专利名称：：一种制备植物三倍体植株的方法
技术领域：
：本发明属植物栽培领域，具体涉及一种制备植物三倍体植株的方法。
背景技术：
：枇杷是原产于我国的特有亚热带果树，果实正值春夏之交的水果淡季上市，营养丰富，风味极佳，深受人们喜爱。但枇杷美中不足的是，种子多而大，常可达果实重量的三分之一左右，导致枇杷果实可食率不足70%。培育无籽枇杷品种是园艺育种工作者长期的夙愿。三倍体途径是培育无籽品种最理想的技术路线。体细胞含有3个染色体组的生物体称为三倍体。在园艺植物品种选育中，三倍体育种具有特殊意义，可培育出极具商品价值的无籽品种，如三倍体西瓜、三倍体香蕉、三倍体葡萄等，其果实都是无籽的，具有极高的园艺学品质和商品价值。获得三倍体有多种方法，包括从二倍体后代中寻找自然变异三倍体(陈力耕，胡运权.从二倍体柑橘获得三倍体的研究.园艺学报，1981年02期)，用二倍体与四倍体杂交(宋健坤，郭文武，伊华林，等.以异源四倍体体细胞杂种为父本与二倍体杂交创造柑橘三倍体的研究.园艺学报，2005年04期)、原生质体融合(郭文武，邓秀新.柑橘与黄皮属间体细胞杂种植株的异常倍性变异.植物学报，1999年04期)、胚乳培养(王大元，张进仁.从胚乳培养再生三倍体柑橘植株.中国科学A辑，1978年04期)等。在枇杷等蔷薇科植物中上，由于相关基础研究的缺失，上述很多途径至今还没有起步或只尝试了初步研究，未能取得明显成效。福建省农科院果树所利用化学诱变剂秋水仙精获得了四倍体品种"闽三号"，之后用其与二倍体品种杂交，获得了一些可结无籽果实的混倍体植株，但果实太小，综合经济性状欠佳，没有生产实用价值(ZhengS.Q.AchievementandProspectofLoquatBreedinginChina.ProceedingsoftheSecondInternationalSymposiumonLoquat，2006)。此外，陈振光、林顺权、林庆良(陈振光，林顺权，林庆良.枇杷胚乳培养获得植株试验初报.福建农林大学学报(自然科学版)，1983年04期)和彭晓军、王永清(彭晓军，王永清.枇杷胚乳植株再生研究.四川农业大学学报，2002年04期)通过胚乳培养获得了再生植株，却并没有得到可结出无籽果实的三倍体。迄今为止，只有日本的村西(具体方法不详)和我国的梁国鲁等从数以万计的种子后代苗中海量筛选获得了三倍体(LiangG.L.，WangW.X.，XiangS.Q.，GuoQ.G.andLiX丄.GenomicInSituHybridization(GISH)ofNaturalTriploidLoquatSeedlings.ProceedingsoftheSecondInternationalSymposiumonLoquat，2006)。因此，利用三倍体途径培育可在生产上应用的无籽枇杷品种仍然任重道远，研发高效创制枇杷三倍体的方法仍具有重大意义。
发明内容本发明要解决的技术问题是克服现有技术难以制备得到植物三倍体植株的缺陷。解决技术问题的方案是提供一种种制备植物三倍体植株的方法。该方法包括以下步骤a、在开花前，剪去花中的2(n-2)个柱头；b、在花瓣开放时，给保留的柱头进行人工授粉；c、当植物果实即将成熟时，从未受精的胚囊中取出小种子。d、将权利要求5所述的植物小种子接种于培养基上，培养成苗；e、炼苗，移栽培养得植株。步骤a中所述的n为该植物花中的柱头数。进一步的，上述的植物是蔷薇科Rosaceae植物。更进一步的，上述的蔷薇科植物是枇杷属EriobotryaLindl植物。其中，上述方法d步骤所述的培养基为基本培养基为MS，添加蔗糖30g/L、ZT0.1mg/L、NAA0.1mg/L和秋水仙素0.0050.02g/L。优选的，秋水仙素的添加量为0.010.02g/L。其中，上述方法d步骤所述的培养基还含有0.20.4%的活性炭。其中，上述方法d步骤的培养条件为温度28士rC，黑暗条件下培养710天，然后在光照1000士2001ux、16h/d的条件下，培养一个月。具体而言，本发明制备植物三倍体植株的方法可以采取如下具体方法进行并注意以下事项1、步骤a要选取发育健壮的花序并疏花，每花序留25朵花，以便日后果实能获得充足的营养供应。2、去柱头须在开花前，也就是指一般所说的花尚未开放的灯笼花期(即花已成熟，在当天或12天后将开放的时期)进行，以确保未发生授粉受精过程。3、在步骤a中，在剪去柱头时，应使保留的柱头尽量均匀分布。比如在保留柱头较多的情况下应尽量间隔剪去；而在保留较少柱头的情况下应在使保留的柱头均匀分布的同时，保证中心区域(柱头区域的中心)留有至少一个柱头。4、给其余的柱头授以足量花粉，使柱头粘满花粉，确保其完成受精过程，形成足量正常种子，以创造适宜的激素和营养环境，诱发去掉柱头的胚珠孤雌生殖，该方法中人工授粉应授予同种植物的花粉，并且所述同种植物的花粉既可以是相同品种的花粉，也可以是不同品种的花粉，也可以是几个品种的混合花粉。该方法可得到三倍体胚并通过优化的培养条件培育成为植株，得到的三倍体植株可通过各种常规三倍体检测方法鉴别。5、步骤c中的植物果实即将转入成熟时是指果实即将转入成熟却尚未完全成熟的时期，是可以根据常识判断得出的，如对于枇杷EriobotryajaponicaLindl是指果皮开始转黄、果肉开始变软的时期。6、将上述植物三倍体胚直接接种于另添加有蔗糖30g/L、ZT0.1mg/L、NAA0.1mg/L、秋水仙素0.0050.02g/L和0.20.4X活性炭的灭菌MS培养基上，置于28士rC，黑暗条件下培养710天(子叶变绿，胚开始萌发)，然后在光照1000士2001ux、16h/d的条件下，培养约一个月，待其长成完整苗株。随后，对苗株进行炼苗，以适应外界环境。7、炼苗方法为将培养瓶移到室温(1525t:)条件下25天，让培养的苗株逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使苗株获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，37天后，将苗株从培养瓶内取出。洗净苗株根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭1:1混合基质的盆中，置于密封环境条件下，培养过程保持自然光照、100%相对湿度、室温，每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。l个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低苗株生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。—般采用常规染色体检测方法即可从苗中鉴定出三倍体植株。本发明制备植物三倍体胚的方法与通过四倍体与二倍体杂交等现有方法相比，优点在于操作简单、费用低廉、不需要特别的仪器设备和试剂，并且适用面广、成功率高、能很好地克服植物种属差异的影响，适用于大田推广。本发明制备植物三倍体胚的方法能够使植株三倍体种子产生频率提高到1%2%，远远地高于自然发生的频率。本发明三倍体胚对培养条件要求低，更容易培养成苗，苗的生长也更为健康，培养得到的三倍体苗株的移栽存活率可达96%以上。本发明制备植物三倍体植株的方法，在保证培养效果的同时，对仪器设备要求更低、步骤简便，费用低廉，具有很好的的实际应用前景。图1为本发明制备的枇杷小种子的外观图。图2为本发明制备的枇杷三倍体植株及其染色体图(放大1000倍)，其中图2A为枇杷三倍体植株的染色体图，图2B为枇杷二倍体植株的染色体图。图3为本发明制备的枇杷三倍体植株染色体图(放大1000倍)，其中图2A为枇杷三倍体植株的染色体图，图2B为枇杷二倍体植株的染色体图。具体实施例方式下面通过对本发明较佳实施方式的详细描述对本发明进行说明。但这种说明不应理解为是对本发明的限制，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变型，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明权利要求所定义的范围。实施例1小种子的制备1、选取生长良好的枇杷植株20株(品种均为大五星)，随机分为2组4株为对照组、16株为实验组，在枇杷即将开花前12天，从各植株长势良好的花序上每花序选取56朵球型花(处于这一时期的花尚未开放，花粉尚未成熟，故未发生授粉受精过程)，其余花朵全部摘除。拨开选留的球型花，用眼科剪剪去5个柱头中的23个(随机剪去2个，或间隔1个柱头剪掉23个)。2、待花瓣开放时(去柱头12天后)，给保留的柱头授以足量混合花粉(大五星龙泉1号=1:i)。3、当果实发育到直径约1.5cm时，疏去发育不正常的果实，使每个果穗留34个果子，以便果实能充分发育。4、四月中旬至下旬，当枇杷果实直径达3cm左右、表面绒毛蜕去，果实即将转入成熟却尚未成熟(果皮开始变黄、果肉开始变软)时，将实验组再均分为A、B、C、D组，在对照组和4个实验组的每株枇杷处理过的果穗上各随机采摘100个果实，每组共采5摘400个果实，在流水中将果皮洗净。在超净工作台上的无菌条件下，将果实剥开，用无菌的镊子取出未受精的胚囊(未受精的胚囊直径0.20.3cm，而正常种子直径为lcm左右)，置于无菌培养皿中。用无菌手术刀剥开胚囊，取出小种子。用公式小种子获得率=获得小种子数/(获得正常种子数+获得小种子数)*100%计算小种子获得率，结果见表l。小种子的外形及大小见图1。实施例2三倍体植株的制备将实施例1中由A组所制备的小种子，分别直接接种于添加蔗糖30g/L、ZT0.1mg/L、NAA0.1mg/L和秋水仙素0.005g/L的灭菌MS培养基上，先置于28士rC黑暗条件下培养10天，然后在28士rC、光照16h、黑暗8h、10001ux光强下培养成苗(培养40天)。对照组小种子分别直接接种于添加蔗糖30g/L、6-BA0.5mg/L，NAA0.02mg/L和IBA0.02mg/L和0.2%的活性炭的灭菌MS培养基上，先置于28±rC黑暗条件下培养10天，然后在温度25士rC，黑暗条件下培养8天后，在光照2000士5001ux、1418h/d下，培养一个月成苗。待种子长成完整苗株后，进行炼苗，以适应外界环境。炼苗方法为将培养瓶移到室温(1525°C)条件下2天，让培养的小种子苗逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使小种子苗获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，5天后，将枇杷苗从培养瓶内取出。洗净枇杷苗根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭1:l混合基质的盆中，置于封闭环境条件下培养，培养过程保持自然光照、100%相对湿度、25士rC。每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。l个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低枇杷苗生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。采用常规染色体检测方法鉴别三倍体植株，用公式三倍体植株获得率=获得三倍体植株数/(获得正常种子数+获得小种子数)*100%计算三倍体植株获得率(结果见表2中A组)。三倍体枇杷植株和二倍体枇杷植株的外观对比见图2。三倍体枇杷的染色体图见图3A，二倍体枇杷的染色体图见图3B。表1枇杷小种子的制备结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3三倍体植株的制备将实施例1中由B组所制备的小种子，分别直接接种于灭菌MS培养基上，直接接种于添加蔗糖30g/L、ZT0.1mg/L、NAAO.lmg/L和秋水仙素0.0lg/L的灭菌MS培养基上，先置于28士rC黑暗条件下培养10天，然后在28士rC、光照16h、黑暗8h、lOOOlux光强下培养成苗(培养40天)。待长成完整苗株后，进行炼苗，以适应外界环境。炼苗方法为将培养瓶移到室温(1525°C)条件下3天，让培养的小种子苗逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使小种子苗获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，3天后，将枇杷苗从培养瓶内取出。洗净枇杷苗根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭1:l混合基质的盆中，置于密封环境条件下培养，培养过程保持自然光照、100%相对湿度、25士rC。每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。1个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低枇杷苗生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。采用常规染色体检测方法鉴别三倍体植株，用公式三倍体植株获得率=获得三倍体植株数/(获得正常种子数+获得小种子数)*100%计算三倍体植株获得率(结果见表2中B组)。三倍体枇杷的染色体图见图2A，二倍体枇杷的染色体图见图2B。实施例4三倍体植株的制备将实施例1中由植株C组所制备的单倍体胚，分别直接接种于灭菌MS培养基上，直接接种于添加蔗糖30g/L、ZT0.1mg/L、NAA0.1mg/L和秋水仙素0.015g/L的灭菌MS培养基上，先置于28士rC黑暗条件下培养IO天，然后在28士rC、光照16h、黑暗8h、10001ux光强下培养成苗(约培养40天)。待长成完整苗株后，进行炼苗，以适应外界环境。炼苗方法为将培养瓶移到室温(1525°C)条件下3天，让培养的小种子苗逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使小种子苗获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，4天后，将枇杷苗从培养瓶内取出。洗净枇杷苗根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭1:l混合基质的盆中，置于密封环境条件下培养，培养过程保持自然光照、100%相对湿度、25士rC。每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。1个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低枇杷苗生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。采用常规染色体检测方法鉴别三倍体植株，用公式三倍体植株获得率=获得三倍体植株数/(获得正常种子数+获得小种子数)*100%计算三倍体植株获得率(结果见表2中C组)。三倍体枇杷的染色体图见图2A，二倍体枇杷的染色体图见图2B。实施例5三倍体植株的制备将实施例1中由D组所制备的单倍体胚，分别直接接种于灭菌MS培养基上，直接接种于添加蔗糖30g/L、ZT0.1mg/L、NAAO.lmg/L和秋水仙素0.02g/L的灭菌MS培养基上，先置于28士rC黑暗条件下培养10天，然后在28士rC、光照16h、黑暗8h、10001ux光强下培养成苗(培养40天)。待长成完整苗株后，进行炼苗，以适应外界环境。炼苗方法为将培养瓶移到室温(1525°C)条件下3天，让培养的小种子苗逐渐适应外界光照和温度的变化；然后揭去培养瓶无菌封口膜，使外界空气进入培养瓶内，使小种子苗获得对正常自然条件下微生物的抗性并且适应外界空气湿度的变化，5天后，将枇杷苗从培养瓶内取出。洗净枇杷苗根上的培养基，移栽于灭菌的珍珠岩与泥炭1:l混合基质的盆中，置于密封环境条件下培养，培养过程保持自然光照、100%相对湿度、25±rC。每两周用MS营养液(即MS培养基)施肥一次。1个月后逐渐拆去密封设施，逐渐降低枇杷苗生长环境的相对湿度至自然水平，最后撤去密封设施。采用常规染色体检测方法鉴别三倍体植株，用公式三倍体植株获得率=(获得三倍体植株数/小种子苗株数)*100%计算三倍体植株获得率(结果见表2中D组)。三倍体枇杷的染色体图见图2A，二倍体枇杷的染色体图见图2B。表2枇杷三倍体植株的制备结果分组小种子数/j、禾中，帛，，得苗株数三倍体苗株数三倍体植株获得率(》)对照262400A848022，5B585635.4G7623.3D6246.5上述实例表明本发明制备植物三倍体的方法能够使枇杷三倍体植株生成频率远远地高于自然发生的频率。采用本发明方法制备得到的枇杷三倍体苗生长极为健壮。本发明制备三倍体植株时只使用了一种培养基，对仪器设备要求不高，步骤简便，费用低廉，具有很好的实际应用前景。附MS培养基(MurashigeandSkoogmedium)配方大量元素二水合氯化牵丐(CaC12)440.0mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170.0mg/L、硝酸钾(KNO3)1900.0mg/L、七水合硫酸镁(MgSO4.7H2O)370.0mg/L、硝酸铵(NH4NO3)1650.0mg/L;微量元素五水合硫酸铜(CuSO4.5H2O)0.025mg/L、铁盐(FeNaEDTA)36.7mg/L、硼酸(H3B03)6.2mg/L、一水合硫酸锰(MnS04.H20)16.9mg/L、七水合硫酸锌(ZnS04.7H20)8.6mg/L、四水合钼酸钠(Na2Mo4.4H2O)0.25mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L。有机物甘氨酸(Glycine)2.0mg/L、肌醇(Myo-inositol)100mg/L、烟酸(Nicotinicacid)0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L。IBA:喷哚丁酸(indolebutyricacid)NAA:萘乙酸(a-naphthaleneaceticacid)ZT:玉米素(zeatin)6-BA:6-节氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine)权利要求一种植物三倍体植株的制备方法，它包括以下步骤a、在开花前，剪去花中的2～(n-2)个柱头，n为该植物花中的柱头数；b、在花瓣开放时，给保留的柱头进行人工授粉；c、当植物果实即将成熟时，从未受精的胚囊中取出小种子；d、将小种子接种于培养基上，培养成苗；e、炼苗，移栽培养得植株。2.根据权利要求2所述的植物三倍体植株的制备方法，其特征在于所述的植物是蔷薇科RoSaceae植物。3.根据权利要求3所述的植物三倍体植株的制备方法，其特征在于所述的蔷薇科植物是枇杷属EriobotryaLindl植物。4.根据权利要求1所述的植物三倍体植株的制备方法，其特征在于d步骤所述的培养基为基本培养基为MS，添加蔗糖30g/L、ZT0.1mg/L、NAA0.1mg/L和秋水仙素0.0050.02g/L。5.根据权利要求4所述的植物三倍体植株的制备方法，其特征在于所述秋水仙素的添加量为0.010.02g/L。6.根据权利要求1所述的三倍体植株的制备方法，其特征在于d步骤所述的培养基还含有0.20.4%的活性炭。7.根据权利要求1所述的三倍体植株的制备方法，其特征在于d步骤的培养条件为温度28士rC，黑暗条件下培养710天，然后在光照1000士2001ux、16h/d的条件下，培养一个月。全文摘要本发明提供了一种制备植物三倍体植株的方法，属于植物栽培领域，该制备方法包括以下步骤a、在枇杷开花前，剪去花中的2～3个柱头；b、在花瓣开放时，给保留的柱头进行人工授粉；c、当枇杷果实即将转入成熟时，从未受精的胚囊中取出小种子d、将小种子接种于培养基上培养成苗；e、炼苗，移栽培养得植株。本发明方法优点在于操作简单、不需要特别的仪器设备、费用低廉、且成功率高，适用于大田推广，具有很好的实际应用前景。文档编号A01H4/00GK101690461SQ200910309218公开日2010年4月7日申请日期2009年11月2日优先权日2009年11月2日发明者严娟,吕秀兰,李俊强,王小蓉,王永清,邓群仙申请人:四川农业大学