并接入与b步骤中 相同的液体培养基中并放置于震荡培养箱内培养，培养条件为温度、湿度65 %，转速 160转/分钟，培养11天，直到菌丝球直径达到0. 8cm左右为止；d、将以上培养好的菌丝球 转入螺口小玻璃管中或连同培养容器一起密封保藏，保藏温度10°c、湿度55%。以综合PDA 斜面培养保藏法做对照。按着以上方法保藏菌种14个月，分别转接于综合PDA培养基上， 用此法保藏的菌种经转接活化后仅用3天菌种即萌发，菌丝生长旺盛，菌落形态草帽状，30 天菌落直径达3cm(接入时菌球直径0. 3cm)；而对照法保藏的菌种需5天才萌发，菌丝生长 一般，菌落形态不完整，30天菌落直径达1. 8cm(接入时菌块直径0. 8cm)；见图1左边为本 专利申请的保藏方法，右边为常规方法。实施例2美味牛肝菌菌种的保藏具体操作步骤如下a、先将美味牛肝菌的孢子或子实体组织放入改良的琼脂培 养基中培养菌丝体，直到菌丝体的菌丝体长满培养基表75%，经改良的琼脂培养基的组 成如下=Cacl2,0. 06g ；Nacl, 0. 03g ；KH2Po4,0. 6g ；MgSo4 · 7H20，0. 2g ；维生素 B1,150 μ g ； Fecl3 · 6Η20，0· 02g ； (NH4)2HPo4,0. 25g ；葡萄糖，30g ；大麦芽汁 400mL ；琼脂条，18g ；补蒸 馏水至lOOOmL，pH5. 6 ；培养室的温度为22°C，菌丝的生长速度35天；b、将琼脂菌丝体接 入液体培养基中培养，液体培养基的组成如下=Cacl2,0. 06g ；Nacl,0. 03g ；KH2Po4,0. 6g ； MgSo4 · 7Η20，0· 2g ；维生素 B1,150 μ g ；Fecl3 · 6H20，0. 02g ； (NH4)2HPo4,0. 25g ；葡萄糖，30g ； 大麦芽汁400mL ；补蒸馏水至lOOOmL，pH5. 6 ；并放在往返式摇床上培养，培养条件为25°C、 湿度65%、150转/分钟，培养12天；C、将菌丝体勻质并接入与b步骤中相同的液体培养基 中并放置于震荡培养箱内培养，培养条件为为温度25°C、湿度65%，转速150转/分钟，培 养10天，直到菌丝球直径达到1. Ocm左右为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃 管中或连同培养容器一起密封保藏，将培养好的菌丝球放入螺口玻璃管中，将菌丝球与终 培养液一同放入螺口玻璃管中保藏，保藏温度12°C、湿度55%。以综合PDA斜面培养保藏 法做对照。按着以上方法保藏菌种14个月，分别转接于综合PDA培养基上，用此法保藏的菌 种经转接活化后仅用3天菌种即萌发，菌丝生长旺盛；而对照法保藏的菌种需5-7天才萌发， 菌丝生长一般，菌落形态不完整，本保藏菌种的方法明显优于现有技术的菌种保藏的方法。
权利要求
1.一种菌根食用菌菌种的保藏方法，其特征在于所述的菌根食用菌菌种的保藏方法 包括如下步骤a、将菌根菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中培养菌丝体；b、将菌丝 体接入液体培养基中培养；C、将经过液体培养基中培养的菌丝体经勻质器勻质并再次接入 液体培养基中培养，直到达到菌丝体的菌丝球直径达到0. 2-1. 5cm为止；d、将培养好的菌 丝球转入螺口小玻璃管中或连同培养容器一起密封保藏。
2.根据权利要求1所述的一种菌根食用菌菌种的保藏方法，其特征在于其中经改 良的琼脂培养基的组成如下:Cacl2,0. 03 0. 07g ；Nacl,0. 018 0. 03g ；KH2Po4,0. 4 0. 65g ；MgSo4 · 7Η20，0· 13 0. 2g ；维生素 B1JO 200 μ g ；Fecl3 · 6Η20，0· 012 0. 036g ； (NH4)2HPo4jO. 23 0. 27g ；葡萄糖，10 30g ；大麦芽汁250 450mL ；琼脂条，15 20g ；补 蒸馏水至 IOOOmL, ρΗ5· 1 5. 8。
3.根据权利要求1所述的一种菌根食用菌菌种的保藏方法，其特征在于c步骤中，培 养的菌丝体经勻质器勻质并再次接入液体培养基中培养，直到菌丝球直径达到0. 2-1. 5cm 为止。
4.根据权利要求1所述的一种菌根食用菌菌种的保藏方法，其特征在于b、c步骤中， 菌丝体的培养条件为温度1548°C、湿度55-75%、120-180转/分钟，需培育7 21天。
全文摘要
本发明涉及一种菌根食用菌菌种的保藏方法，其特征为所述的菌根食用菌菌种的保藏方法包括如下步骤a、将菌根菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中培养菌丝体；b、将琼脂菌丝体接入液体培养基中培养；c、将上述培养的菌丝体经匀质器匀质并再次接入液体培养基中培养，直到符合要求为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃管中或连同培养容器一起密封保藏。本发明的方法经多种菌根食用菌菌种的保藏实验表明，是一种操作简单有效，效率高的方法，很适宜于在大量外生菌根菌菌种的保藏中推广应用，具有显著的经济效益。
文档编号A01G1/04GK102106233SQ20091024748
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者付绍春, 尚晓冬, 杨慧, 谭琦 申请人:上海市农业科学院