专利名称：表达除草剂耐受基因的构建体、相关植物和相关的性状组合的制作方法
表达除草剂耐受基因的构建体、相关植物和相关的性状组
合
背景技术：
选择性标记是一种可以检测的遗传性状或能够被鉴定和追踪的DNA区段 (segment)。标记基因通常充当另一基因(有时称为靶基因)的标志(flag)。标记基因通 常与用于转化靶细胞的靶基因一起使用。以可遗传的方式接纳靶基因的靶细胞能够通过选 择也表达标记基因的细胞来鉴定。标记基因与靶基因足够接近，因而所述两个基因(标记 基因和靶基因)在遗传上连锁并且通常一起遗传。目前选择性标记的标准是“pat”基因， 其编码称为膦丝菌素乙酰转移酶的酶。谷氨酰胺合成酶(“GS”)在许多植物中是植物细胞发育和生活的关键酶。GS将 谷氨酸转化成谷氨酰胺。GS还参与氨同化和氮代谢。GS参与了在大多数植物中用于解毒 由硝酸还原释放的氨的途径。因此，GS的强力抑制剂对于植物细胞的毒性非常大。分解或 修饰植物内的除草剂能够导致抗性。基于植物中因抑制GS而产生的毒性作用，开发了一类特殊的除草剂。双丙氨酰膦 (Bialaphos)和膦丝菌素是两个这样的作用于GS的抑制剂并且拥有出色的除草性质。这两 种除草剂是非选择性的；它们抑制土壤上存在的全部不同种类植物的生长，因此引起对它 们的整体破坏。双丙氨酰膦也是一种广谱除草剂。双丙氨酰膦由膦丝菌素(PPT或PTC ;2_氨 基-4-甲基膦基丁酸)、L-谷氨酸类似物和两个L-丙氨酸残基组成。因此PPT和双丙氨酰 膦之间的结构差异在于PPT缺少两个丙氨酸氨基酸。通过胞内的肽酶将双丙氨酰膦的L-丙 氨酸残基去除的情况下，则释放PPT。PPT是GS的有力抑制剂。在植物中通过PPT对GS的 抑制引起氨的迅速积累和植物细胞的死亡。双丙氨酰膦最初被披露具有抗生素特性，这使得它能够用作杀虫剂或杀真菌剂。 美国专利第3，832，394号涉及培养吸水链霉菌(Str印tomyceshygroscopicus)，和从它 的培养物培养基回收双丙氨酰膦。然而，其他菌株，例如绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)，也产生这种化合物。其他含有PPT模块(moiety)的三肽抗生素也已 知存在于自然界中，例如磷丙氨菌素(phosalacin)。PPT也是通过化学合成获得的并且进 行商业销售。产双丙氨酰膦的吸水链霉菌和绿色产生链霉菌受到具有膦丝菌素乙 酰转移酶活性的酶的保护而不受PPT毒性影响。Plant Physiol, April 2001， Vol. 125, pp. 1585-1590 ( "Expression of bar in the Plastid Genome Confers HerbicideResistance，”Lutz等)。产生这些抗生素的链霉菌属菌种(Sti^ptomyces species)本身会受到破坏，如果它们不具有针对这些抗生素的自我防御机制。已经发现这 种自我防御机制在多种情况下包含能够抑制抗生素作用的酶。膦丝菌素乙酰转移酶由bar (双丙氨酰膦抗性；Thompson等，1987)或pat(膦丝菌 素乙酰转移酶；Strauch等，1988)基因编码，并且通过乙酰化PPT的游离氨基来解毒PPT。 由这两种基因编码的酶功能上相同并且在氨基酸水平显示85%同一性(Wohlleben等，1988 ；Wehrmann等，1996)。已经通过自核基因在胞质中表达嵌合的bar或pat基因获得了 PPT抗性作物。已经通过在烟草(烟草栽培种Petit Havana (Nicotiana tabacum cv Petit Havana)) >1^^11 (Brassica napus)(Brassica oleracea) (De Block
1987 ；De Block 等，1989)、玉米(Spencer 等，1990)和稻(Cao 等，1992)中直接选择 PPT 抗 性获得了除草剂抗性品系。在天蓝色链霉菌A3 Gti^ptomyces coelicolor A3)中鉴定了与hrdDo因子基因 相邻的一个基因(bar)。预测的bar产物与产生双丙氨酰膦的绿色产色链霉菌和吸水链霉 菌的pat和bar基因的产物分别显示了 32. 2%和30. 4%的同一性。当处于高拷贝数载体上 克隆入天蓝色链霉菌中时，天蓝色链霉菌bar基因赋予对双丙氨酰膦的抗性。Bedford等， Gene,1991.Tul 31 ； 104(1) 39-45,"Characterization of a gene conferring bialaphos resistance in Streptomycescoelicolor A3 (2). ”。在其他微生物中异源表达这种基因， 或将这种基因转化入植物，迄今为止尚无报导。除草剂抗性性状的用途参见DE 3642829A和美国专利第5，879，903号(以及 5，637，489 ；5，276，268 ；和5，273，894)，其中pat基因分离自绿色产色链霉菌。WO 87/05629 和美国专利第5，648，477号(以及5，646，OM和5，561，236)涉及使用来自吸水链霉菌 的bar基因用于保护植物细胞和植物免于谷氨酰胺合成酶抑制剂(例如PPT)的用途和植 物中除草剂抗性的开发。将编码对除草剂BASTA (Hoechst膦丝菌素)或Herbiace (Mei ji kika双丙氨酰膦)的抗性的基因通过农杆菌感染导入烟草(烟草栽培种PetitHavan SRl)、马铃薯(马铃薯栽培种 Benolima (Solanum tuberosum cv Benolima))和番茄(番茄 (Lycopersicumesculentum))植物中，并且赋予了除草剂抗性。
发明内容
主题发明部分地涉及供表达除草剂耐受基因的构建体、相关植物和相关性状 的组合。上述构建体和植物包含本文中称作DSM-2的基因。该基因是在天蓝色链霉菌 (Streptomyces coelicolor)中鉴定的(A3)。DSM-2 蛋白远缘地与 PAT 和 BAR 相关。DSM-2 可用作转基因性状以在植物细胞和植物中赋予针对除草性分子草铵膦(glufosinate)、膦 丝菌素和/或双丙氨酰膦(Bialaphos)等的耐受性。将该基因引入多种植物使得针对除草 剂草铵膦、双丙氨酰膦和其他除草剂的优良水平的耐受性和/或抗性成为可能。优选的植 物包括芸薹和大豆。主题发明还涉及主题除草剂耐受作物(herbicide tolerant crop，HTC)性状同其 他性状的组合，所述其他性状包括其他HTC性状(包括但不仅限于草甘膦耐受性和2，4-D 耐受性)，和/或在一些优选实施方案中，昆虫抗性(IR)性状。DSM与顶性状的一些优选 叠加(stack)是在烟草和玉米中。因此，DSM-2基因的多种用途包括在本主题发明的保护范围内。上述用途包括将 DSM-2基因与一种或多种其他转基因性状叠加，并将DSM-2基因单独引入优选的作物中。附图简述
图1 显示通过由DSM2介导的N-乙酰化使草铵膦失活。序列简述SEQ ID NO 1 是天然 DSM—2 序列。
SEQ ID NO :2是天然蛋白质序列。SEQ ID NO :3 是 Hemicot DSM-2 (v2)序列。SEQ ID NO :4是重建的(Rebuilt)蛋白质序列。SEQ ID NO :5 是 Pat PTU 引物(MAS 123)。SEQ ID NO :6 是 PatPTU 引物(Per 5-4)。SEQ ID NO :7是Pat编码区引物SEQ ID NO :8是Pat编码区引物SEQ ID NO :9 是 DSM-2 (v2)编码区引物SEQ ID NO 10 是 DSM-2 (v2)编码区引物发明详述主题发明部分地涉及供表达除草剂耐受基因的构建体、相关植物和相关性状 的组合。上述构建体和植物包含本文中称作DSM-2的基因。该基因是在天蓝色链霉菌 (Streptomyces coelicolor)中鉴定的(A3)。DSM-2 蛋白远缘地与 PAT 和 BAR 相关。DSM-2 可用作转基因性状以在植物细胞和植物中赋予针对除草性分子草铵膦(glufosinate)、膦 丝菌素和/或双丙氨酰膦(Bialaphos)等的耐受性。将该基因引入多种植物使得针对除草 剂草铵膦、双丙氨酰膦和其他除草剂的优良水平的耐受性和/或抗性成为可能。优选的植 物包括芸薹和大豆。主题发明还涉及主题除草剂耐受作物(herbicide tolerant crop，HTC)性状同其 他性状的组合，所述其他性状包括其他HTC性状(包括但不仅限于草甘膦耐受性和2，4-D 耐受性)，和/或在一些优选实施方案中，昆虫抗性(IR)性状。因此，DSM-2基因的多种用途包括在主题发明的保护范围内。上述用途包括将 DSM-2基因与一种或多种其他转基因性状叠加，并将DSM-2基因单独引入优选的作物中。PCT/US07/86813(由 Dow AgroSciences，Lira 等提交于 2007 年 12 月 7 日)以提 述的方式并入本文。实验证明了大肠杆菌细胞系BL2Htar(DE3) (Invitrogen目录号#C6010_03)在 含有浓度为lOOyg/ml的草铵膦铵(Basta)的基本培养基上受到抑制。DSM-2在BL21Mar 细胞系中的表达补足了在含有400yg/ml草铵膦的基本培养基上的抗性。这些实验说明 DSM-2的表达可以用作非药用抗生素选择性标记在受草铵膦抑制的细菌中用于克隆应用。进一步的实验证实植物启动子拟南芥(Arabidopsis thaliana)PolyUbiquitin 10 (At UbilO)和病毒启动子木薯叶脉花叶病毒(Cassava VeinMosaic Virus (CsVMV))在 大肠杆菌菌株BL21-Star(DE3)中有功能。两种启动子均表达充足的DSM-2蛋白以提供对 含200μ g/ml草铵膦的基本培养基的抗性。这些植物启动子可以用于在大肠杆菌中驱动 DSM-2作为非药用抗性选择性标记的表达。单一植物启动子在细菌和植物二者中的功能性 消除了针对每个物种需要单独的选择性标记的需求。这种基因也可以连同经修饰的农杆菌属菌株用作新型植物转化系统的基础。使用 非药用抗生素抗性标记基因用于蛋白质产生的荧光假单胞菌新菌株或其他的微生物菌株 也可以按照主题的发明产生。通过免去片段纯化、远离药用抗生素抗性元件来改进克隆和 转化的方法及效率也可能是一个好处。除了 HTC性状，使用除草剂用于控制杂草的方法也在主题的发明的范围之内，其中对于该除草剂已通过主题的基因在转基因作物中产生了除草剂耐受。主题的HTC性状的 组合在与其他HTC性状(包括但不限于草甘膦耐受和2，4_D耐受)组合时也是有益的，特别 是用于控制具有对除草剂(例如草甘膦)新近获得的抗性或固有的耐受性的物种。另外， 当将草甘膦耐受作物(其在全世界变得越来越流行)与另外的草甘膦耐受作物轮种时，控 制草甘膦抗性的自生作物(volunteer)可能是困难的。因此，使用叠加的或单独转化入作 物的这些转基因性状可以提供一种对其他HTC自生作物进行控制的工具。此外，DSM-2自身或与一种或多种别的HTC性状的叠加可与一种或多种其他的投 入(input)性状(例如，昆虫抗性、真菌抗性或胁迫抗性等)或产出(output)性状(例如， 增加的产量、改善的油料分布(oil profile)、改善的纤维质量等)叠加。因此，主题发明可 用于提供完整的农艺学组件(agronomicpackage)，其包含改善的作物质量以及灵活地并划 算地控制任何数量的农业病害(agronomic pests)的能力。主题的发明的蛋白质(和来源分离株(source isolate)) 0本发明提供功能性蛋 白质。“功能性活性”(或“活性的”)在此是指用于主题的发明的用途的蛋白质/酶具有降 解或减少除草剂活性的能力(单独或与其他蛋白质组合)。产生主题的发明的蛋白质的植 物会优选产生“有效量”的所述蛋白质，从而当用除草剂处理该植物时，蛋白质表达的水平 足以使植物完全或部分地抗所述除草剂(除非另行指定，否则按照典型的比率(rate)；例 如，典型施用率(application rate)可以在公知的除草剂手册(Weed Science Society of America, Eighth Edition, 2002)中找到)或对所述除草剂耐受。所述除草剂可以按照一 般会杀死目标植物的比率，按照普通田间使用比率和浓度施用。(由于主题的发明，水平和 /或浓度可以任选地高于先前使用的那些。)优选地，主题的发明的植物细胞和植物受到针 对由除草剂处理引起的生长抑制或损伤的保护。如本文所讨论的，优选地使主题的发明的 经转化的植物和植物细胞对除草剂有抗性或耐受，意味着所述经转化的植物和植物细胞能 够在有效量的本文所讨论的一种或多种除草剂存在下生长。主题的发明的优选的蛋白质具 有代谢一种或多种芳氧基链烷酸酯/盐(aryloxyalkanoate)化合物的催化活性。无法简 单地讨论术语“抗性”，也不能使用动词“耐受”或形容词“耐受的”。工业上花费了无法计数 的时间来争论除草剂耐受作物(HTC)与除草剂抗性作物(HRC)。HTC是工业上优选的术语。 然而，官方的W^eed Science Society ofAmerica对抗性的定义是“在曝露于一般为野生型 致死剂量的除草剂之后，植物能够存活并繁殖的遗传性能力。在植物中，抗性可以是天然存 在的或是通过如遗传工程或对组织培养或诱变产生的变体进行选择等技术来诱导的。”用 于本文除非另有说明，除草剂“抗性”是可遗传的，并且使得植物能够在用针对给定植物的 除草剂进行的典型有效除草处理(如主题的公开提交时通用的除草剂手册版本所建议的) 存在下生长和繁殖。如本领域技术人员所公认的，即使因曝露于除草剂而有的某种程度的 植物损伤是表观的，植物仍然可以被认为是“抗性的”。如本文所使用，术语“耐受”比术语 “抗性”更宽，并且包括如本文所定义的“抗性”，以及特定植物改进的经受住不同程度除草 剂诱导的损伤的能力，所述不同程度的损伤通常是在相同除草剂剂量下在相同基因型的野 生型植物中产生的。将功能性活性转给植物或细菌系统可以包括核酸序列，其编码主题的发明的蛋白 质的氨基酸序列，所述核酸序列整合在蛋白质表达载体中，所述蛋白质表达载体适合于该 载体将存在于其中的宿主。获得编码具有功能性活性的蛋白质的核酸序列的一种方法是，如本文所公开的，利用从蛋白质的氨基酸序列推定的信息，从产生感兴趣的蛋白质的细菌 菌种分离天然的遗传物质。可以将天然序列针对在植物中的表达进行优化，例如，如下文将 更详细讨论的。也可以基于蛋白质序列设计优化的多核苷酸。表征这些蛋白质种类和编码它们的多核苷酸的一种方法是如下限定多核苷酸，通 过所述多核苷酸在指定条件范围内与示例核苷酸序列(其互补体和/或源自任一链的一个 或多个探针)杂交的能力，和/或通过所述多核苷酸藉由使用源自示例序列的引物进行的 PCR来扩增的能力。有多种方法用于获得按照主题的发明使用的蛋白质。例如，可以使用本文公开的 蛋白质的抗体从蛋白质的混合物鉴定和分离其他的蛋白质。具体而言，抗体可以针对蛋白 质中最保守或与其他相关蛋白相比差别最大的部分来产生。然后可以通过免疫沉淀、酶联 免疫吸附测定法(ELISA)或免疫印迹将这些抗体用于特异性地鉴定具有特征活性的等效 蛋白质。针对本文公开的蛋白质或针对等效蛋白质或针对这些蛋白质的片段的抗体可以使 用标准流程容易地制备。这些抗体是主题的发明的一个方面。主题的发明的抗体包括单克 隆和多克隆抗体，优选是响应于示例的或建议的蛋白质产生的。得益于主题的公开，主题的发明的蛋白质和基因可以从多种来源获得，包括例如 多种微生物，例如重组的和/或野生型细菌。细菌分离株的突变体可以通过本领域公知的流程制备。例如，不产芽孢的 (asporogenous)突变体能够通过对分离株进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变来获得。突变体可 以使用紫外线和亚硝基胍通过本领域公知的流程来制备。“来自，，或“获得自，，本文涉及或建议的任何主题分离株的蛋白质是指所述蛋白质 (或类似蛋白质)可以从主题的分离株或一些其他来源获得，例如另一细菌菌株或植物。 “源自，，也有这种含义，并且包括例如能够从给定的为了在植物中表达而修饰的细菌类型获 得的蛋白质。本领域技术人员会容易地认识到，假设披露了细菌基因和蛋白质，就能够工程 改造植物使其产生所述蛋白质。抗体制备物、核酸探针(例如DNA、RNA或PNA)等可以使用 本文公开的多核苷酸和/或氨基酸序列制备，并且用于从其他(天然)来源筛选和回收其 他相关基因。可以使用标准分子生物学技术来克隆并测序本文描述的蛋白质和基因。额外的信 息可以在Sambrook等，1989中找到，将其通过引用并入本文。多核苷酸和探针。主题的发明还提供编码按照主题的发明使用的蛋白质的核酸序 列。主题的发明还提供鉴定和表征基因的方法，所述基因编码具有期望的除草剂活性的蛋 白质。在一个实施方案中，主题的发明提供独特的核苷酸序列，其可用作杂交探针和/或用 于PCR技术的引物。引物产生的特征性基因片段可以在感兴趣的特定基因的鉴定、表征和 /或分离中使用。主题的发明的核苷酸序列编码的蛋白质不同于先前描述的蛋白质。主题的发明的多核苷酸可以用于形成在期望的宿主细胞中编码蛋白质或肽的完 整“基因”。例如，如本领域技术人员将轻易认识到的，在感兴趣的宿主中可以适当地将主题 的多核苷酸置于启动子的调控下，如本领域中容易知晓的。基因表达和时间/组织特异性 表达的水平能够大大影响本发明的应用。通常，更高的降解基因蛋白质表达水平会导致更 快和更完整的底物降解(在这种情况下，底物是目标除草剂)。启动子以高水平表达靶基因 将是理想的，除非高表达对植物健康有因此产生的负面影响。通常，人们会希望DSM-2基因在全部组织中组成型表达来对全部生长阶段的植物进行完全保护。但是，人们可以代替地 使用营养型表达的抗性基因；这将允许在耕种中使用目标除草剂用于杂草控制并且随后将 通过在开花阶段中施用来控制目标作物的有性繁殖。如本领域技术人员所知，DNA通常以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一 条链互补，反之亦然。若DNA在某植物中复制(例如)，则产生额外的DNA互补链。“编码 链”在本领域中通常用于指与反义链结合的链。mRNA从DNA的“反义”链转录。“有义”或 “编码”链具有可以作为可读框(ORF)阅读的一系列密码子(一个密码子是三个核苷酸，其 能够被读作指定特定氨基酸的一个三个残基的单元)，以形成感兴趣的蛋白质或肽。为了在 体内产生蛋白质，DNA链通常转录成mRNA的互补链，其作为蛋白质的模板使用。因此，主题 的发明包括随附的序列表中所示的示例多核苷酸和/或包括互补链的等效物的用途。将功 能上与示例DNA分子等效的RNA和PNA(肽核酸)包括在主题的发明中。在主题的发明的一个实施方案中，可以将细菌分离株培养在导致微生物高繁殖的 条件下。在处理微生物以提供单链基因组核酸之后，可以将DNA与本发明的引物接触并且 进行PCR扩增。感兴趣的基因的特征性片段将通过所述方法得到扩增，由此鉴定感兴趣的 基因的存在。主题的发明另外的方面包括使用本文公开的方法和核苷酸序列鉴定的基因和分 离株。由此鉴定的基因能够编码主题的发明的除草剂抗性蛋白质。例如，按照主题的发明使用的蛋白质和基因可以通过使用寡核苷酸探针鉴定和获 得。这些探针是可检测的核苷酸序列，其能够依靠适当的标记来检测或可以使其成为固有 发荧光的，如国际申请第WO 93/16094号中所述。探针(和主题的发明的多核苷酸)可以 是DNA、RNA或PNA。除了腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶⑴和尿嘧啶(U; 用于RNA分子)，主题的发明的合成探针(和多核苷酸)也可以具有肌苷(一种能够与全部 四种碱基配对的中性碱基；在合成探针中有时用来代替全部四种碱基的混合物)和/或其 他合成(非天然)碱基。因此，在本文提及合成的、简并寡核苷酸，并且统称使用“N”或“η” 的情况下，“N”或“η”可以是G、A、T、C或肌苷。本文使用的多义密码(ambiguity code)符 合主题的申请提交时的标准IUPAC命名规定(例如，R是指A或G，Y是指C或T等)。如本领域所公知的，如果探针分子与核酸样品杂交，那么能够合理地假设所述探 针和样品具有实质上的(substantial)同源性/相似性/同一性。优选地，首先进行多核 苷酸的杂交，其后在低、中或高严紧性条件下通过本领域公知的技术洗涤，例如，如Keller， G. H.，Μ. M. Manak (1987) DNAProbes, StocktonPress, New York, NY, pp. 169-170 中所述。例 如，如该文献中所述，低严紧性条件可以通过首先用h SSC(标准柠檬酸盐水(Mandard Saline Citrate))/0. 1% SDS(十二烧基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate))在室温洗涤 15分钟来实现。通常进行两次洗涤。然后可以通过降低盐浓度和/或提高温度来实现较 高的严紧性。例如，上述洗涤之后可以进行两次洗涤，每次在室温使用0. Ix SSC/0. 1% SDS 进行15分钟，然后再进行多次洗涤，每次在55°C用0. Ix SSC/0. SDS进行30分钟。这 些温度可以用于本文所述的其他杂交和洗涤方案，并且如本领域技术人员将会知道的(例 如，SSPE可以用作盐代替SSC)。h SSC/0. 1% SDS可以通过向445ml水加入50ml的20x SSC和5ml的10% SDS来制备。20x SSC可以通过混合NaCl (175. 3g/0. 150M)、柠檬酸钠 (88. 2g/0. 015M)和水，用IONNaOH将pH调节至7. 0，然后将体积调节至1升来制备。10%SDS可以通过将IOg SDS溶解到50ml高压灭菌水中，然后稀释到IOOml来制备。探针的检测提供了 一种以已知方式测定杂交是否得到保持的手段。这样的探针分 析提供了一种鉴定主题的发明的基因的快速方法。用作本发明的探针的核苷酸区段可以使 用DNA合成仪和标准流程来合成。这些核苷酸序列也可以用作PCR引物来扩增主题的发明 的基因。分子的杂交特征可以用于鉴定主题的发明的多核苷酸。因此主题的发明包括与本 文示例的多核苷酸杂交的多核苷酸(和/或它们的互补体，优选它们的完整互补体)。也就 是说，例如，一种定义基因(和它编码的蛋白质)的方法是通过它与已知的或具体示例的基 因杂交的能力(在任何本文具体公开的条件下)。如用于本文，用于杂交的“严紧”条件是指实现与目前的申请人所采用的条件所实 现的杂交的特异性程度相同或大约相同的条件。具体而言，可以通过标准方法将Southern 印迹上固定化的DNA与标记的基因特异性探针杂交(参见，例如，Maniatis等1982)。 概括而言，杂交和后续的洗涤可以在允许对靶序列进行检测的条件下进行。对于双链 DNA基因探针，杂交可以在低于DNA杂合体解链温度(Tm) 20-25°C的温度下在6x SSPE, hDenhardt's溶液、0. 1% SDS,0. lmg/ml变性DNA中过夜进行。解链温度通过以下公式描 述(Beltz 等 1983)
Tm = 81.5°C+ 16.6 Log[Na+] + 0.41(%G+C) - 0.61(%曱酰胺)-600/以碱
基对计的双链体长度洗涤通常如下进行(1)在Ix SSPE、0· 1% SDS中在室温进行两次各15分钟(低严紧性洗涤)。(2)在0. 2x SSPE、0· 1 % SDS中在Tm-20°C进行一次15分钟(中严紧性洗涤)。对于寡核苷酸探针，杂交可以在6x SSPE,5x Denhardt，s溶液、0. 1% SDS,0. Img/ ml变性DNA中在低于杂合体解链温度(Tm) 10-20°的温度过夜进行。寡核苷酸探针的Tm 可以通过以下公式决定 Tm(°C ) = 2 (Τ/Α碱基对数目)+4 (G/C碱基对数目)(Suggs 等，1981)。洗涤通常可以如下进行(1)在Ix SSPE、0· 1 % SDS中在室温进行两次各15分钟(低严紧性洗涤)。(2)在Ix SSPE、0· 1% SDS中在杂交温度进行一次15分钟(中严紧性洗涤)。概括而言，可以改变盐和/或温度来改变严紧性。对于长度> 70左右的标记DNA 片段，可以使用以下条件低1或 SSPE，室温低1或& SSPE，42°C中0· 2x 或 Ix SSPE，65°C高0.Ix SSPE，65°C双链体的形成和稳定性依赖于杂合体两条链之间实质上的互补性，并且，如上所 述，可以容许某种程度的错配。因此，主题的发明的探针序列包括对所述序列的突变(一个和多个两种)、缺失、插入，和它们的组合，其中所述突变、插入和缺失允许与感兴趣的靶多 核苷酸形成稳定杂合体。突变、插入和缺失可以在给定的多核苷酸序列中以多种方式产生， 并且这些方法是本领域普通技术人员已知的。其他方法可能在未来逐渐为人所知。PCR技术。聚合酶链式反应(PCR)是一种重复性、酶促、引物引导的核酸序列合 成。这种方法是公知的，并且是本领域技术人员普遍使用的(参见Mullis，美国专利第 4，683，195,4, 683，202 和 4，800, 159 号；Saiki 等，1985)。PCR 基于对感兴趣的 DNA 片段的 酶促扩增，所述DNA片段由两个寡核苷酸引物在侧翼包围(flanked)，所述两个引物与靶序 列的相对序列杂交。优选地所述引物的方向为3'端彼此相对。模板热变性、将引物与它 们的互补序列退火和使用DNA聚合酶延伸退火的引物的重复循环导致由PCR引物5'端限 定的区段的扩增。每个引物的延伸产物可以充当模板用于另一引物，所以每个循环基本上 使前一循环中产生的DNA片段的量翻倍。这导致特定靶片段以指数积累，在数小时中高达 几百万倍。通过使用热稳定性DNA聚合酶例如Taq聚合酶(其分离自嗜热细菌水生栖热菌 (Thermus aquaticus))，可以使扩增过程完全自动化。可以使用的其他酶是本领域技术人 员已知的。示例性的DNA序列，或它的区段，可以用作引物用于PCR扩增。在PCR扩增的进行 中，可以容许引物和模板之间某种程度的错配。因此，对示例引物的突变、缺失和插入(特 别是向5'端添加核苷酸)落入主题的发明的范围之内。可以通过本领域普通技术人员已 知的方法在给定的引物中产生突变、插入和缺失。基因和蛋白质的修饰。主题的基因和蛋白质可以与其他基因和蛋白质融合以产生 嵌合的或融合的蛋白质。根据主题的发明有用的基因和蛋白质不仅包括具体示例的全长序 列，还包括这些序列的部分、区段(segment)和/或片段(包括连续的片段和相较于全长分 子的中部和/或末端缺失)，它们的变体、突变体、嵌合体和融合物。主题的发明的蛋白质 可以具有经取代的氨基酸，只要它们保留了期望的功能性活性。“变体”基因具有编码与示 例蛋白质具有等效或相似活性的相同蛋白质或等效蛋白质的核苷酸序列。术语“变体蛋白 质”和“等效蛋白质”是指这样的蛋白质，其与示例蛋白质具有相同或基本上相同的针对目 标底物的生物学/功能性活性和等效序列。如用于本文，提及的“等效”序列是指具有氨基 酸取代、缺失、添加或插入的序列，所述取代、缺失、添加或插入使活性改进或对活性没有程 度显著的负面影响。保有活性的片段也包括在这个定义中。与示例蛋白质的相应片段保留 相同或相似功能或活性的片段或其他等效物也在主题的发明的范围内。以氨基酸取代或添 加为例的变化可以出于多种目的来进行，例如增加(或减少)蛋白质的蛋白酶稳定性(在 实质上/本质上未减少该蛋白质的功能性活性)，去除或添加限制位点，等等。基因的变异 可以使用例如制造点突变的标准技术容易地构建。此外，美国专利第5，605，793号，例如，描述了通过在随机或聚焦片段化(focused fragmentation)之后使用DNA再装配来生成额外的分子多样性的方法。这可以称作基因 “改组”，其通常包括混合两种或多种不同DNA分子的(期望大小的)片段，然后是重复的变 性循环。这能够改进由初始基因编码的蛋白质的活性。结果是具有改进的活性、改变的底 物特异性、增加的酶稳定性、改变的立体特异性(stereospecificity)或其他特征的嵌合 蛋白。“改组”可以在获得和检验了感兴趣的蛋白质的原子3D(三维)坐标和晶体结构之后设计并指定目标(target)。由此，“聚焦改组”可以定向于某些对于修饰而言理想的蛋白 质区段，例如表面暴露的区段，并且优选不是参与蛋白质折叠和关键3D结构完整性的内部 区段。可以使用变体基因来产生变体蛋白；重组宿主能够用于产生变体蛋白质。使用“基 因改组”和其他技术，能够构建等效基因和蛋白质，其包含具有本文示例的任何序列的某些 连续残基(氨基酸或核苷酸)的某些区段。这样的技术可以进行调整以获得等效的/功 能上有活性的蛋白质，所述蛋白质具有，例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169 和 170 个对应于任何示例的或建议的序列中(相同大小的)区段的连续氨基酸残基。编码这些区 段的多核苷酸，特别是对于感兴趣的区域，也包括在主题的发明中，并且能够用作探针和/ 或引物，特别是用于保守区域。全长基因的片段可以按照标准流程使用可以通过商业途径获得的核酸外切酶或 核酸内切酶制备。例如，酶如Bal31或定点诱变可以用于系统性地从这些基因的末端切割 核苷酸。同样，编码活性片段的基因可以使用多种限制酶来获得。可以使用蛋白酶来直接 获得这些蛋白质的活性片段。如本文所公开的，能够被截短并且仍然保留功能性活性的蛋白质在本发明的范围 内。“截短的蛋白质”是指可以将蛋白质的一部分切下，同时剩余的截短的蛋白质在切割之 后保留并且展现期望的活性。切割可以通过多种蛋白酶来实现。另外，有效切割的蛋白质可 以使用分子生物学技术来产生，其中通过用限制性内切核酸酶消化或本领域技术人员可用 的其他技术将编码所述蛋白质的DNA碱基去除。截短之后，可以将所述蛋白质在异源系统 例如大肠杆菌、杆状病毒、基于植物的病毒系统、酵母等中表达，并且再如本文所述置于昆 虫测定法中来测定活性。本领域公知能够成功地产生截短的蛋白质，如此它们保留功能性 活性，同时小于完整的全长序列。例如，B. t蛋白可以以截短的(核心蛋白)形式使用(参 见，例如，H0fte等(1989)，和Adang等(1985))。如本文所使用，术语“蛋白质”可以包括功 能上有活性的截短物(truncation)。在一些情况下，特别是对于在植物中的表达，使用表达截短的蛋白质的截短的基 因可能是有利的。优选的截短的基因会通常编码全长蛋白质的40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99%。主题的发明的某些蛋白质已经在本发明具体示例。由于这些蛋白质对主题的发 明的蛋白质的示例，应该很容易明白主题的发明包含具有与示例蛋白质相同或相似的活性 的变体或等效蛋白质(和编码其等效物的核苷酸序列)。等效蛋白质会与示例蛋白质具有氨基酸相似性(和/或同源性)。氨基酸同一性将通常是至少60%，优选至少75%，更优 选至少80%，甚至更优选至少90%，并且可以是至少95%。主题的发明的优选的蛋白质也 可以按照更具体的同一性和/或相似性范围来限定。例如，如与本文示例的或建议的序列 相比，同一性和 / 或相似性可以是 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。以上所列的任何数字可以用于限定上限和下限。除非另有指定，如用于本文，两个核酸的百分比序列同一性和/或相似性的测定 使用Karlin和Altschul，1990的算法，如Karlin和Altschul 1993中进行修改。这样的算 法被纳入了 Altschul等，1990的NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸检索使用NBLAST程 序进行，得分(score) = 100，字长(wordlength) = 12。缺口 BLAST (Gapped BLAST)可以如 Altschul等，1997中所述来使用。当应用BLAST和缺口 BLAST程序时，使用各程序(NBLAST 和XBLAST)的缺省参数。参见NCBI/NIH网站。为了获得缺口比对来用于比较的目的，采 用缺省参数使用了 Vector NTI Suite 8(InforMax, Inc.，NorthBethesda, MD, U. S. Α.)的 AlignX功能。这些为15的缺口产生罚分(Gapopening penalty)，6. 66的缺口延伸罚分 (Gap extension penalty)禾口 8 的缺□分隔罚分范围(Gap separation penalty range)。也可以改变蛋白质的多种性质和三维特性而不负面影响蛋白质的活性/功能性。 不负面影响分子的活性和/或三维构型的保守氨基酸取代是可以容忍/进行的。氨基酸可 以归为以下类别非极性、不带电的极性、碱性和酸性。将一种类别的一个氨基酸用同种类 型的另一氨基酸替代的保守取代属于主题的发明的范围，只要所述取代不会不利于化合物 的生物学活性。表2提供的是属于各个类别的氨基酸的实例列表。
权利要求
1.一种转基因植物细胞，其包含编码具有膦丝菌素乙酰转移酶活性的蛋白质的多核苷 酸，其中所述多核苷酸于65°C在6XSSC的条件下与编码SEQID NO 4的核酸探针的完整互 补体杂交，且其中所述植物选自下组芸薹、大豆、棉花、辣椒和稻。
2.—种转基因植物，其包含编码具有膦丝菌素乙酰转移酶活性的蛋白质的多核苷酸， 其中所述蛋白质与SEQ ID NO :4至少95%相同，且其中所述植物选自下组芸薹、大豆、棉 花、辣椒和稻。
3.权利要求1的植物细胞，其中所述植物细胞还包含AAD-12基因。
4.权利要求2的植物，其中所述植物还包含AAD-12基因。
5.包含多个权利要求1的植物细胞的植物。
6.一种使用DSM-2基因作为选择性标记的方法，所述方法包括下述步骤向多个植物细胞提供载体以供表达，将细胞在培养基中培养，将细胞暴露于膦丝菌素，并确定细胞是否因为所述载体中多核苷酸的表达而对膦丝菌素具有抗性，其中所述植物细胞选自下组芸薹，大豆，棉花，烟草，辣椒和稻细胞，所述载体包含在所述植物细胞中可操作的启动子，且所述多核苷酸可操作地连接于所 述启动子，其中所述多核苷酸编码具有膦丝菌素乙酰转移酶活性的蛋白质，且其中所述多 核苷酸于65°C在6XSSC的条件下与编码选自下组的氨基酸序列的核酸探针的完整互补体 杂交=SEQ ID NO 2 和 SEQ IDNO :4。
7.权利要求6的方法，其中所述蛋白质与SEQID NO :4至少95%相同。
8.权利要求6的方法，其中所述载体还包含第二多核苷酸，其编码第二目标蛋白质。
9.权利要求8的方法，其中所述第二目标蛋白质是杀昆虫蛋白质。
10.权利要求9的方法，其中所述杀昆虫蛋白质是杀昆虫的Cry蛋白。
11.权利要求6的方法，其中所述方法包括选择包含所述载体的植物细胞，使所述多个 细胞在允许表达所述多核苷酸的细胞生长而杀灭不包含所述载体的细胞或抑制其生长的 除草剂浓度中生长，且其中所述除草剂包含膦丝菌素分子。
12.权利要求11的方法，其中所述除草剂选自下组双丙氨酰膦和草铵膦。
13.权利要求11的方法，其中所述方法包括鉴定、选择并再生包含所述载体的植物细胞。
14.权利要求2的植物的种子。
15.权利要求1的植物细胞，其中所述细胞还包含来源于选自下组的生物的昆虫抗性 基因苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、光杆状菌属(Photorhabdus)和致病杆 菌属(Xenorhabdus)。
16.权利要求1的植物细胞，其中所述细胞还包括第二除草剂耐受基因。
17.权利要求2的植物，其中所述植物对第二除草剂耐受。
18.权利要求2的植物，其中所述植物包含第二除草剂耐受基因。
19.一种产生膦丝菌素-耐受植物细胞、植物及其后代的方法，其中所述方法包括将权 利要求1的植物细胞再生为植物，并从所述植物产生后代。
20.一种用于产生对谷氨酰胺合成酶抑制剂的除草剂活性耐受的植物的方法，所述抑制剂包括膦丝菌素或具有膦丝菌素模块的化合物，其中所述方法包括下述步骤a)产生权 利要求1的植物细胞，和b)从所述细胞再生植物，所述植物在其核基因组中包含所述多核苷酸。
21.一种增加田地中成组的栽培植物产量的方法，其中所述方法包括消灭所述田地中 的杂草，其中所述植物为权利要求2的植物，且其中所述杂草是通过施用包含谷氨酰胺合 成酶抑制剂作为活性成分的除草剂来消灭的。
22.一种用于产生权利要求1的植物细胞的纯培养物的方法，所述细胞在它们的核基 因组中并入了外源DNA，所述方法包括下述步骤i)用外源DNA转化植物细胞培养物中的起始植物细胞，所述外源DNA包含a)由所述起始植物细胞的聚合酶所识别的启动子，和b)包含所述多核苷酸的编码区；和 )通过将谷氨酰胺合成酶抑制剂以足以杀死未转化的植物细胞的浓度施用于所述植 物细胞培养物来选择转化的植物细胞，所述抑制剂包括膦丝菌素或具有膦丝菌素模块的化 合物。
23.权利要求6的方法，其中所述方法包括选择包含所述载体的植物细胞，其中所述方 法包括a)为多个植物细胞提供所述载体；和b)使所述多个细胞在允许表达所述多核苷酸的细胞生长而杀死缺乏所述载体的细胞 或抑制其生长的除草剂浓度中生长，其中所述除草剂包含膦丝菌素。
全文摘要
供表达除草剂耐受基因的构建体、相关植物和相关性状的组合，所述构建体包含本文中称作DSM-2的基因，其是在天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)中鉴定的(A3)。DSM-2蛋白远缘地与PAT和BAR相关。DSM-2可用作转基因性状以在植物细胞和植物中赋予针对除草性分子草铵膦(glufosinate)、膦丝菌素和/或双丙氨酰膦(Bialaphos)等的耐受性。本主题发明还涉及主题除草剂耐受作物(herbicide tolerant crop，HTC)性状同其他HTC性状和/或昆虫抗性(IR)性状的组合。
文档编号A01H5/00GK102118966SQ200980131214
公开日2011年7月6日 申请日期2009年6月11日 优先权日2008年6月11日
发明者利萨.W.贝克, 托尼亚.S.莫伊纳汉, 特里.R.赖特, 蒂莫西.D.海伊, 贾斯廷.M.利拉 申请人:陶氏益农公司