方法

专利名称：方法
技术领域：
本发明涉及使用脂质酰基转移酶降低基于肉的食品的胆固醇含量和/或改进基 于肉的食品的性质的方法，以及由此获得的基于肉的食品。
背景技术：
在肉和香肠产品的生产中，一个主要目标是乳化所添加的脂肪，并且利用来自肉 基质的活化蛋白粘合或固定所添加的水。例如，熟香肠的制造技术包括机械能以及活化释 放蛋白的添加剂的影响，所述添加剂例如磷酸酯(盐)和盐类。最终结果应当是均质、经精 细切割且质地平滑的产品，其能够耐受处理而没有脂肪或水的分离，显示出坚实的质地和 好的咬感(Feiner 2006 Meat products handbook. CRC Press，239—312)。如果没有正确地遵守负责形成和稳定肉产品乳液的技术标准，即原料的质量波 动(例如，肉色苍白、质地松软且表面有汁液渗出(PSE)的肉和暗红色、质地坚硬、表面干 燥(DFD)的肉)、配方、加工条件(例如时间和温度)，可能生产出不再符合消费者需要的 不稳定产品(Fischer et al.，1991 Finely comminuted liver sausage-How the normal commercial emulsifiers work. Fleischwirtsch 71，780-783)。在肉和香肠的加工中使用乳化剂以补偿肉原料中的这些质量波动，从而确保一致 的终产物质量，并促进工业生产中涉及的技术过程(Nau & Adams，1992 Emulsifiers for use in sausage and meat products. Food marketing & technology June,13-20)。在具有大量脂肪含量的乳化肉产品，例如在精膏(fine paste)香肠和肉酱中，期 望其具有脂肪稳定性，从而使脂肪损失最小化，并降低可见脂肪的量。此外，还希望肉汁损 失少，并且具有可接受的风味、质地和外观。可添加乳化剂以达到这些效果，且最常见的一 些乳化剂是分离的蛋白或蛋白浓缩物，例如大豆蛋白或酪蛋白酸钠。然而，这些蛋白的特 征在于相对昂贵并且在肉产品中的许可含量有限制。也可以使用添加剂，例如甘油单酯和 甘油二酯和柠檬酸酯作为乳化剂(Varnam & Sutherland, 1995 Meat and meat products. Technology, chemistry and microbiology. Chapman & Hall Vol 3, 244-250),但由于价格或标签(即在肉产品标签上没有添加剂)的原因，它们的应用通常是不期望的。已知酶在食品应用中是有优点的。例如，已经发现脂质酰基转移酶在食物中具有 显著的酰基转移酶活性。这种活性在食物的制备方法中具有令人惊奇的有益应用(参见， 例如 W02004/064537)。由于酶处理必须在约10°C至约55°C之间的温度下发生，否则酶可能失活或不能 发挥最佳的作用，因此在基于肉的食品的制备中，一些酶的应用可能是不利的。然而，大部 分腐败菌、病原体和真菌能够在这些温度下增殖。因此，可能期望找到与风味、质地和外观 相关的问题的解决方案，其减少了基于肉的食品中的腐败菌、病原体和真菌在加工期间的增殖。根据肉消耗和胆固醇含量数据，估计三分之一至一半的推荐每日胆固醇摄取量 是由肉提供的(Chizzolini et al. , 1999 Calorific value and cholesterol content of normal and low-fat meat and meat products. Trends in food science and technology,10，119-128)。本发明的一个目标是降低基于肉的食品中的胆固醇。可选地，或除了降低胆固醇 之外，还希望保持和/或改进一种或多种以下特征脂肪稳定性以使基于肉的产品中脂肪 损失最小化并减少可见脂肪的量、风味、质地、重量损失和外观。另一个目标是制备使腐败菌、病原体和真菌的增殖具有降低的可能性的基于肉的食品。

发明内容
本发明的各个方面体现于权利要求书和以下说明中。本发明人惊讶地发现，通过向用于制备基于肉的食品的肉中添加脂质酰基转移 酶，能够实现所述基于肉的食品中的胆固醇含量显著下降。此外，还惊讶地发现，能够使所 述基于肉的食品中的胆固醇含量下降，而没有影响以下一个或多个特征的任何不良作用 质地、重量损失、脂肪稳定性(包括油脂性和/或热加工期间脂肪分离减少)、风味和外观。更惊讶的是，发现通过向用于制备基于肉的食品的肉中添加脂质酰基转移酶，能 够使所述基于肉的食品中的胆固醇含量显著下降，同时实现一种或多种以下效果质地改 进；重量损失减少；脂肪稳定性提高(包括油脂性降低和/或热加工期间脂肪分离减少)、 风味和外观改进。更惊讶的是，发现通过向用于制备基于肉的食品的肉中添加脂质酰基转移酶，可 在低温(例如，低于10°c )或较高温度(例如，65°C以上)下加工所述肉，即在不太可能导 致腐败菌、病原体和真菌增殖的温度下进行加工。因此，这使得基于肉的最终食品中的腐败 菌、病原体和/或真菌负载减少。在一个实施方式中，本发明提供了用于生产基于肉的食品的方法，所述方法包 括a)使肉接触脂质酰基转移酶；b)在约1°C至约75 °C之间的温度下温育所述与脂质酰基转移酶接触的肉；c)由所述肉生产食品；其中步骤b)在步骤C)之前、期间或之后进行。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于降低基于肉的食品的胆固醇含量和/或 改进其一个或多个特征(例如一个或多个以下特征改进基于肉的食品的质地和/或减少 重量损失和/或提高脂肪稳定性和/或改进风味和/或改进外观)的方法，所述方法包括a)使肉接触脂质酰基转移酶；b)在约1°C至约75 °C之间的温度下温育所述与脂质酰基转移酶接触的肉；c)由所述肉生产食品；其中步骤b)在步骤C)之前、期间或之后进行。在另一个实施方式中，本发明提供了脂质酰基转移酶在生产基于肉的食品中的应用。在另一个实施方式中，本发明提供了脂质酰基转移酶在生产基于肉的食品中的应 用，其技术效果是与其中肉未经所述脂质酰基转移酶处理的基于肉的相当(comparative) 食品相比，所述基于肉的食品的胆固醇量降低。在另一个实施方式中，本发明提供了脂质酰基转移酶在生产基于肉的食品中的应 用，其中技术效果是与其中肉未经所述脂质酰基转移酶处理的基于肉的相当食品相比，所 述基于肉的食品的胆固醇量降低和/或与其中肉未经所述脂质酰基转移酶处理的基于肉 的相当食品相比，所述基于肉的食品的一个或多个以下特征改善质地改进和/或重量损 失减少和/或脂肪稳定性提高和/或风味改进和/或外观改进。在另一个实施方式中，本发明提供了胆固醇减少或不含胆固醇的基于肉的食品， 其包含至少30%的肉和灭活的脂质酰基转移酶。本发明还提供了通过本发明所述方法可获得(例如获得)的基于肉的食品。发明详述在一个实施方式中，适合地，可将所述肉与所述脂质酰基转移酶一起温育约30分 钟至M小时，适合地一起温育约1小时至21小时之间。在另一个实施方式中，可在低于约10°C的温度下将所述肉与所述脂质酰基转移酶 一起温育，例如在约1 °C至约9 0C之间，适合地在约1 °C至约6 0C，适合地在约2 0C至约6 0C之 间，优选在约2°C至约5 °C之间温育。当将所述肉与所述脂质酰基转移酶在低于约10°C的温度下，例如在约1°C至约 9 0C之间的温度，适合地在约1°C至约6 °C之间的温度，适合地在约2 °C至约6 °C之间的温度， 优选在约2°C至约5°C之间的温度温育时，优选将所述脂质酰基转移酶温育约10小时至约 24小时之间。在另一个实施方式中，可将所述肉与所述脂质酰基转移酶在约60°C至约75°C之 间的温度下，适合地在约62°C至约70°C之间的温度，适合地在约60°C至约78°C的温度，优 选在约65°C至约70°C之间的温度温育。当将所述肉与所述脂质酰基转移酶在约60°C至约75°C之间的温度下，适合地在 约62°C至约70°C之间的温度，适合地在约60°C至约78°C的温度，优选在约65°C至约70°C 之间的温度温育时，将所述肉与所述脂质酰基转移酶一起温育约30分钟至约2小时之间， 优选约1小时至1. 5小时。在一个实施方式中，将所述与脂质酰基转移酶接触的肉和/或由此获得的食品 进一步加热至一定的温度并保持足够的时间以将所述酶灭活，例如加热至约80°C至约6140°C，优选90°C至约120°C范围的温度。本文使用的术语“温育”是指将所述肉和所述脂质酰基转移酶保持在所述酶具有 活性，即能够进行脂质酰基转移酶反应(特别是能够将脂肪酸从磷脂供体转移到胆固醇受 体)的条件下。本文使用的术语“温育”不意欲包括将肉和酶保持在所述酶失活、所述酶被 灭活和/或所述酶处于被灭活或变性过程中的条件下。在本发明的一些方面，术语“提高/增加”或“降低/减少”或“改进”(或本文使 用的其他相关术语)是指将使用本发明脂质酰基转移酶处理的肉或基于肉的食品与未经 本发明脂质酰基转移酶处理的相当肉或基于肉的相当食品(即由相同组分并以相同方式 生产的食品)进行比较。例如，在本发明的一个实施方式中，“减少胆固醇的量”或“胆固醇减少”是指在 本发明所述的由脂质酰基转移酶处理的肉或基于肉的食品的胆固醇量减少，或低于没有添 加本发明所述脂质酰基转移酶的相同肉或基于肉的食品(即由相同组分并以相同方式生产)。优选地，与没有根据本发明用所述脂质酰基转移酶处理的基于肉的相当食品相 比，所述基于肉的食品的中的胆固醇减少至少约15%，优选至少约20%，更优选至少约 40 %，适合地至少50 %或至少60 %。在一个实施方式中，所述基于肉的食品中的胆固醇适合地减少约40%至约70% 之间。本文中所述“胆固醇”是指“未酯化的游离胆固醇”。因此，本文所述胆固醇量减少 是指未酯化的游离胆固醇的量减少。在一些实施方式中，本发明所述的基于肉的食品可被视为“不含胆固醇”。术语“不 含胆固醇”是指所述肉或基于肉的食品中的所有或几乎所有胆固醇都被转化成胆固醇酯。 在一些实施方式中，可适合地将80 %以上，适合地90 %以上的未酯化游离胆固醇转化成胆 固醇酯。在一个实施方式中，“不含胆固醇”的产品可以是其中至少90%的未酯化游离胆固 醇已被转化成胆固醇酯的产品。在一个实施方式中，可向所述肉或基于肉的食品中添加磷脂(例如来自大豆和/ 或蛋的磷脂)。所述磷脂可在用所述脂质酰基转移酶处理之前、期间或之后添加。适合地， 所述磷脂的添加可导致所述基于肉的食品中的胆固醇水平进一步降低。在一些实施方式中，本文使用的相关术语可用于比较使用本发明脂质酰基转移 酶处理的肉或基于肉的食品和使用除脂质酰基转移酶之外的酶处理的相当肉或基于肉的 相当食品，例如与使用常规磷脂酶，如Lecitase Ultra (Novozymes A/S，Denmark)或 Lipomod 699L，Biocatalyst, UK处理的相当肉或基于肉的相当食品进行比较。为了便于参考，在适合的小节标题下讨论本发明的这些和其他方面。然而，在每个 部分中的教导不必局限于每个具体的部分。用于测定转移酶活性(TrU)的转移酶测定(胆固醇磷脂)底物将50mg胆固醇(Sigma C8503)和450mg大豆磷脂酰胆碱(PC)，Avanti #441601溶于氯仿，并在40°C真空蒸发氯仿。在40°C，将 300mg PC 胆固醇(9 1)分散在 IOml 50mM HEPES 缓冲液(pH7) 中。
酶解在40°C，将250 μ 1底物添加到带盖玻璃器中。添加25 μ 1酶溶液，并在搅动下于40°C温育10分钟。在测定中，所添加的酶应当将2-5%的胆固醇酯化。此外，同样分析使用25 μ 1水代替酶溶液的空白对照。10分钟后，添加5ml己烷异丙醇(3:2)。使用胆留醇硬脂酸酯(Sigma C3549)作为校准标准品，通过HPTLC分析胆固醇酯的量。计算在测定条件下每分钟形成的胆固醇酯量，作为转移酶活性。一个转移酶单位(TrU)被定义为根据上文所述的转移酶测定，在40°C，pH 7的条 件下，每分钟产生胆固醇酯的μπιο 数。
优选在本发明方法和应用中使用的脂质酰基转移酶具有至少25TrU/mg酶蛋白的 每mg酶比转移酶单位(TrU)。适合地，用于本发明的脂质酰基转移酶的添加量可为0.05_50TrU/g基于肉的食 品，适合地，所述量为0. 5-5TrU/g基于肉的食品。适合地，所述温育时间是有效确保至少5%的转移酶活性，优选至少10%的转移 酶活性，优选至少15%、20%、25%、洸％、沘％、30%、40%、50%、60%或75%的转移酶活性。可通过以下方法测定转移酶活性％ (即转移酶活性占总酶活性的百分比)用于测定转移酶活性％的方法将肉样品冻干，并将干燥的样品在咖啡磨中碾碎。使用氯仿甲醇O 1)提取 0. 5g干肉粉30分钟。分离有机相，并通过GLC分析。GLC 分析Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱仪，其配备有WCOT熔凝硅石柱 12.5mX0.25mm IDX0. 1 μ m 膜厚度 5%苯甲基硅酮(CP Sil 8 CB，来自 Crompack)。载气氦。注射器PSSI冷分流注射(由最初温度50°C加热至385°C )，体积1. 0 μ 1。检测器FID :395 °C。炉程序(自2OO3年10月3O日开始使用)1 2 3炉温(V)90 280 350等温，时间(分钟)1 0 10变温速率(°C /分钟)15 4样品制备将从肉样品提取的脂质溶于包含0.5mg/ml十七烷内标的0.5ml庚 烷吡啶O 1)中。将300μ1样品溶液转移到钳口瓶(crimp vial)中，添加300μ1 MSTFA (N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺)，并在60°C反应20分钟。计算由纯参比物质测定对游离脂肪酸(FFA)、胆固醇、胆固醇棕榈酸酯 (Cholesteryl palmitate)和胆固醇硬脂酸酯的反应因子。基于对游离脂肪酸、胆固醇和胆固醇酯的反应因子，计算肉样品中这些成分的含8量％。将肉产品中脂质酰基转移酶的转移酶活性％计算为相对于未经酶处理的相同肉 产品中的胆固醇量，经酶处理的肉中的胆固醇下降％。实例对照肉产品0. 075 %胆固醇经脂质酰基转移酶处理的肉产品0. 030%胆固醇转移酶活性=(0.075-0. 030)xl00/0. 075 = 60%转移酶活性基于肉的食品本发明所述的基于肉的食品是指基于肉的任何产品。基于肉的食品适合于人和/或动物作为食品和/或饲料消费。在本发明的一个实 施方式中，所述基于肉的食品是用于饲喂动物的饲料产品，例如宠物食品。在本发明的另一 个实施方式中，所述基于肉的食品是用于人的食品。基于肉的食品可包含非肉成分，例如水、盐、面粉、乳蛋白、植物蛋白、淀粉、水解蛋 白、磷酸盐(酯)、酸、调料、着色剂和/或调质剂(texturising agent)。本发明所述的基于肉的食品优选包含5-90% (重量/重量)的肉。在一些实施方 式中，所述基于肉的食品可包含至少30% (重量/重量)的肉，例如至少50%，至少60%或 至少70%的肉。在一些实施方式中，所述基于肉的食品是熟肉，例如火腿、腰肉、前腿肉、熏肉和/ 或猪胸肉。所述基于肉的食品可以是以下一种或多种干或半干的咸肉，例如用发酵剂培养物干腌并发酵的发酵产品，如干香肠、萨拉米 香肠、意大利辣香肠和干火腿；乳化的肉食品(例如，用于冷食或热食)，例如烟熏香肚、法兰克福香肠、午餐肉和 肉酱；鱼类和海鲜，例如虾、鲑鱼、重配的(reformulated)鱼制品、冷冻包装的鱼类；新鲜肌肉，例如注射的整个肌肉(whole injected meat muscle)，如腰肉、肩肉火 腿、腌制的肉；经碾碎和/或重构的鲜肉，或重配的肉，例如通过冷凝胶或粘合升级的切割肉，例 如未烹制的生煎肉排、肉排、烤肉、生香肠、牛肉汉堡、肉丸、水饺子(pelmeni)；家禽产品，例如鸡胸肉或火鸡胸肉，或重配的禽肉，例如鸡肉块和/或鸡肉肠；杀菌产品(retorted product)，即高压灭菌的肉产品，例如野餐火腿、午餐肉、乳 化广品。在本发明的一个实施方式中，基于肉的食品是经加工的肉产品，例如香肠、博洛尼 亚大香肠、肉糕、碎肉制品、肉末、咸肉、波洛尼亚香肠、萨拉米香肠或肉馅。经加工的肉产品可以是，例如由基于肉的乳液制备的乳化肉产品，例如烟熏香肚、 博洛尼亚大香肠、意大利辣香肠、肝肉香肠、鸡肉香肠、维也纳小香肠、法兰克福香肠、午餐 肉和肉馅。可将基于肉的乳液进行烹制、灭菌或烘焙，例如以烘焙的形式或在将基于肉的乳 液填充到肠衣例如塑料、胶原、纤维素或天然肠衣后进行烹制、灭菌或烘焙。经加工的肉产品还可以是重构的肉产品，例如重构的火腿。本发明的肉产品可经历加工步骤，例如盐腌， 如干盐腌；腌制，如卤水腌制；干燥；熏制；发酵；烹制；罐装；杀菌(retort)；切片和/或粉 碎。在一个实施方式中，与所述脂质酰基转移酶接触的肉可以是碎肉(minced meat)。在另一个实施方式中，所述食品可以是乳化的肉产品。肉本文使用的术语“肉，，是指源自任何种类动物的任何类型的组织。本文使用的术语肉可以是包含源自动物的肌纤维的组织。所述肉可以是动物肌 肉，例如整个动物肌肉或由动物肌肉切成的片。在另一个实施方式中，所述肉可包含动物的内部器官，例如心脏、肝脏、肾脏、脾 脏、胸腺和脑。术语肉包括经研磨、切碎或通过本领域已知的任何其他方法切成小块的肉。所述肉可源自于任何种类的动物，例如来自牛、猪、羊羔、绵羊、山羊、鸡、火鸡、鸵 鸟、雉鸡、鹿、麋鹿、驯鹿、水牛、野牛、羚羊、骆驼、袋鼠；任何种类的鱼，例如西鲱、鳕鱼、黑线 鳕、金枪鱼、海鳗、鲑鱼、鲱鱼、沙丁鱼、鲭鱼、竹荚鱼、刀鱼、圆腹鲱、青鳕、比目鱼、凤尾鱼、小 鲱魚(pilchard)、蓝鳕、太平洋蓝牙鳕、鳟、鲶鱼、鲈鱼、毛鳞鱼、枪鱼、红鲷鱼、挪威鳕和/或 海鳕；任何种类的贝类，例如蛤、贻贝、扇贝、鸟蛤、滨螺、蜗牛、牡蛎、虾、龙虾、海螯虾、蟹、小 龙虾、乌贼、鱿鱼和/或章鱼。在一个实施方式中，所述肉是牛肉、猪肉、肌肉、羊肉和/或火鸡肉。脂质酰基转移酶在某些方面，用于本发明任一方法和/或应用的脂质酰基转移酶可包含GD&基序 和/或GANDY基序。优选地，所述脂质酰基转移酶的特征是其为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序 列基序⑶SX的酶，在⑶SX中X是以下氨基酸残基中的一种或多种L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、 Ν、Μ 或 S。适合地，用于本发明任一方法和/或应用的编码脂质酰基转移酶的核苷酸 序列或脂质酰基转移酶可以获自于，优选获自于以下一个或多个属的生物气单胞菌 属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳球菌属 (Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属 (Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯 ffi ff ^M (Campylobacter) > ^ M (Vibrionaceae) > 7^ ff ^ M (Xylella) > ψι Bf^M (Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌 属(Listeria)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属 (Ralstonia)、黄杆菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。优选地，所述脂质酰基转 移酶可以获自于，优选获自于气单孢菌属的生物。在本发明的一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶 的核苷酸序列编码在对应于SEQ ID No. 20所示的杀鲑气单胞菌(Aeromcmas salmonicida) 脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的N-80位置上包含天冬氨酸残基的脂质酰基转移酶。在本发明的一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是在10对应于SEQ ID No. 20所示的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的N-80位置上 包含天冬氨酸残基的脂质酰基转移酶。用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是具有脂质酰基转移 酶活性的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 9、 SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 41,SEQ ID No. IUSEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 20所示的任一氨基酸序列，或与上述序列具有 75 %或更高的同一性的氨基酸序列。此外或可选地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷 酸序列编码可包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列，或与其具有75%或更高同一性的氨基 酸序列的脂质酰基转移酶。适合地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码可包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。此外或可选地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷 酸序列编码可包含SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列或与其具有75%或更高同一性的氨基 酸序列的脂质酰基转移酶。适合地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码可包含SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶具有 SEQ ID No. 37或SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID No. 37或SEQ ID No. 15具有至少75 %的同一性，优选至少80 %，优选至少85 %，优选至少95 %，优选至少 98 %的同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶由SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列编码，或者由与SEQ ID No.沈具有至少75%的同一性，优选至 少80%，优选至少85%，优选至少95%，优选至少98%的同一性的核苷酸序列编码。用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编 码天然的脂质酰基转移酶或脂质酰基转移酶变体。用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶可以是天然的脂质酰 基转移酶或脂质酰基转移酶变体。例如，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是W02004/064537、 W02004/064987、W02005/066347或W02006/008508中所述的一种。这些文献通过引用并入本文。本文所用的术语“脂质酰基转移酶”优选地是指具有酰基转移酶活性的酶(通常 被归类为E. C. 2. 3. 1. χ,如2. 3. 1. 43)，其中所述酶能够将酰基基团从脂质转移到固醇，如 胆固醇。优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是能够将酰基基团 从磷脂(如本文所定义)转移到固醇(如胆固醇)的脂质酰基转移酶。另一方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以并且能够将 酰基基团从脂质转移到固醇(如胆固醇)，此外还能够将酰基基团从脂质转移到以下的一 种或多种物质碳水化合物、蛋白、蛋白亚基、甘油。优选地，脂质酰基作用的脂质底物是以下脂质中的一种或多种磷脂，如卵磷脂，如磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺。所述脂质底物在本文中可以被称为“脂质酰基供体”。本文所用的术语卵磷脂涵盖 磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。如上所述，可通过与pFam00657共有序列(SEQ ID No. 1)的比对和/或与⑶酰 基转移酶，例如SEQ ID No. 28的比对来鉴定⑶GANDY和HPT区的存在，从而鉴定适合用 于本发明方法的其他酰基转移酶。为了评估它们用于本发明的适宜性，即鉴定具有占总酶 活性至少5 %的转移酶活性，更优选至少10 %，更优选至少20 %，更优选至少30 %，更优选 至少40 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %，更优选至少70 %，更优选至少80 %，更优选 至少90%，更优选至少98%的转移酶活性的那些酶，使用上文详述的“用于测定酰基转移 酶活性％的方法”测试此类酰基转移酶。在一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶优选为不能或 基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯的脂质酰基转移酶。在一些方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶优选为不表现 出三酰基甘油(triacylglycerol)脂肪酶活性(E. C. 3. 1. 1. 3)或不表现出显著的三酰基甘 油脂肪酶活性(E. C. 3. 1. 1. 3)的脂质酰基转移酶。水解甘油三酯的能力(E. C. 3. 1. 1. 3活性)可以根据Food Chemical Codex (3rd Ed.，1981，pp 492-493)(其中修改为以葵花油，pH 5. 5替代橄榄油，pH 6. 5)测定的脂肪 酶活性来测定。脂肪酶活性以LUS (葵花油的脂肪酶单位)来计量，其中将1 LUS定义为在 以上测定条件下每分钟可以从葵花油中释放1 μ mol脂肪酸的酶量。或者，也可以使用如 W09845453中定义的LUT试验。此文献通过引用并入本文。用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以为基本上不能作用于 甘油三酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶的LUS/mg可以小于1000，如小于500，如 小于300，优选为小于200，更优选为小于100，更优选为小于50，更优选为小于20，更优选为 小于10，如小于5，小于2，更优选为小于1 LUS/mg。可选地，LUT/mg活性小于500，如小于 300，优选为小于200，更优选为小于100，更优选为小于50，更优选为小于20，更优选为小于 10，如小于5，小于2，更优选为小于1 LUT/mg。用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是基本上不能作用于 甘油单酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶可以在LUS测定中使用单油酸酯(M7765 1-油酰-rac-甘油99%)以替代葵花油来确定。将IMGHU定义为在所述测定条件下每分 钟可以从甘油单酯中释放1 μ mol脂肪酸的酶量。用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是优选基本上不能作 用于甘油三酯的脂质酰基转移酶，所述脂质酰基转移酶具有的MGHU/mg可以小于5000，如 小于1000，如小于500，如小于300，优选为小于200，更优选为小于100，更优选为小于50， 更优选为小于20，更优选为小于10，如小于5，小于2，更优选为小于1 MGHU/mg。适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以表现出一种 或多种以下磷脂酶活性的脂质酰基转移酶磷脂酶A2活性(E. C. 3. 1. 1. 4)和/或磷脂酶Al 活性(E. C. 3. 1. 1. 32)。所述脂质酰基转移酶也可以具有磷脂酶B活性(E. C. 3. 1. 1. 5)。因此，在一个实施方式中，本发明的“酰基受体”可以为植物固醇/留烷醇，优选为 胆固醇。
优选地，所述脂质酰基转移酶可以使用以下标准进行表征所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的 原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；和所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种L、 A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M 或 S。GDSX基序由四个保守的氨基酸构成。优选地，该基序中的丝氨酸为所述脂质 酰基转移酶的催化丝氨酸。适合地，⑶SX基序的丝氨酸的位置可对应于Brumlik和 Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996，Vol. 178，No. 7，ρ 2060-2064)中教导的嗜 水气单胞菌脂质酰基转移酶的kr-16。为了测定蛋白是否具有本发明的⑶SX基序，优选使用W02004/064537或 W02004/064987(均通过引用并入本文)中公开的方法，将序列与pfam数据库的隐马尔可夫 模型谱(hidden markov model profile) (HMM 谱)进行比较。优选地，所述脂质酰基转移酶可以使用Pfam00657共有序列进行比对(有关完整 的解释参见 W02004/064537 或 W02004/064987)。优选地，与pfam00657结构域家族的隐马尔可夫模型谱(HMM谱)的阳性匹配表示 存在本发明的⑶SL或⑶SX结构域。优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，用于本发明方法和/或应用的脂 质酰基转移酶可以具有至少一个，优选为多于一个，更优选为多于两个的下述区(block) ⑶区、GANDY区、HPT区。适合地，所述脂质酰基转移酶可以具有⑶区和GANDY区。或 者，所述酶可以具有GD&c区和HPT区。优选地，所述酶至少包含GD&c区。更多细节请参见 W02004/064537 或 W02004/064987。优选地，GANDY基序的残基选自GANDY、GGNDA, GGNDL,最优选为GANDY。Pfam00657⑶SX结构域是区分有此结构域的蛋白和其它酶的独特标志。图3中显示了 pfam00657共有序列(SEQ ID No. 2)。其源自于对第6版数据库 pfam家族00657 (在本文中也可以称为pfam00657. 6)的鉴定。所述共有序列可以通过使用较新版pfam数据库来升级(如参见W02004/064537 或 W02004/064987)。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以 使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶(i)所述酶具有可以被定义作酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供 体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；(ii)所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多 种丄、八、￥、1、卩、丫、!1、0、1\1]\1或3;(iii)所述酶包含His-309或在图2和4(SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 3)中所示的 嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中对应于His-309的位置上包含组氨酸残基。优选地，所述⑶SX基序的氨基酸残基为L。在SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长 序列(即包含信号序列的蛋白)中的His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的 序列)中的His491。
在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶为包含 以下催化三联体的脂质酰基转移酶Ser-34、Asp-306和His_309，或在对应于图4 (SEQ ID No. 3)或图2(SEQ ID No. 1)中所示嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中的kr-34、Asp-306和 His-309的位置上分别包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No.3或SEQ ID No. 1所示的序列中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即 包含信号序列的蛋白)中的％r-34、Asp-306和His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信 号序列的序列)中的kr-16、Asp-288和Hisj91。在图3(SEQ ID No. 2)所示的pfam00657 共有序列中，活性位点残基相应于Ser-7、Asp-345和His-348。在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以 使用以下标准进行表征的脂质酰基转移酶所述酶具有可以被定义作酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将第一脂质酰基供 体的原始酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；和所述酶至少包含Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134 和 His-309，或在对应于 SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1所示嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中的Gly-32、Asp-33、Ser_34、 Asp-306和His-309的位置上分别包含甘氨酸残基、天冬氨酸残基、丝氨酸残基、天冬氨酸 残基和组氨酸残基。合适地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转 移酶活性的多肽，其中所述多肽是通过表达SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 25、 SEQ ID No. 48,SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 5USEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28、 SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 31、 SEQ ID No. 52,SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 35或SEQ ID No. 36 所示的任一核苷酸序列，或与上述序列具有75%或更高的同一性的核苷酸序列而获得的。适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以由以下核苷酸序列中之-一编码a) SEQIDNo.21所示的核苷酉堯序列(参见图21)b)SEQIDNo.47所示的核苷酉堯序列(参见图60)c) SEQIDNo.25所示的核苷酉堯序列(参见图25 ；d) SEQIDNo.48所示的核苷酉堯序列(参见图50)e)SEQIDNo.50所示的核苷酉堯序列(参见图63)f) SEQIDNo.51所示的核苷酉堯序列(参见图64)g) SEQIDNo.26所示的核苷酉堯序列(参见图39)h) SEQIDNo.27所示的核苷酉堯序列(参见图40)i)SEQIDNo.28所示的核苷酉堯序列(参见图41)j) SEQIDNo.38所示的核苷酉堯序列(参见图51)k) SEQIDNo.39所示的核苷酉堯序列(参见图52)1)SEQIDNo.40所示的核苷酉堯序列(参见图53)m) SEQIDNo.29所示的核苷酉堯序列(参见图42)η) SEQIDNo.30所示的核苷酉堯序列(参见图43)ο) SEQIDNo.31所示的核苷酉堯序列(参见图44)14
(p)SEQ ID No. 52所示的核苷酸序列(参见图65)；(q) SEQ ID No. 32所示的核苷酸序列(参见图45)；(r)SEQ ID No. 33所示的核苷酸序列(参见图46)；(s)SEQ ID No. 34所示的核苷酸序列(参见图47)；(t) SEQ ID No. 35所示的核苷酸序列(参见图48)；(u)SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列(参见图49)；(ν)或与SEQID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 29,SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 3USEQ ID No. 32,SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 35,SEQ ID No. 36,SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39,SEQ ID No. 40,SEQ ID No. 47,SEQ ID No. 48,SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 51 或 SEQ ID No. 52 中所示的任一序列具有 70%或更 高，优选为75%或更高同一性的核苷酸序列；或(χ)通过遗传密码的简并性而与 SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27,SEQ ID No. 28,SEQ ID No. 29,SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 3USEQ ID No. 32,SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 35,SEQ ID No. 36,SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39,SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 51 或 SEQ ID No. 52 所 示的任一序列相关的核酸。适合地，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27,SEQ ID No. 28,SEQ ID No. 29,SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 3USEQ ID No. 32,SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 35,SEQ ID No. 36,SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39,SEQ ID No. 40、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 50、SEQ IDNo. 51 或 SEQ ID No. 52 中所 示的任一序列具有80%或更高，优选为85%或更高，更优选为90%或更高，更优选为95% 或更高同一性。在一个实施方式中，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的 核苷酸序列为与 SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 35 和 SEQ ID No. 36中所示的任一序列具有70%或更高，优选为75%或更高同一性的核苷酸序列。适合 地，所述核苷酸序列可以与 SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 28, SEQ ID No. ；35 和 SEQ ID No. 36中所示的任一序列具有80%或更高，优选为85%或更高，更优选为90%或更 高，更优选为95%或更高同一性。在一个实施方式中，编码用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶的 核苷酸序列为与SEQ ID No.沈中所示的序列具有70%或更高，75%或更高，80%或更高，优 选为85%或更高，更优选为90%或更高，更优选为95%或更高同一性的核苷酸序列。适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以为包含一个或 多个以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶(i)SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列；(ii)SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列；(iii)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列；(iv) SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列；(V)SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列；15
(vi)SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列；(vii)SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列；(viii)SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列；(ix) SEQ ID No. 9所示的氨基酸序列；(X)SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列；(xi)SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列；(xii)SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列；(xiii)SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列；(xiv)SEQ ID No. 14所示的氨基酸序列；(XV)SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列；(xvi)SEQ ID No. 18所示的氨基酸序列；(xvii)SEQ ID No. 19所示的氨基酸序列；(xviii)SEQ ID No. 20所示的氨基酸序列；(xix)SEQ ID No. 21所示的氨基酸序列；(XX)SEQ ID No. 22所示的氨基酸序列；(xxi)SEQ ID No. 23所示的氨基酸序列；(xxii)SEQ ID No. M所示的氨基酸序列；(xxiii)SEQ ID No. 41所示的氨基酸序列；(xxiv)或与SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. IUSEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 20、SEQ ID No. 21、SEQ ID No. 22、SEQ ID No. 23、SEQ ID No. 24 或 SEQ ID No. 41 中所 示的任一序列具有75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高同一性的氨基酸序列。适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含如SEQ ID No. 37 或 SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 14 或 SEQ ID No. 15 或SEQ ID No. 19或SEQ ID No. 20所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID No. 37所示的氨 基酸序列或SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，或SEQ ID No. 14所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 15所示的氨基 酸序列或SEQ ID No. 19所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 20所示的氨基酸序列具有75%或 更高，优选为80%或更高，优选为85%或更高，优选为90%或更高，优选为95%或更高同一 性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含与SEQ ID No. 37、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 41、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13,SEQ ID No. USEQ ID No. 14,SEQ ID No. 15,SEQ ID No. 19 或 SEQ ID No. 20 中所示 的任一序列具有80%或更高，优选为85%或更高，更优选为90%或更高，更优选为95%或 更高的同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含一个或多个以下氨基酸序列的脂质酰基转移酶(a) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基1-100所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基101-200所示的氨基酸序列；(c) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基201-300所示的氨基酸序列；或(d)与以上(a)至(C)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75%或更高，优选 为85%或更高，更优选为90%或更高，更优选为95%或更高的同一性的氨基酸序列。适合地，用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以包含一个或多个以 下氨基酸序列(a) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基观_39所示的氨基酸序列；(b) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基77_88所示的氨基酸序列；(c)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基1沈_136所示的氨基酸序列；(d)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；(e) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或(f)以上(a)至(e)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75%或更高，优选为 85%或更高，更优选为90%或更高，更优选为95%或更高的同一性的氨基酸序列。一方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是如EP 1 275 711中教导的来自于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的脂质酰基转移酶的脂质 酰基转移酶。因此，一方面，用于本发明方法和应用中的脂质酰基转移酶可以为包含SEQ ID No. 42教导的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基 转移酶，其可以为包含SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列的脂质酰基转移 酶，或者包含与SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37具有75%或更高，优选为85%或更高，更优 选为90%或更高，更优选为95%或更高，更优选为98%或更高，或更优选为99%或更高的 同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。该酶可以认为是酶的变体。一方面，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是可以为卵磷脂: 胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(如由分子进化产生的变体)的脂质酰基转移酶。适合的LCAT为本领域已知的，且可以获自于一种或多种如下的生物，如哺 乳动物、大鼠、小鼠、鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物(包括拟南芥 (Arabidopsis)和水稻(Oryza sativa))、线虫、真菌和酵母。在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是这样 的脂质酰基转移酶，其可以是可获自于，优选获自于含有pPetUaAhydro和pPetUaAMlmo 的大肠杆菌株TOP 10的脂质酰基转移酶，其中所述大肠杆菌株TOP 10由Danisco A/S of Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K，Denmark根据国际承认用于专利程序的微 生物保藏布达佩斯条约保藏在 National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB，保藏日为 2003 年 12 月 22日，保藏号分别为NCIMB 41204和NCIMB 41205。用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是磷脂甘油酰基转移 酶。磷脂甘油酰基转移酶包括分离自气单孢菌，优选为嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌，最优 选为杀鲑气单胞菌或其变体的磷脂甘油酰基转移酶。
用于本发明的最优选脂质酰基转移酶由SEQ ID No. 1、3、4、14、19和20编码。本 领域技术人员可以理解，优选酰基转移酶的信号肽在转移酶的表达过程中已被切割掉。SEQ ID No. 1、3、4和14的信号肽为氨基酸1-18。因此，最优选的区域为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3 (嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335，和SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 14 (杀鲑气单胞 菌)中的氨基酸19-336。当用于测定氨基酸序列同一性的同源性时，优选使用成熟序列进 行本文所述的比对。因此，确定同源性(同一性)的最优选区域为SEQ ID No. 1和3 (嗜水气单胞菌) 中的氨基酸19-335，和SEQ ID No. 4和14 (杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。SEQ ID No. 19和20是来分别来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的成熟蛋白序 列，其可以经历或可以未经历翻译后修饰。用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是还可分离自喜热裂 孢菌(Thermobifida)，优选为褐色喜热裂孢菌(T. fusca)的脂质酰基转移酶，最优选为由 SEQ ID No. 43编码的脂质酰基转移酶。适合本发明应用和/或本发明方法的脂质酰基转移酶可以包含以下任一氨基酸 序列和/或由以下核苷酸序列编码a)核酸，其编码表现出脂质酰基转移酶活性和与SEQ ID No. 15所示的多肽序列或 与SEQ ID No. 37所示的多肽序列具有至少70%同一性(优选至少80%同一性，更优选至 少90%同一性)的多肽；b)(分离的)多肽，其包含SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列(或 由SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列组成)，或包含与SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37具有至少70%同一性(优选至少80%同一性，更优选至少90%同一性)的氨基 酸序列(或由与SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37具有至少70%同一性(优选至少80%同 一性，更优选至少90%同一性)的氨基酸序列组成)；；c)编码脂质酰基转移酶的核酸，所述核酸包含SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列 (或由SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列组成)，或包含与SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列 具有至少70%同一性(优选至少80%同一性，更优选至少90%同一性)的核苷酸序列(或 由与SEQ ID No. 26所示的核苷酸序列具有至少70%同一性(优选至少80%同一性，更优 选至少90%同一性)的核苷酸序列组成)；d)核酸，所述核酸在中等或高严谨条件下与包含SEQ ID No.沈所示核苷酸序列的 核酸探针杂交，且编码表现出脂质酰基转移酶活性的多肽；e)核酸，其是a)、C)或d)所述核酸序列的片段；或f)多肽，其是b)所述多肽的片段。用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是还可分离自链霉菌属，优 选为阿维链霉菌(S.avermitis)的脂质酰基转移酶，最优选是由SEQ ID No. 32编码的脂质 酰基转移酶。用于本发明的来自链霉菌的其它可能的酶包括由SEQ ID No.5、6、9、10、ll、 12、13、31、33和41编码的那些酶。用于本发明的酶也可以分离自棒状杆菌属(Corynebacterium)，优选为 C. efficiens，最优选由 SEQ ID No. 18 编码。适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是包含SEQ IDNo. 22、23、M、48、44、50或53所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、80%、 85^^90%,95^^96^^97%或98%同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或可以由SEQ ID No. 36、39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列所编码。在另一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可 以是包含SEQ ID No. 22、23、24、43、45、49或53所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移 酶，或由SEQ ID No.25、47、48、50或51所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列所编码。在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是 包含SEQ ID No. 23、M、45、49或53所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，以用于 本发明所述的应用。
在另一实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是 包含SEQ ID No. 23、45或53所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、80%、 85% ,90^^95% ,96^^97%或98%同一性的氨基酸序列脂质酰基转移酶，以用于本发明所 述的应用。更优选地，在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转 移酶可以是包含SEQ ID似.45所示的氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。在一个实施方式中，根据本发明的脂质酰基转移酶可以是可获自于，优选获自 于链霉菌株L130或L131的脂质酰基转移酶，所述链霉菌株L130或L131由Danisco A/ S of Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K, Denmark 根据国际承认用于专利程序的微 生物保藏布达佩斯条约保藏在 National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 23 St. Machar Street Aberdeen Scotland，GB，保藏日为 2004 年 6 月 25 日，保藏号分别为NCIMB 412 和NCMB 41227。适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶可以是可使用 Align X(使用默认设置的VectorNTI的Clustal W成对比对算法)通过与L131 (SEQ ID No. 22)序列的比对而鉴定的氨基酸序列。L131与来自阿维链霉菌(S. avermitilis)和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对说 明了 GD&基序(L131以及阿维链霉菌和褐色喜热裂孢菌中为GDSY) ,GANDY框(其为GGNDA 或GGNDL)和HPT区(被认为是保守的催化组氨酸)的保守性。这三个保守区突出标记在 图26中。与pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公开的L131 序列(SEQ ID No. 22)比对时，可以鉴定出三个保守区，GDSx区、GANDY区和HTP区(更多细 节请参见 W004/064987)。与pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公开的L131 序列(SEQ ID No. 22)比对时，i)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是具有GD&c基序，更优选为选自GDSL或GDSY基序的GD&c基序的脂质酰基转移酶；和/或ii)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是具有GANDY区，更优 选包含氨基GGNDx (更优选为GGNDA或GGNDL)的GANDY区的脂质酰基转移酶；和/或iii)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是优选具有HTP区的 脂质酰基转移酶；和优选地，iv)用于本发明任一方法和应用中的脂质酰基转移酶可以是优选具有GD&c或 ⑶SY基序，和包含氨基GGNDx (优选为GGNDA或GGNDL)的GANDY区，和HTP区(保守的组氨 酸)的脂质酰基转移酶。在一个实施方式中，本发明的酶可优选不是磷脂酶，如被归类为E. C. 3. 1. 1. 32的 磷脂酶Al或被归类为E. C. 3. 1. 1. 4的磷脂酶A2。优点本发明的一个优点是使用本发明的脂质酰基转移酶使基于肉的食品中的胆固醇 减少。本发明的另一个优点是降低基于肉的食品中的胆固醇，同时保持和/或改进一个 或多个以下特征脂肪稳定性，从而使脂肪损失最小化并减少基于肉的食品中的可见脂肪； 风味、质地、重量损失和外观。本发明的另一个优点是生产具有改进的脂肪稳定性(即减少可见脂肪和/或减少 油脂性和/或减少热加工期间的脂肪分离)和/或改进的质地和/或减少的重量损失的基 于肉的食品。本发明的另一个优点是所述方法使肉和/或基于肉的食品中的腐败菌、病原菌和 真菌在加工期间的增殖减少或保持在最低水平。本发明(例如使用具有大量脂肪含量，例如精膏香肠和肉酱)的另一个优点是提 高了脂肪稳定性，从而使脂肪损失最小化并减少可见脂肪的量。此外，可保持低的肉汁损失 和/或可接受的风味、质地和/或外观。脂质酰基转移酶将磷脂和/或甘油三酯和/或半乳糖脂的sn-2酯键转移到酰基 受体，例如胆固醇，从而分别形成溶血磷脂和/或甘油单酯和/或甘油二酯和/或溶血半乳 糖酯，和胆固醇酯(图67以磷脂酶为例证明了这一点)。转移酶导致释放出疏水性更小且 因此水溶性更高的溶血磷脂(底物为磷脂时)，该溶血磷脂由于在水相中的更高的单聚体 浓度，因此具有更高的动态表面活性。
除了其乳化性质之外，脂质酰基转移酶还能通过产生胆固醇酯降低肉中的胆固醇 水平(即使用胆固醇作为酰基受体，由此形成胆固醇酯并减少“游离”胆固醇的量)。在肉 产品的制备和长期贮存期间，多不饱和脂肪酸和胆固醇可发生氧化。这种氧化产生大量化 合物(氢过氧化物、醛、酮、胆固醇氧化物，例如氧化固醇等)，其中一些化合物被视为具有 诱变禾口致癌作用，禾口细胞毒性(Jim6nez-Colmenero et al2001 Wealthier meat and meat products :their role as functional foods. Meat science 59, 5-13)。因此，降低胆固酉享 是有利的，这是因为其潜在地降低了由胆固醇氧化而形成的潜在有害化合物。此外，由于所 述基于肉的食品可构成健康饮食中经常推荐的低胆固醇产品，可将其作为饮食的一部分使 用以减少胆固醇。20
本发明的另一个优点是其产生具有改进(提高)的热稳定性的肉或基于肉的食品。宿主细胞可在宿主细胞或生物内重组生产用于本发明的脂质酰基转移酶。所述宿主生物可以是原核或真核生物。在本发明的一个实施方式中，本发明的脂质酰基转移酶在宿主细胞中表达，例如 在细菌细胞中，例如在芽孢杆菌，例如在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主细 胞中表达。可选的宿主细胞例如是真菌、酵母或植物。已经发现与其它生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相比，使用地衣芽孢 杆菌宿主细胞可使脂质酰基转移酶的表达增加。已经将来自于杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的脂质酰基转移酶插入 到多个常规表达载体中，所述表达载体经设计分别最适宜在枯草芽孢杆菌、多型汉逊酵 母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)禾口塔宾曲霉 (Aspergillus tubigensis)中表达。然而，在多型汉逊酵母、粟酒裂殖酵母和塔宾曲霉中仅 检测到极低的水平。这些表达水平低于1 μ g/ml,因此不可能选择出产生足量蛋白以起始商 业生产的细胞(结果未显示)。相反，地衣芽孢杆菌能够产生对商业可行的生产具有吸引力 的蛋白水平。具体而言，已经发现地衣芽孢杆菌中的表达比在aprE启动子控制下的枯草 芽孢杆菌表达高约100倍，或比在A4启动子控制下并与纤维素融合时变铅青链霉菌 (S. Iividans)中的表达高约100倍(结果未显示在本文中)。所述宿主细胞可以为除枯草芽孢杆菌之外的任何芽孢杆菌细胞。优选 地，所述芽孢杆菌宿主细胞可以是以下物种中的一种地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢 杆菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)、环状芽孢杆 菌(B. circulans)、克劳氏芽孢杆菌(B. clausii)、凝结芽孢杆菌(B. coagulans)、 坚强芽孢杆菌(B. firmus)、灿烂芽孢杆菌(B. Iautus)、缓慢芽孢杆菌(B. Ientus)、 巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、短小芽孢杆菌(B. pumilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌 (B. stearothermophilus)0本发明涉及的术语“宿主细胞”包括具有以下特征的任何细胞包含本文所定义的 编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或本文所定义的表达载体，且用于重组制备具有如本文 所定义的特异性质的脂质酰基转移酶。适合地，所述宿主细胞可以是蛋白酶缺陷或蛋白酶阴性细胞株(protease minus strain)和/或α -淀粉酶缺陷或α-淀粉酶阴性细胞株(α-amylase minus strain)。本文所用的术语“异源”是指源自分离的遗传资源或物种的序列。异源序列是非 宿主序列、修饰的序列、来自不同宿主细胞株的序列、或来自宿主细胞的不同染色体位置的 同源序列。“同源”序列是指在相同遗传资源或物种中发现的序列，即其天然存在于宿主细胞 的相关物种中。本文所用的术语“重组脂质酰基转移酶”是指已经通过遗传重组的方式制备的脂质酰基转移酶。例如，将编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列插入克隆载体，得到以存在异源 脂质酰基转移酶为特征的地衣芽孢杆菌细胞。调控序列在一些应用中，可通过如下获得用于本发明方法和/或应用中的脂质酰基转移酶 序列将其核苷酸编码序列可操作地连接到能够通过例如所选宿主细胞(如地衣芽孢杆菌 细胞)提供核苷酸序列表达的调控序列。例如，可以使用包含可操作地连接到此调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即 所述载体是表达载体。术语“可操作地连接”是指并列放置(juxtaposition)，其中所述组件的关系允许 它们能以其希望的方式发挥功能。“可操作地连接”到编码序列的调控序列的连接方式使其 能在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其它表达调控信号。所用的术语“启动子”为本领域的一般含义，如RNA聚合酶结合位点。也可以通过选择调控区(如启动子、分泌引导子和终止子区)来实现编码具有如 本文所定义的特定性质的酶的核苷酸序列的增强表达，其中所述终止子区本质上不是编码 所述酶的核苷酸序列的调控区。适合地，可以将本发明的核苷酸序列至少可操作地连接到启动子。适合地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以可操作地连接编码终止子序列的 核苷酸序列。用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的适合的终止子序列的 实例包括α -淀粉酶终止子序列(例如，CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTT GTTCATAAA-SEQ ID No. 57)、碱性蛋白酶终止子序列(例如，CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTT TGCAATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA-SEQ ID No. 58)、谷氨酸特异性终止子序列(例如，A CGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATTGT-SEQ ID No. 59)、果 聚糖酶终止子序列(例如，TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT -SEQ ID No. 60)和枯草杆菌蛋白酶 E 终止子序列(如，GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAG GAACCTGCTTCTTTTTACTATTATTG-SEQ ID No. 61)。适合地，可以将编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可操作地连接到α -淀粉酶终 止子，如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶终止子。启动子根据本发明所用的启动子序列可以与编码脂质酰基转移酶的序列异源或同源。所述启动子序列可以是能够指导脂质酰基转移酶在所选宿主细胞中表达的任何 启动子序列。适合地，所述启动子序列可以与芽孢杆菌(如地衣芽孢杆菌)同源。优选地，所述 启动子序列与所选宿主细胞同源。适合地，所述启动子序列可以与宿主细胞同源。“与宿主细胞同源”是指来源于宿 主生物内；即，在宿主生物中自然发现的启动子序列。适合地，所述启动子序列可以选自由编码以下启动子的核苷酸序列组成的组 α-淀粉酶启动子、蛋白酶启动子、枯草杆菌蛋白酶启动子、谷氨酸特异性蛋白酶启动子和 果聚糖蔗糖酶启动子。
适合地，所述启动子序列可以是编码以下启动子的核苷酸序列LAT(如，来自地 衣芽孢杆菌的α -淀粉酶启动子，也称作AmyL)、AprL (如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg启动 子),EndoGluC (如，来自地衣芽孢杆菌的谷氨酸特异性启动子)、AmyQ (如，来自解淀粉芽孢 杆菌α-淀粉酶启动子的α-淀粉酶启动子)和&icB(如，枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶 启动子)。适合在本发明方法中指导核酸序列转录的启动子的其它实例包括缓慢芽孢杆菌 碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)的启动子、嗜热 脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)的 启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子、和/或苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种 (Bacillus thuringiensis subsp· tenebrionis)CryIIIA 基因的启动子。在优选的实施方式中，所述启动子序列为α-淀粉酶启动子(如地衣芽孢杆菌 α-淀粉酶启动子)。优选地，所述启动子序列包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子的-35 至"10序列(参见图53和图55)。所述“_35至-10序列”描述的是相对于转录起始位点的位置。“-35”和“-10”均 为框，即多个核苷酸，各包含6个核苷酸，且这些框被17个核苷酸分开。这17个核苷酸通 常被称为“间隔子”。图55对此进行了说明，其中-35框和-10框被加下划线。为了避免混 淆，本文所用的“_35至-10序列”是指从-35框的起点至-10框的终点的序列，即包括-35 框、长度为17个核苷酸的间隔子和-10框。信号月太根据所用的序列和/或载体，通过由宿主细胞表达编码脂质酰基转移酶的核苷酸 序列所产生的脂质酰基转移酶可以被分泌出或包含在细胞内。信号序列可以用于指导编码序列分泌通过特定的细胞膜。所述信号序列对脂质酰 基转移酶编码序列来说可以是天然的或外源的。例如，所述信号肽编码序列可以是从芽孢 杆菌，优选从地衣芽孢杆菌获得的淀粉酶或蛋白酶基因。可以由一种或多种以下基因获得适合的信号肽编码序列麦芽糖α-淀粉酶基 因、枯草杆菌蛋白酶基因、内酰胺酶基因、中性蛋白酶基因、PrsA基因和/或酰基转移酶 基因。优选地，所述信号肽为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽、气单孢菌酰基转移酶 的信号肽(如，mkkwfvcllglialtvqa-SEQ ID No. Μ)、枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号 肽(如，mrskklwi si If alt liftmafsnmsaqa-SEQ ID No. 55)或地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白 酶的信号肽(如，mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa-SEQ ID No. 56)。适合地，所述信号肽 可以为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽。然而，可以使用能够指导所表达的脂质酰基转移酶进入所选芽孢杆菌宿主细胞 (优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞)分泌途径的任何信号肽编码序列。在本发明的一些实施方式中，可以将编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接到编 码所选脂质酰基转移酶的核苷酸序列。所选脂质酰基转移酶可以在本文所定义的宿主细胞中作为融合蛋白表达。表达载体术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。
优选地，所述表达载体被引入到生物(如地衣芽孢杆菌宿主)的基因组中。术语 “引入”优选涵盖稳定的引入到基因组中。如本文所定义的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以存在于载体中，在该载体 中所述核苷酸序列可操作地连接到调控序列，使得所述调控序列能够通过适合的宿主生物 (如地衣芽孢杆菌)表达所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。本发明的载体可以被转化到上述的适合宿主细胞中，以表达具有如本文所定义的 脂质酰基转移酶活性的多肽。通常根据其将被引入的宿主细胞来选择载体，例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载 体、基因组插入物。本发明可以涵盖发挥等同功能且本领域已知或可知的其它形式的表达 载体。一旦转化到所选择的宿主细胞中，载体可以不依赖宿主细胞的基因组而复制并发 挥功能，或可以自行整合进入基因组。所述载体可以包含一个或多个选择性标记基因，如提供抗生素抗性的基因，如提 供氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。或者，也可以通过共 转化完成选择(如W091/17243中所述)。载体可以在体外使用，例如，用于制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。所述载体可以进一步包含能使该载体在所述宿主细胞中复制的核苷酸序列。所述 序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702的复制起点。脂质酰基转移酶变体在一个实施方式中，用于本发明任一方法和/或应用的编码脂质酰基转移酶的核 苷酸序列或脂质酰基转移酶可编码脂质酰基转移酶变体或者是脂质酰基转移酶变体。可使用对磷脂活性提高，例如对磷脂的转移酶活性提高的变体。W02005/066347 (其通过引用并入本文)教导了用于改进脂质酰基转移酶以产生 脂质酰基转移酶变体的适合方法。一个优选的修饰是N80D。特别地，当使用序列SEQ ID No. 20作为骨架时更是如 此。因此，参考序列可以为SEQ ID No. 15或SEQ ID No. 37。所述修饰可以与一个或多个其 它修饰组合。如上指出，当在本文中提及具体氨基酸残基时，其编号是通过变体序列与SEQ ID No. 19或SEQ ID No. 20所示的参考序列的比对获得的。优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列 可以编码包含SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列的脂质， 或包含与SEQ ID No. 16或SEQ ID No. 68具有70%或更高、75%或更高，优选为85%或更 高，更优选为90 %或更高，更优选为95 %或更高，更优选为98 %或更高，或更优选为99 %或 更高同一性的氨基酸序列的脂质。该酶可以认为是酶变体。定义本文使用的术语“转移酶”可以与术语“脂质酰基转移酶”互换。适合地，本文定义的脂质酰基转移酶催化以下一种或多种反应酯交换、酯基转 移、醇解、水解。术语“酯交换”表示酰基基团在脂质供体和脂质受体之间的酶催化转移，其中所述24脂质供体不是游离的酰基基团。本文使用的术语“酯基转移”表示酰基基团从脂质供体(除游离脂肪酸外)向酰 基受体(除水外)的酶催化转移。用于本发明任一方法和/或应用中的脂质酰基转移酶是 优选在脂质(优选磷脂)和固醇(优选胆固醇)之间进行酯交换反应的脂质酰基转移酶。本文使用的术语“醇解”表示通过与醇ROH的反应对酸衍生物的共价键的酶切割， 从而使一个产物与醇的H结合，另一个产物与醇的OR基团结合。本文使用的术语“水解”表示酰基基团从脂质向水分子的OH基团的酶催化转移。与其他酶的组合在一个优选的实施方式中，所述脂质酰基转移酶与具有一种或多种以下酶活性的 脂肪酶组合使用甘油脂酶活性(E.C. 3. 1.1. 26)、磷脂酶A2活性(E. C. 3.1.1.4)或磷脂 酶Al活性(E. C. 3. 1. 1. 32)。适合地，脂肪酶是本领域熟知的，举例而言，包括下列用举例 方式说明的脂肪酶磷脂酶Al LECITASE ULTRA(Novozymes A/S，丹麦)、磷脂酶A2 (例如 来自 Biocatalysts 的 LIP0M0D 22L 的磷酯酶 A2，来自 Genecor 的 LIP0MAX 和 LysoMax PLA2 )、LIPOLASE (Novozymes A/S,丹麦)。在一些实施方式中，组合使用脂质酰基转移酶和磷脂酶(例如磷脂酶Al、磷脂酶 A2、磷脂酶B、磷脂酶C和/或磷脂酶D)也可能是有益的。所述组合使用可以依次或同时进行，例如脂质酰基转移酶处理可以在所述额外酶 处理前或者处理过程中进行。或者，所述额外酶处理也可以在脂质酰基转移酶处理之前或处理过程中进行。在依次酶处理的情况下，在一些实施方式中，在利用第二个(和/或第三个等)酶 处理前，例如通过失活或者通过使用固定化酶除去所使用的第一个酶可能是有利的。转录后和翻译后修饰适合地，本发明的脂质酰基转移酶可以由本文公开的任一个核苷酸序列编码。根据所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。设想用于本发明方 法和/或应用的脂质酰基转移酶包括已经经历转录后和/或翻译后修饰的脂质酰基转移 酶。仅作为举例而言，本文SEQ ID No. 26 (参见图39)所示的核苷酸序列在宿主细 胞(例如地衣芽孢杆菌)中的表达引起转录后和/或翻译后修饰，从而产生本文SEQ ID No. 37 (参见图50)所示的氨基酸序列。SEQ ID No. 37 与 SEQ ID No. 15 (本文图 1 所示)相同，只是 SEQ ID No. 37 已经历 了翻译后和/或转录后修饰从而除去了 38个氨基酸。分离的一方面，所述脂质酰基转移酶是回收的/分离的脂质酰基转移酶。因此，所制备的 脂质酰基转移酶可以是分离的形式。另一方面，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是分离的形式。术语“分离的(或分离)”是指序列或蛋白至少基本不包含至少一种其它成分，这 些成分原本与所述序列或蛋白天然结合，并且原本在一起发现。纯化的一方面，所述脂质酰基转移酶可以是纯化的形式。
另一方面，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以是纯化的形式。术语“纯化的”是指序列处于相对纯的状态，如至少约51%纯，或至少约75%纯， 或至少约80%纯，或至少约90%纯，或至少约95%纯，或至少约98%纯。克隆编码本发明多肽的核苷酸序列编码具有如本文所定义的特定性质的多肽或适合修饰的多肽的核苷酸序列可以 从产生所述多肽的任何细胞或生物中分离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领 域熟知的。例如，可以使用产生所述多肽的生物的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA 和/或cDNA文库。如果所述多肽的氨基酸序列是已知的，可以合成经标记的寡核苷酸探针， 并将其用于从由该生物制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。或者，也可以使用包含 与另一已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种 情况下，使用严谨性较低的杂交和清洗条件。或者，可以通过如下方式鉴定编码多肽的克隆将基因组DNA的片段插入到表达 载体(如质粒)中，使用所得的基因组DNA文库转化酶为阴性的细菌，并随后将转化的细菌 涂布在包含被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此可以鉴定出表达所述多肽的克隆。再者，也可以通过建立的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列， 如 Beucage S. L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22，ρ 1859-1869 描述的亚磷酰胺法， 或Matthes et al (1984) EMBO J. 3, ρ 801-805描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA 合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和cDNA来源、 或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或cDNA的片 段(根据需要)而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序 列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US 4，683，202或Miki R K et al (Science (1988) 239，pp 487-491)中所述。核苷酸序列本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。本文所用 的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物 (如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成物或重组物，其可以是双链的或单 链的(无论其代表正义链还是反义链)。本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地， 其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。在优选的实施方式中，编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列本 身不涵盖在其天然环境中存在的天然核苷酸序列，此时该序列与同处于其天然环境中其天 然结合序列相连接。为了便于参考，我们将此优选实施方式称为“非天然核苷酸序列”。由 此，术语“天然核苷酸序列”是指与处于其天然环境中并与其天然结合的完整启动子(同处 于其天然环境中)可操作地连接的完整核苷酸序列。因此，可以利用核苷酸序列在其天然 生物中表达本发明的多肽，但是其中所述核苷酸序列不受所述生物中与其天然结合的启动 子的控制。优选地，所述多肽不是天然多肽。由此，术语“天然多肽”是指处于其天然环境中并已经由其天然核苷酸序列表达的完整多肽。通常，使用重组DNA技术(即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质 的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的另一个可选实施方式中，可以使用本领域已知的 化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(参见Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 和 Horn T et al(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225—232)。分子进化分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码假定酶的核苷酸序列后，可能需要对所 选择的核苷酸序列进行修饰，例如可能需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含目标突变位点侧翼的核 苷酸序列。Morinaga et al.，(Biotechnology (1984) 2，p646_649)中公开了 适合的方法。 Nelson 和 Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, ρ 147-151)中描述了向编码酶的 核苷酸序列中弓丨入突变的另一种方法。除了如上文所述的定点诱变，可以随机引入突变，如使用商品试剂盒，如来自 Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的DiversifyPCR随机诱变试 剂盒。EP O 583 265提到基于PCR的诱变的优化方法，其也可以结合使用DNA突变类似物， 如EP O 866 796中所述的那些。易错PCR技术也适用于制备具有优选性质的脂质酰基转 移酶变体。W00206457提到了脂肪酶的分子进化。获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如Dnase I的酶将不 同的核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使 用一个或多个不同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列时引入突变。DNA改组 (shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。适合进 行“改组”的方法可以参见EPO 752 008、EPl 138 763、EPl 103 606。改组也可以与如US 6，180，406和WO 01/34835中所述的其它形式的DNA诱变相结合。因此，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变，并随 后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析(in silico) 和核酸外切酶介导(exo-mediated)的重组方法(参见WO 00/58517、US 6, 344, 328, US 6，361，974)进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白的很低的同源性。由 此获得的所述变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性，但却具有很低的氨基酸序列 同源性。此外，如在非限定性实例中，多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型 或其它突变体或天然变体重组以生产新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得 到改进的编码多肽。应用以上以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有 知识的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶变体，并能够产生不可预测的但有益 的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多，所述实例 包括但不限于以下的一种或多种优化在宿主细胞或体外的表达和/或活性、增加酶活性、 改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如 温度、PH、底物)中酶的活性/特异性。
使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性，这对于本领域的技术人员来 说是显而易见的。适合地，用于本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂质酰基转移 酶变体，即当与亲本酶比较时，所述脂质酰基转移酶可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失 或添加。变体酶与亲本酶保持至少1%、2%、3%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、 60%,70^^80%,90^^95%,97^^99%的同源性。适合的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪 酶活性的任何酶。优选地，亲本酶与pfam00657共有序列相比对。
在优选的实施方式中，脂质酰基转移酶变体保留或加入了在GD&uGANDY和HPT区 中发现的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。可以使用分子进化工具使酶(如在含水环境中没有或具有低脂质酰基转移酶活 性的脂肪酶)突变，以引入或增强转移酶活性，由此生产适合用于本发明的组合物和方法 的具有显著转移酶活性的脂质酰基转移酶。适合地，用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列 可以编码脂质酰基转移酶变体，与亲本酶相比，该变体对极性脂质(优选为磷脂和/或糖 脂)具有增强的酶活性。优选地，所述变体还可以对溶血极性脂质(lyso polar lipid)具 有低活性或无活性。对极性脂质、磷脂和/或糖脂的活性增强可能是由于水解和/或转移 酶活性或二者组合的结果。与亲本酶相比，所述脂质酰基转移酶变体可以对甘油三酯和/或甘油单酯和/或 甘油二酯具有降低的活性。适合地，所述酶变体可以没有对甘油三酯、和/或甘油单酯和/或甘油二酯的活 性。或者，所述酶变体可以具有提高的热稳定性。所述酶变体可以对以下的一种或多种具有提高的活性极性脂质、磷脂、卵磷脂、 磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油单酯、单半乳糖基甘油单酯。脂质酰基转移酶变体是已知的，且一种或多种所述变体可以适用于本发明的方法 和应用，和/或本发明的酶组合物。仅举例来说，根据本发明可以使用以下文献中阐述的 脂质酰基转移酶变体Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15 :266(2) :997-1000; Robertson et al. , J.Biol. Chem. 1994 Jan 21 ；269 (3) :2146-50 ；Brumlik et al., J.Bacteriol 1996 Apr ； 178 (7) :2060-4 ；Peelman et al.，Protein Sci. 1998 Mar ；7 (3) 587-99。氨基酸序列本发明还涵盖由用于本发明任一方法和/或应用中的编码脂质酰基转移酶的核 苷酸序列所编码的氨基酸序列。本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些 实例中，术语“氨基酸序列，，与术语“肽”同义。所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可 以使用重组DNA技术制备。适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下28
可以将纯化的多肽冻干，并将100 μ g的冻干原料溶解于8M尿素和0. 4M碳酸氢铵 (pH 8.4)的50 μ 1混合物中。在覆盖氮气并加入5μ1 45mM 二硫苏糖醇后，可以将溶解的 蛋白在50°C变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以加入5μ 1 IOOmM碘乙酰胺，从而使半 胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生15分钟。可以向以上反应混合物中加入1；35 μ 1水和含5 μ g内切蛋白酶Lys_C的5 μ 1 /K 溶液，并在37°C氮气保护下消化M小时。可以使用溶剂A (0. 1% TFA的水溶液)和溶剂B(0. 1% TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18 柱(0. 46x15cm ；10 μ m ；The Separation Group, California, USA)上通过反相 HPLC 分 离所得到的肽。在N-末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选 择的肽进行重新层析。可以使用Applied Biosystems 476A测序仪，根据生产商的说明书 (Applied Biosystems，California，USA)使用脉冲液态快速循环来完成测序。序列同一性或序列同源性在此，术语“同源物”是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的 实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列可以提供和/或编码保留所述酶的功能活 性和/或增强所述酶的活性的多肽。在本文中，认为同源序列包括可以与目标序列有至少75^^85%或90%同一性， 优选为至少95%或98%同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同 的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功 能)，但是在本发明的内容中，优选同源性表达序列的同一性。在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(目标序列) 有至少75 %、85 %或90 %同一性的核苷酸序列，优选为至少95 %或98 %同一性的核苷酸序 列。通常，同源物将包括与目标序列相同的活性位点编码序列等。虽然同源性也可以被视 为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选同源 性表达序列的同一性。可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行 同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。可以在连续的序列中计算同源性％，即一个序列与其它序列比对，且将一个序列 中的每个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接比较，每次比较一个残基。这被称为“无缺 口”比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。虽然这是非常简单且稳定的方法，但是其未能考虑到如在其它方面相同的成对序 列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可能导致在进行整体比对 时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺 失而不过度地惩罚整体同源性得分的最佳比对。这可以通过在比对序列中插入“缺口”以 试图使局部同源性最大化而实现。然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于 相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相 关性)将比具有更多缺口的序列比对具有更高的得分。通常使用“仿射缺口罚分”(Affine gap cost)，即对缺口的存在处以较高罚分，而对缺口中的每个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将无疑产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对 程序允许修正缺口罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。因此，最大同源性％的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适 合用于进行所述比对的计算机程序为Vector NTI (Invitrogen Corp.)。可以进行序 列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed, Chapter 18)和FASTA(Altschul 等 1990 J. Mol. Biol. 403-410)。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等1999，7-58 页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用Vector NTI程序。也可以将称为BLAST 2 Sequences的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2) :247-50 ；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1) 187-8 和 tatiana@ncbi.nlm.nih. gov)。虽然可以根据同一性来测定最终的同源性％，但是比对方法本身通常不是基于 全是或全非的成对比较。作为代替，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarity score matrix)，基于化学相似性或进化距离对每对比较评分。通常所用的此矩阵的实例为 BL0SUM62矩阵(BLAST程序套的默认矩阵)。Vector NTI程序通常使用公开的默认值，或者 也可能使用所提供的自定义符号比较表(详见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI软件包的默认值。或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988), Gene 73(1)， 237-244)类似的算法的Vector NTI (Invitrogen Corp.)中的多重比对特征来计算同源性％。一旦软件生成了最佳比对，就可以计算同源性％，优选为序列同一性％。软件通常 将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。如果在测定序列同一性时使用缺口罚分，随后优选使用以下参数进行成对比对BLAST缺口开口0缺口延伸0CLUSTALDNA蛋白字长(WORD21K三联体SIZE)缺口罚分1510缺口延伸6.660.1 在一个实施方式中，优选使用具有以上定义的缺口罚分和缺口延伸设定的 CLUSTAL来测定核苷酸序列的序列同一性。
适合地，在至少20个连续的核苷酸中，优选为在至少30个连续的核苷酸中，优选 为在至少40个连续的核苷酸中，优选为在至少50个连续的核苷酸中，优选为在至少60个 连续的核苷酸中，优选为在至少100连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。适合地，在全序列中测定核苷酸序列中的同一性程度。在一个实施方式中，本发明氨基酸序列的同一性程度可以通过本领域已知的计算 机程序的方法，如Vector NTI 10 (Invitrogen Corp.)来适当地测定。对于成对比对，所用 的矩阵优选为缺口开口罚分为10. 0且缺口延伸罚分为0. 1的BL0SUM62。适合地，在至少20个连续的氨基酸中，优选为在至少30个连续的氨基酸中，优选 为在至少40个连续的氨基酸中，优选为在至少50个连续的氨基酸中，优选为在至少60个 连续的氨基酸中测定氨基酸序列的同一性程度。适合地，在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入 或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来 进行谨慎的氨基酸取代，只要该物质的次要结合活性被保持即可。例如，带负电荷的氨基酸 包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不 带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、 谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选为在第三 列中相同行中的氨基酸可以相互取代脂肪族非极性G、A、PI、L、V极性-不带电荷C、 S、 Τ、 MN、Q极性-带电荷D、EK、R芳香族H、F、W、Y本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残 基与可选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、酸性氨基酸取代酸性 氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类 残基，或涉及非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正 亮氨酸鸟氨酸(下文称为0)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。也可以使用非天然氨基酸进行替换。氨基酸变体序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间 隔子基团，除氨基酸间隔子如甘氨酸或丙氨酸残基外，还包括烷基基团如甲基、乙基或 丙基基团。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异，其涉及以类肽(p^toid)形式 存在的一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，“类肽形式”用来指α-碳取代基基团在残31基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已 知的，如 Simon RJ 等，PNAS (1992) 89 (20)，9367-9371 和 Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995)13(4)，132-134。本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其 内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些 修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或 多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所 述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸 序列的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其它生物等中相同的 编码序列。可以以多种方式获得与本发明的序列并非100%同源但却落入本发明范围中的多 核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获 得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物，特别是在哺乳 动物细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中发现的细胞同源物，且所述同源物或其片段 将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其它动物物种制备 的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任何一 个序列的全部或部分的探针探测所述文库来获得所述序列。类似的考虑用于获得本发明多 肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR将使用设计 为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。例如可以通过比对来 自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进 行序列比对。例如广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严谨性可低 于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件。或者，也可以通过已表征序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默 密码序列的改变，从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时，这可能 是有用的。可能需要其它序列改变，以引入限制性多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的 多肽的性质或功能。可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)制备引物，如PCR引物，用于可选扩增 反应的引物；探针，如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显色标记物标记的探 针；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段的长度可以是至少15个， 优选为至少20个、如至少25个、30个或40个核苷酸，且其也涵盖在如本文所用的术语多核 苷酸之内。可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多 核苷酸(如DNA多核苷酸)和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制 备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。通常使用重组方法，如使用PCR (聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约15至30个核 苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下 进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收 扩增的DNA。可以设计引入使其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆 到适合的克隆载体中。杂交本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列，或能够与本发明的序列杂交或与其互 补序列杂交的序列的应用。本文所用的术语“杂交”包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以 及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。本发明还涵盖所述核苷酸序列的应用，所述核苷酸序列能够和与本文所讨论的目 标序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交。本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel (1987， Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)中所教导，且给出了如下文所解释的定义的“严谨性”。最高严谨性通常出现在约(Tm-5)。C (比探针的Tm低5°C )；高严谨性在比Tm以 下约5°C至10°C ；中等严谨性在Tm以下约10°C至20°C ；且低严谨性出现在Tm以下约20°C 至25°C。如本领域技术人员的理解，最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序 列，而中等(或低)严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文 定义的特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列的互补序列的应用。更优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65°C和0. IxSSC{lxSSC = 0. 15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序 列发生杂交的序列的互补序列的应用。本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补 序列)杂交的核苷酸序列的应用。本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补 序列)杂交的序列的互补核苷酸序列的应用。本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨性条件下与本文所讨论的核苷酸序 列杂交的多核苷酸序列的应用。在优选的方面，本发明涵盖能够在严谨性条件(如50°C和0. 2xSSC)下与本文所讨 论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。在更优选的方面，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65°C和0. IxSSC)下与本文 所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。多肽的表达可以将用于本发明的核苷酸序列或用于编码具有如本文所定义的特定性质的多 肽的核苷酸序列引入重组的复制型载体中。载体可以用于在相容的宿主细胞中和/或从相 容的宿主细胞复制并以多肽形式表达所述核苷酸序列。可以使用包控制序列来控制表达，33所述控制序列包括含启动子/增强子和其它表达调控信号。可以使用原核生物的启动子和 在真核细胞中有功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激特异性启动子。也可以使用包 含来自上述两个或更多不同启动子的序列元件的嵌合启动子。根据所用的序列和/或载体，通过由宿主重组细胞表达核苷酸序列而产生的多肽 可以被分泌，或被包含在细胞内。编码序列经设计可以具有信号序列，该信号序列指导编码 序列物质分泌通过特定的原核生物或真核细胞膜。构建体术语“构建体”，与术语如“结合物(或连接物)”、“盒(cassette)”和“杂合体 (hybrid)，，同义，其包含依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷 酸序列，且其直接或间接地与启动子连接。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸 序列之间提供适合的间隔子基团，如内含子序列，如Sil内含子或ADH内含子。本发明中的 相关术语“融合”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，这些术语不涵盖编码 所述蛋白的核苷酸序列与其通常连接的野生型基因启动子的天然组合(此时这两者均处 于其天然环境中)。所述构建体甚至可以包含或表达允许选择基因构建体的标记物。对于一些应用，优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列，或编码具有如本文定 义的特定性质的多肽且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。生物与本发明有关的术语“生物”包括可包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文 定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何生物。与本发明有关的术语“转基因生物”包括任何包含编码具有如本文定义的特定性 质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的生物，和/或其中启动子能够允许编码具 有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列在所述生物内表达。优选核苷酸序列被引入 到生物的基因组中。术语“转基因生物”不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然 环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。因此，本发明的转基因生物包括包含以下任何一种或组合的生物编码具有如本 文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的 质粒、本文定的细胞或其产物。例如，所述转基因生物还可以包含编码具有如本文定义的特 定性质的多肽且受到启动子控制的核苷酸序列，其中所述启动子原本并不与脂质酰基转移 酶编码基因相连。宿主细胞/生物的转化所述宿主微生物可以是原核或真核生物。合适的原核宿主的实例包括细菌，例如大肠杆菌和地衣芽孢杆菌，优选地衣芽孢 杆菌。原核宿主的转化的教导在本领域中有详细的记载，例如参见Sambrook等 (Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd edition,1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主，则在转化前需要适当地修饰核苷酸序列，例如去 除内含子。
在另一个实施方式中，所示转基因生物可以为酵母。可以利用本领域已知的多种方法转化丝状真菌，例如包括原生质体形成和原生质 体转化，然后以已知的方式重建细胞壁的方法。在EP 0 238 023中公开了曲霉作为宿主微 生物的应用。另一种宿主生物可以为植物。用于转化植物的常用技术的概述可见 于 Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol[1991]42 :205-225)禾口 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。关于植物转化的其 它教导可见于EP-A-0449375。以下部分为关于真菌、酵母和植物转化的一般教导。转化的真菌宿主生物可以为真菌，例如丝状真菌。此类宿主的合适实例包括属于嗜热菌 属(Thermomyces)、枝顶抱属(Acremonium)、曲霉属、青霉属(Penicillium)、毛霉菌属 (Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)和木霉属(Trichoderma)等的任何成员。关于转化丝状真菌教导的概述见于US-A-5741665，其中声称用于丝状真菌转化以 及真菌培养的标准技术是本领域所熟知的。应用于链孢霉(N.crassa)的技术的研究进展 见于，例如 Davis and de Serres，Methods Enzymol (1971) 17A :79_143。关于丝状真菌的进一步教导的概述见于US-A-5674707。一方面，所述宿主生物可以为曲霉属，例如黑曲霉。本发明的转基因曲霉属还可以通过以下制备，例如Turner G. 1994(Vectors for genetic manipulation. In :Martinelli S.D. , Kinghorn J.R. (Editors)Aspergillus :50 years on.Progress in industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666)的教导。丝状真菌的基因表达的综述见于Punt等.Q002) Trends Biotechnol 2002 May ； 20(5) :200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997) 17(4) :273_306。转化的酵母在另一个实施方式中，所示转基因生物可以为酵母。酵母中异源基因表达的原则的综述见于，例如Methods MoI Biol (1995),49 341-54，and Curr Opin Biotechnol(1997) Oct ；8 (5) :554_60。在这一点上，酵母，例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见 FEMS Microbiol Rev(2000 24(1) :45-66)可用作异源基因表达的载体。在酿酒酵母中的异源基因表达和基因产物的分泌的原则的综述见于E Hinchcliffe E Kenny (1993， “ Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes“ ，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic Press Ltd.)0对于酵母的转染，已经开发出了多个转染方法。例如，本发明的转基因酵母可以根 据以下教导制备Hinnen等，(1978,Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929) ；BeggsiJ D (1978，Nature，London，275，104)；和 Ito，H et a/(1983， J Bacteriology 153，163-168)。可以利用各种筛选标记物筛选转化的酵母细胞，例如营养缺陷型标记物、显性抗35生素抗性标记物。合适的酵母宿主生物可以选自在生物技术上相关的酵母种，例如但不限于选自毕 赤酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowinia)、酵母菌(包括酿 酒酵母)或裂殖酵母菌(包括粟酒裂殖酵母)的酵母种。甲醇营养型酵母种的菌株巴斯德毕赤酵母可以用作宿主生物。在一个实施方式中，所述宿主生物可以为汉逊酵母种，例如汉森酵母 (H. polymorpha)(如 W001/39M4 中的阐述)。转化的植物/植物细胞适合用于本发明的宿主生物可以为植物。常用技术的综述可见于以下文 献Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mo/β/o/[1991] 42 :205-225)禾口 Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 199417-27)，或者 WO 01/16308。转 基因植物可以产生，例如水平提高的植物固醇酯和植物留烷醇酯。因此，本发明还涉及产生具有增强水平的植物固醇酯和植物留烷醇酯的转基因植 物的方法，其包括以下步骤利用本文定义的脂质酰基转移酶(尤其是利用包含本文定义 的脂质酰基转移酶的表达载体或构建体)转化植物细胞，和由转化的植物细胞培养出植 物。分泌通常，期望表达宿主将多肽分泌到培养基中，由此可以更容易地回收酶。根据本发 明，可以基于所需的表达宿主来选择分泌前导序列。本发明中也可以使用杂合信号序列。原本不与编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列连接的分泌前导序列的典型实例为 那些源于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-18个氨基酸和M个氨基酸两种形式，如来 自曲霉菌属)、a-因子基因(酵母，如酵母属、克鲁维酵母和汉逊酵母)或α-淀粉酶基因 (芽孢杆菌)的序列。检测本领域已知多种用于检测和测定氨基酸序列表达的操作方法。实例包括酶联免疫 吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。本领域技术人员已知多种标记物和结合技术，并可以将其用于各种核酸和氨基酸 分析。许多公司如 Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)、Promega(Madison, WI)禾口 US Biochemical Corp (Cleveland, OH)为这些方法提供商业试剂盒和操作说明。适合的报告分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显 色剂，以及底物、辅助因子、抑制剂和磁性粒子等。教导这些标记物应用的专利包括 US-A-3, 817，837、US-A-3, 850，752、US-A-3, 939，350、US-A-3, 996，345、US-A-4, 277，437、 US-A-4, 275，149 和 US-A-4, 366，241。此外，可以如US-A-4，816，567中所示制备重组免疫球蛋白。融合蛋白用于本发明的脂质酰基转移酶可以作为融合蛋白制备，例如以便有助于其提取和 纯化。融合蛋白配偶体(partner)的实例包括谷胱甘肽_S_转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA 结合和/或转录激活结构域)和半乳糖苷酶。也可以方便地在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以去除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白将不会妨碍 蛋白序列的活性。Curr. Opin. Biotechnol. (1995)6(5) :501-6已经对大肠杆菌中的基因融合表达 系统进行了综述。具有如本文定义的特定性质的多肽的氨基酸序列可以与非天然序列连接以编码 融合蛋白。例如，对于为获得能够影响物质活性的试剂而进行的肽库筛选，其可用于编码表 达可被商购抗体所识别的非天然表位的嵌合体。下文将参照以下附图和实施例，仅以举例的方式描述本发明。


图1显示了突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，该突 变体具有Asn80Asp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)(SEQ ID No. 15)；图2显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC #7965)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列 (SEQ ID No. 1)；图3显示了来自第6版数据库的pfam00657共有序列(SEQ ID No. 2)；图4显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No. 3) (P10480 ；GI 121051)；图5显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No. 4) (AAG098404 ； GI :9964017)；图6显示了从生物天蓝色链霉菌A3⑵获得的氨基酸序列(SEQ ID No. 5) (Genbank 登录号 NP_631558)；图7显示了从生物天蓝色链霉菌A3⑵获得的氨基酸序列(SEQ ID No. 6) (Genbank 登录号 CAC42140)；图8显示了从生物酿酒酵母获得的氨基酸序列(SEQ ID No. 7) (Genbank登录号 P41734)；图9显示了从生物雷尔氏菌属获得的氨基酸序列(SEQ ID No. 8) (Genbank登录号 AL646052)；图 10 显示了 SEQ ID No. 9。Scoel NCBI 蛋白登录号 CAB39707. 1 GI :4539178 的 保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3 O)]；图11显示了如SEQ ID No. 10所示的氨基酸。koe2 NCBI蛋白登录号CACO1477. 1 GI =9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3 (2)]；图 12 显示了氨基酸序列(SEQ ID No. 11)。Scoe4 NCBI 蛋白登录号 CAB89450. 1 GI =7672261的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3 O)]；图 13 显示了氨基酸序列(SEQ ID No. 12)。Scoe5 NCBI 蛋白登录号 CAB62724. 1 GI =6562793的推定的脂蛋白[天蓝色链霉菌A3 O)]；图 14 显示了氨基酸序列(SEQ ID No. 13)。Sriml NCBI 蛋白登录号 AAK84028. 1 GI =15082088的GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；图15显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida) (ATCC#14174)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 14)；
图16显示了核苷酸序列(SEQ ID No. 16)，其编码来自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的包含木聚糖酶信号肽的酶；图17显示了用于突变嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的融合构建体的氨基酸 序列(SEQ ID No. 17)。带下划线的氨基酸是木聚糖酶信号肽；图18显示了来自Corynebacterium efficiens GDSx 300个氨基酸的脂质酰基转 移酶多肽(SEQ ID No. 18)；图19显示了从生物嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列(SEQ ID No. 19) (P10480 ； GI :121051)(注意，这是成熟序列)；图20显示了杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列(SEQ ID No. 20)(注意，这是成熟序列)；图 21 显示了来自 Sti^ptomyces thermosacchari 的核苷酸序歹Ij (SEQ ID No. 21)；图 22 显示了来自 Sti^ptomyces thermosacchari 的氨基酸序歹Ij (SEQ ID No. 22)；图23显示了来自褐色喜热裂孢菌/⑶548个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID No. 23)；图M显示了来自Corynebacterium eff iciens/GDSx 300个氨基酸的氨基酸序列 (SEQ ID No. 24)；图 25 显示了来自 Corynebacterium efficiens 的核苷酸序列(SEQ ID No. 25)；图沈显示了 L131与来自阿维链霉菌和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对，说明了 GD&c基序(在L131以及阿维链霉菌和褐色喜热裂孢菌中均为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA 或GGNDL)和HPT区(被认为是保守的催化组氨酸)的保守性。这三个保守部分均被突出 标记；图27显示了活性位点中具有甘油的1IVN. PDB晶体结构的带状显示图。此图使用 Deep View Swiss-PDB 观测器制作。图观显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的侧视图(使用De印View Swiss-PDB观测器制作)，黑色部分为活性位点甘油10 A以内的残基。图四显示了活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的俯视图(使用De印View Swiss-PDB观测器制作)，黑色部分为活性位点甘油10 A以内的残基。图30显示了比对1;图31显示了比对2;图32和33显示了 IIVN与P10480的比对(P10480为嗜水气单胞菌酶数据库序 列)，此比对从PFAM数据库获得并用在模型构建过程中；图34显示了其中P10480为嗜水气单胞菌数据库序列的比对。此序列用于模型构 建和位点选择。注意绘制出了完整的蛋白(SEQ ID No. 3)，成熟蛋白(等价于SEQ ID No. 19) 起始于第19位残基。A. sal为杀鲑气单胞菌的⑶SX脂肪酶(SEQ ID No. 4)，A. hyd为嗜水 气单胞菌的GDSX脂肪酶(SEQ ID No. 19)。所列序列间的差异位置在共有序列中用*表示。图35显示了在实施例1中使用的基因构建体；图36显示了在实施例1中使用的密码子优化的基因构建体(no. 052907)；和图37显示了包含LAT-KLM3’前体基因的BioI插入物的序列，下划线处为-35框 和-10框；
图38显示了在三丁酸甘油酯琼脂上于37 °C生长48小时后的 BML780-KLM3，CAP50 (包含SEQ ID No. 15-上面的菌落)和BML780 (空宿主菌株-下面的 菌落)。图39显示了来自杀鲑气单胞菌的包含信号序列(preLAT-从第1位至第87位) 的核苷酸序列(SEQ ID No. 26)；图40显示了从生物嗜水气单胞菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸 序列(SEQ ID No. 27)；图41显示了从生物杀鲑气单胞菌获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸 序列(SEQ ID No. 28)；图42显示了从雷尔氏菌生物获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列 (SEQ ID No. 29)；图43显示了如SEQ ID No. 30所示的核苷酸序列，其编码NCBI蛋白登录号 CAB39707. 1 GI :4539178的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3 (2)]；图44显示了如SEQ ID No. 31所示的核苷酸序列，其编码koe2，NCBI蛋白登录号 CACO1477. 1 GI :9716139的保守的假定蛋白[天蓝色链霉菌A3 (2)]；图45显示了如SEQ ID No. 32所示的核苷酸序列，其编码koe4，NCBI蛋白登录号 CAB89450. 1 GI :7672261的推定分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3 (2)]；图46显示了如SEQ ID No. 33所示的核苷酸序列，其编码koe5，NCBI蛋白登录号 CAB62724. 1 GI :6562793的推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3 (2)]；图47显示了如SEQ ID No. 34所示的核苷酸序列，其编码Sriml，NCBI蛋白登录号 AAK84028. 1 GI :15082088 GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]；图48显示了来自嗜水气单胞菌(ATCC #7965)的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序 列(SEQ ID No. 35)；图49显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(ATCC#14174)的编码脂质酰基转移酶的 核苷酸序列(SEQ ID No. 36)；图50显示了具有AsnSOAsp突变(注意，第80位氨基酸位于成熟序列中)的杀鲑 气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)突变体的氨基酸序列(本文显示为SEQ ID No. 15)， 和经过翻译后修饰的氨基酸序列(SEQ ID No. 37)。成熟多肽SEQ ID No. 15的翻译后修饰 包括在位置235-A至(且包括)位置273-R的切割，由此失去38个氨基酸。-SEQ ID No. 37的第235位和236位氨基酸残基在翻译后修饰后并没有共价连接。 所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥连接在一起。SEQ ID No. 37中的第236位氨基酸对 应于本文所示的SEQ ID No. 15中的第274位氨基酸残基。图51显示了从生物天蓝色链霉菌A3 ( 获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的 核苷酸序列(SEQ ID No. 38) (Genbank 登录号 NC_003888. 1 :8327480. . 8328367)；图52显示了从生物天蓝色链霉菌A3 ( 获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的 核苷酸序列(SEQ ID No. 39) (Genbank 登录号 AL939131. 1 :265480. · 266367)；图53显示了从生物酿酒酵母获得的本发明的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列 (SEQ ID No. 40) (Genbank 登录号 Z75034)；图 54 显示了氨基酸序列(SEQ ID No. 41)。Scoe3 NCBI 蛋白登录号 CAB88833. 139GI =7635996的推定的分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3 O)]；图55显示了 SEQ ID No 42，其为来自近平滑假丝酵母的脂质酰基转移酶的氨基酸 序列；图56显示了来自喜热裂孢菌的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No. 43)；图 57 显示了来自 Novosphingobium aromaticivorans, 284 个氨基酸的脂质酰基 转移酶的多肽(SEQ ID No. 44)；图58显示了来自天蓝色链霉菌，268个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No. 45)；图59显示了来自阿维链霉菌269个氨基酸的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.46)；图60显示了来自褐色喜热裂孢菌的核苷酸序列(SEQ ID No. 47)；图61显示了来自天蓝色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No. 48)；图62显示了来自阿维链霉菌的氨基酸序列(SEQ ID No. 49)；图63显示了来自阿维链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No. 50)；图64显示了来自褐色喜热裂孢菌/⑶的氨基酸序列(SEQ ID No. 51)；图65显示了如SEQ ID No. 52所示的核苷酸序列，其编码koe3，NCBI蛋白登录号 CAB88833. 1 GI :7635996的推定分泌性蛋白[天蓝色链霉菌A3 (2)]；图66显示了来自褐色喜热裂孢菌的氨基酸序列(SEQ ID No. 53)；图67显示了以磷脂酰胆碱和胆固醇为底物，由脂质酰基转移酶催化的反应示意 图；图68显示了在40°C温育1小时(见深色块)或在2°C温育20小时(见浅色块)， 随后在75°C热处理1小时的精膏肉酱的质地测量结果；其中#1)是没有酶添加的对照 ’#2) 添加T 0. 84TrU/g剂量的酶KLM3，；#3)添加了 4. 2TrU/g剂量的酶KLM3，；和#4)添加了 3LEU/g剂量的磷脂酶Lipomod ；图69显示了来自肉样品的脂质的TLC分析(溶剂6)结果。PE =磷脂酰乙醇胺； PA =磷脂酸；PI =磷脂酰肌醇；PC =磷脂酰胆碱；图70显示了来自肉样品的脂质的TLC分析(溶剂5)结果。CHL =胆固醇；FFA = 游离脂肪酸；图71显示了使用对照乳化剂Citrem或本发明的脂质酰基转移酶(KLM3’)处理的 以及阴性对照(不含酶或乳化剂)的德国肝肉香肠的照片；和图72显示了由HPTLC分析的肝肉香肠中的游离胆固醇；1 =对照；2 = KLM3_脂质 酰基转移酶(剂量如实施例3) ；3 = Citrem ；均为基于干重的百分比。实施例1地衣芽孢杆菌中脂质酰基转移酶(KLM3')的表达在地衣芽孢杆菌中将编码脂质酰基转移酶(SEQ. ID No. 15，，下文称为KLM3')的 核苷酸序列(SEQ ID No. 49)与地衣芽孢杆菌α -淀粉酶(LAT)的信号肽一起作为融合蛋 白表达(参见图35和36)。为了优化在芽孢杆菌中的表达，从Geneart (Geneart AG，德国 雷根斯堡)订购了经密码子优化的基因构建体(ηο.05^Κ)7)。构建体No. 052907包含位于LAT-KLM3’前体基因之前的不完全LAT启动子(仅_1040序列)和位于LAT-KLM3’前体基因下游的LAT转录(Tlat)(参见图35和36)。为了构建包 含5’末端侧翼具有完全LAT启动子、3’末端侧翼具有LAT终止子的LAT-KLM3’前体基因 的XhoI片段，以Plat5XhoI_FW和EBS2XhoI_RV为引物并以基因构建体05四07为模板进行 PCR (聚合酶链式反应)扩增。Plat5XhoI_Fff ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattcggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaaggggEBS2XhoI_RV :tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc根据生产商的说明书，使用Wiusion高保真度DNA聚合酶(Firmzymes 0Y,芬兰埃 斯波)在热循环仪进行PCR (退火温度55°C )。根据生产商的说明书anvitrogen，Carlsl3ad，Calif. USA)，使用限制性酶XhoI消 化所得PCR片段，并使用T4DNA连接酶将其连接到经BioI消化的pICatH中。如美国专利申请US20020182734(国际公布WO 02/14490)所述，将连接混合物转 化进入枯草芽孢杆菌株SC6. 1。通过DNA测序确定包含LAT-KLM3’前体基因的BioI插入 物的序列(BaseClear，荷兰莱顿)，并将正确质粒克隆之一命名为pICatH-KLM3’ (oril) (图53)。在许可的温度(37°C )下将pICatH-KLM3’ (oril)转化进入地衣芽孢杆菌株 BML780 (BRA7 和 BML612 的衍生物，参见 W02005111203)。选择一个新霉素抗性(neoR)和氯霉素抗性(CmR)的转化株并将其命名为 BML780(plCatH-KLM3，(oril))。通过在非许可温度(50°C )下、于含有5μ g/ml氯霉素的培 养基中培养菌株，使BML780(plCatH-KLM3’ (oril))中的质粒整合到地衣芽孢杆菌基因组 的catH区中。选择一个CmR抗性克隆，并将其命名为BML780-plCatH_KLM3，(oril)。再次 在许可温度、没有抗生素的情况下培养BML780-plCatH-KLM3’ (oril)数代以使载体序列环 出(loop-out)，随后选择一个对新霉素敏感(neoQ的CmR克隆。在此克隆中，染色体上的 PlCatH载体序列被切除(包括新霉素抗性基因)，并只留下catH-LATKLM3’盒。随后，通过 在氯霉素浓度增加的培养基中/上培养菌株来扩增染色体上的catH-LATKLM3’盒。在扩增 数轮后，选择一个克隆(抗5(^8/1111氯霉素)，并将其命名为81^780-1(00’04 50。为了确 定KLM3’表达，使BML780-KLM3’CAP50和BML780(空宿主菌株)在添加有三丁酸甘油酯 的 Heart Infusion (Bacto)琼脂培养板上于 37°C下培养 48 小时。在 BML780-KLM3，CAP50 菌落周围明显可见澄清的区域(指示脂质酰基转移酶活性)，而宿主菌株BML780周围则不 可见(参见图38)。此结果显示在地衣芽孢杆菌株BML780-KLM3’ CAP50中表达了大量的 KLM3’，且这些KLM3’分子是有功能的。所表达的KLM3’具有翻译后截短的序列，其在翻译 后截短后具有SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列。实施例2使用脂质酰基转移酶(KLM3’)以降低基于肉的食品(即精膏香肠)的胆固醇含量 (同时保持或改进重量损失、质地和脂肪稳定性)所测试的酶 本发明的脂质酰基转移酶具有SEQ ID No. 37的KLM3，(3158TrU/g)。 出于比较的目的测试的来自BioCatalysts，UK的Lipomod 699L (胰酶磷脂酶) (根据厂商的说明为10，000单位/ml)41
配方表1 精膏肉酱(fine paste meat batter)的配方
权利要求
1.用于降低基于肉的食品的胆固醇量和/或改进其质地和/或降低其重量损失和/或 提高其脂肪稳定性的方法，所述方法包括a)使肉接触脂质酰基转移酶；b)在约1°C至约70°C之间的温度下温育所述与脂质酰基转移酶接触的肉；c)由所述肉生产食品；其中步骤b)在步骤c)之前、期间或之后进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶接触的肉温育约1小时至 24小时之间。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶接触的肉在 约1°C至约9 °C之间的温度下温育。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶接触的肉在约 1°C至约6 °C之间的温度下温育。
5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶接触的肉温 育约10小时至约24小时之间。
6.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶接触的肉在 约60°C至约70°C之间的温度下温育。
7.如权利要求1、权利要求2或权利要求6所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶 接触的肉在约60°C至约68°C之间的温度下温育。
8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶接触的肉温 育约30分钟至约2小时之间。
9.如权利要求6、权利要求7或权利要求8所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶 接触的肉温育约1小时至约1. 5小时之间。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶接触的肉和 /或由其获得的食品进一步加热至一定的温度并保持足够的时间以灭活所述酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中将所述与脂质酰基转移酶接触的肉和/或由其获 得的食品加热到约80°C至约140°C范围的温度。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中要与所述脂质酰基转移酶接触的肉是 碎肉。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述食品是乳化的肉产品。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述食品包含至少15%的肉。
15.脂质酰基转移酶用于生产基于肉的食品的应用。
16.如权利要求15所述的应用，其中技术效果是与肉未经所述脂质酰基转移酶处理的 基于肉的相当食品相比，所述基于肉的食品的胆固醇量减少。
17.如权利要求15或权利要求16所述的应用，其中技术效果是以下一种或多种与肉 未经所述脂质酰基转移酶处理的基于肉的相当食品相比，所述基于肉的食品的质地改进和 /或重量损失减少和/或脂肪稳定性提高。
18.如权利要求1-14中任一项所述的方法或如权利要求15或权利要求17所述的应 用，其中所述脂质酰基转移酶的特征是其为具有酰基转移酶活性并包含氨基酸序列基序 GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、N、M或S。
19.如权利要求1-14中任一项所述的方法或如权利要求15或权利要求17所述的应 用，其中在使用“用于测定转移酶活性％的方法”测定时，所述脂质酰基转移酶在所述基于 肉的食品中具有至少15%，优选至少20%，优选至少30%，优选至少40%的转移酶活性。
20.如权利要求1-14中任一项所述的方法或如权利要求15或权利要求17所述的 应用，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽是通过表达 任一以下所示的核苷酸序列或与其具有75%或更高同一性的核苷酸序列获得的SEQ ID No. 2USEQ ID No. 47,SEQ ID No. 25,SEQ ID No. 48,SEQ ID No. 50,SEQ ID No. 5USEQ ID No. 26、SEQ ID No. 27,SEQ ID No. 28,SEQ ID No. 38,SEQ ID No. 39,SEQ ID No. 40,SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 3USEQ ID No. 52,SEQ ID No. 32,SEQ ID No. 33,SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 35 或 SEQ ID No. 36。
21.如权利要求1-14中任一项所述的方法或如权利要求15或权利要求17所述的应 用，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽是通过表达以 下序列获得的a.SEQ ID No.沈所示的核苷酸序列，或与其具有75%或更高同一性的核苷酸序列；b.编码所述多肽的核酸，其中所述多肽与SEQID No. 15所示的多肽序列或SEQ ID No. 37所示的多肽序列具有至少70%的同一性；或c.在中等严谨条件下，与包含SEQID No.沈所示核苷酸序列的核酸探针杂交的核酸。
22.如权利要求1-14中任一项所述的方法或如权利要求15或权利要求17所述的 应用，其中所述脂质酰基转移酶是具有脂质酰基转移酶活性的多肽，所述多肽包含任一以 下所示的氨基酸序列或与其具有75%或更高同一性的氨基酸序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 4,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 8,SEQ ID No. 9、 SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 4USEQ ID No. IUSEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14、 SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 20 或 SEQ ID No. 37。
23.如权利要求1-14中任一项所述的方法或如权利要求15或权利要求17所述的应 用，其中所述脂质酰基转移酶包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列，或与SEQ ID No. 37具 有95%或更高同一性的氨基酸序列。
24.如权利要求1-14中任一项所述的方法或如权利要求15或权利要求17所述的应 用，其中所述脂质酰基转移酶包含与SEQ ID No. 37具有98%或更高同一性的氨基酸序列。
25.如权利要求1-14中任一项所述的方法或如权利要求15或权利要求17所述的应 用，其中所述脂质酰基转移酶包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列。
26.如权利要求1-14中任一项所述的方法或如权利要求15或权利要求17所述的应 用，其中所述脂质酰基转移酶具有SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列。
27.一种胆固醇含量减少或不含胆固醇的基于肉的食品，其包含至少30%的肉和灭活 的脂质酰基转移酶。
28.通过权利要求1-14或权利要求18-27中任一项所述的方法可获得(例如获得)的 基于肉的食品。
29.参考实施例和附图，基本如本文所定义的方法、应用或基于肉的食品。
全文摘要
本发明涉及一种降低基于肉的食品的胆固醇量和/或改进其质地和/或降低其重量损失和/或提高其脂肪稳定性的方法，所述方法包括a)使肉接触脂质酰基转移酶；b)在约1℃至约70℃之间的温度下温育所述与脂质酰基转移酶接触的肉；c)由所述肉生产食品；其中步骤b)在步骤c)之前、期间或之后进行。本发明还涉及脂质酰基转移酶在减少基于肉的食品的胆固醇中的应用。
文档编号A23K1/18GK102056498SQ200980120783
公开日2011年5月11日 申请日期2009年4月8日 优先权日2008年4月18日
发明者乔恩·B·索伊, 利夫·斯彭纳·克里斯蒂安森, 耶斯佩·坎普 申请人:丹尼斯科公司