专利名称：对谷氨酰胺合成酶(gs)进行操作以改善高等植物中的氮利用效率和籽粒产量的制作方法
技术领域：
本发明总体而言涉及分子生物学领域。
背景技术：
氮(N)是植物从土壤中摄取的用于生长和发育的最丰富的无机营养元素。玉米的根以硝酸盐的形式从土壤中吸收大部分的N，并主要运输至叶中以进行还原和同化。硝酸盐在胞质溶胶中被硝酸盐还原酶(NR)还原为亚硝酸盐，然后亚硝酸盐被运输至叶绿体中，并在叶绿体中被亚硝酸盐还原酶(Ni 还原为铵。铵被谷氨酰胺合酶-谷氨酸合酶系统同化为谷氨酰胺(Crawford 和 Glass，(1998)Trends in Plant Science 3 389-395)。此外，长期以来已知大量的N会随着蒸发而从植物的地上部分损失(Glyan' ko, et al. ， (1980)Agrokhimiya 8 19-26 ；Hooker, et al. ， (1980)Agronomy Journal 72(5) 789-792 ；Silva, et al.，(1981)Crop Science 21(6) :913-916 ；Stutte, et al.，(1981) Crop Science 21 (4) :596-600 ；Foster, et al. , (1986)Annals of Botany 57(3) 305-307 ；Parton, et al. , (1988)Agronomy Journal 80(3) :419-425 ；Kamiji, et al., (1989)Japanese Journal of Crop Science 58(1) :140-142 ；Morgan,et al., (1989)Crop Science 29(3) :726-731 ；0 ' Deen, (1989)Agronomy Journal 81(6) :980-985 ；Guindo, et al. , (1994)Arkansas Farm Research 43(1) :12-13 ；Heckathorn, et al. , (1995) Oecologia 101 (3) :361-365 ；Cabezas,et al. ,(1997)Revista Brasileira de Ciencia do Solo 21(3) :481-487)。实验证据表明N是通过铵的形式而不是通过N氧化物的形式损失 (Hooker, et al.，1980)。用抑制谷氨酰胺合酶或谷氨酸合酶活性的化学品进行处理，会增加铵通过蒸发的损失(Foster，et al.，1986)。N的损失并不仅限于C-3植物，已报道C-4 植物也会通过蒸发而损失N(Heckathorn，et al.，1995)。一些独立的证据表明，谷氨酰胺合成酶(GQ与玉米的产量相关，并且其表达水平会影响玉米中的氮利用效率(NUE)。GS在植物细胞中主要执行两种功能(1)同化由生物合成过程中硝酸盐被还原为有机形式而产生的铵；和( 例如在种子萌发和叶衰老过程中， 当蛋白被活化作为氮源或能量来源时，同化由光呼吸作用、脱氨酶和谷氨酸脱氢酶产生的铵盐。胞质溶胶中的GS被称为GS1，质体中的GS被称为GS2。在最近的研究中(Martinet al. , (2006)The Plant Cell 18(11) :3252-74)，使用逆向遗传工程方法表明了 GS确实是玉米籽粒产量(grain yield)的两个因素即籽粒数量和籽粒重量的限制因子。更早的QTL作图实验也表明GS同工酶决定了产量和NUE(Gallais和Hirel，(2004) J Exp Bot. 55(396) 295-306)。在其他的实验中，两种位于1号染色体上的GS基因，其中包括一种在根中表达的基因，在N施用量为ImM和5mM时表现出与生物量的显著相关性(p = 10_4)(数据未示出)。 在叶衰老期，从资源组织(叶)到储存组织(发育中的籽粒)(sink tissue)中都会发生N 的再活化(remobilization)。蛋白质降解为氨基酸，所述氨基酸再通过韧皮部被运输至储存组织。在玉米成熟期时，籽粒蛋白占植物总含氮量的约60-70%，这意味着仍有30-40% 的N保留在植物的茎叶中。本发明致力于在不同启动子的控制下在玉米中超表达胞质溶胶GS同种型，从而改善NUE并由此改善籽粒产量。发明概述本发明提供了本发明的GS序列的多核苷酸、相关多肽和全部保守性修饰变体。本发明提供了 GS基因的序列。识别了 6种拟南芥(Arabidopsis)GS基因、6种玉米GS基因、 4种水稻GS基因、3种高粱GS基因和8种大豆GS基因。表1列出了这些基因以及它们的序列标识号。表 1
序列标识号命名SEQ ID NO 1AT1G48470多核苷酸SEQ ID NO 2AT1G48470 多肽SEQ ID NO 3AT1G66200多核苷酸SEQ ID NO 4AT1G66200 多肽SEQ ID NO 5AT3G17820多核苷酸SEQ ID NO 6AT3G17820 多肽SEQ ID NO 7AT5G16570多核苷酸SEQ ID NO 8AT5G16570 多肽SEQ ID NO 9AT5G35630多核苷酸SEQ ID NO 10AT5G35630 多肽SEQ ID NO 11AT5G37600多核苷酸SEQ ID NO 12AT5G37600 多肽SEQ ID NO 13Gm0005x00111多核苷酸SEQ ID NO 14Gm0005x00111 多肽SEQ ID NO 15Gm0015x00387多核苷酸SEQ ID NO 16Gm0015x00387 多肽SEQ ID NO 17Gm0030x00147多核苷酸SEQ ID NO 18Gm0030x00147 多肽
权利要求
1.分离的多核苷酸，选自a.与选自SEQID N0:43、45、47、49、51和53的多核苷酸的全长序列具有通过使用默认参数的GAP算法测定的至少80%序列同一性的多核苷酸；其中所述多核苷酸编码具有GS 调节剂功能的多肽；b.编码选自SEQID NO :44、46、48、50、52和54的多肽的多核苷酸；c.选自SEQID NO :43、45、47、49、51和53的多核苷酸；和d.与(a)、(b)或(c)的多核苷酸互补的多核苷酸。
2.重组表达盒，包括权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在有义方向上与启动子可操作地连接。
3.宿主细胞，包括权利要求2所述的表达盒。
4.转基因植物，包括权利要求2所述的重组表达盒。
5.权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物为单子叶植物。
6.权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物为双子叶植物。
7.权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、 小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、黍、花生、柳枝稷、芒草、黑小麦和可可。
8.来自权利要求4所述的转基因植物的转基因种子。
9.调节植物中的GS的方法，所述方法包括下述步骤a.将重组表达盒引入植物细胞中，所述重组表达盒包含与启动子可操作地连接的权利要求1所述的多核苷酸；b.在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；以及c.从所述植物细胞再生植物；其中所述植物中的所述GS被调节。
10.权利要求9所述的方法，其中所述植物选自玉米、大豆、苜蓿、大麦、油菜、可可、棉花、黍、芒草、花生、水稻、黑麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦和小麦。
11.降低植物细胞中GS酶多肽活性的方法，包括a.提供包含SEQID N0:43、45、47、49、51和53的互补体的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；b.提供具有包含SEQID NO :43、45、47、49、51和53所示序列的mRNA的植物细胞；c.将步骤(a)的核苷酸序列引入所述植物细胞中，其中所述核苷酸序列抑制所述mRNA 在所述植物细胞中的表达。
12.权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
13.权利要求12的方法，其中所述单子叶植物为玉米、大豆、苜蓿、大麦、油菜、可可、棉花、黍、芒草、花生、水稻、黑麦、高粱、甘蔗、柳枝稷、黑小麦或小麦。
14.权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
15.权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物中所述GS酶活性得以提高。
16.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有提高的幼苗活力。
17.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物的抽丝增强。
18.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物在根中具有增强的氮同化作用。
19.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有提高的每株植物的种子数。
20.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有增高的种子大小和质量。
21.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物的种子中胚的大小增加。
22.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物在叶中具有增强的氮同化作用。
23.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有增加的穗大小。
24.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物具有增强的氮利用效率。
25.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物在衰老期具有增加的氮再活化作用。
26.权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物在籽粒发育期具有增加的氮再活化作用。
全文摘要
本发明提供了蛋白GS的多核苷酸和相关多肽。本发明提供了GS基因的基因组序列。GS负责控制植物的氮利用效率。提供了谷氨酰胺合酶序列，用于改善籽粒产量和植物生长。本发明还提供了重组表达盒、宿主细胞和转基因植物。
文档编号A01H5/00GK102197137SQ200980143100
公开日2011年9月21日 申请日期2009年10月28日 优先权日2008年10月30日
发明者卡恩沃帕尔·杜卡, 拉杰乌·库帕塔 申请人:先锋国际良种公司