专利名称：大黄鱼β-肌动蛋白启动子序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种启动子，尤其是涉及一种大黄鱼β -肌动蛋白(beta-actin)启动 子序列及其应用。
背景技术：
Beta-肌动蛋白的5，端调控序列(英文名Beta-actin 5，-regy Iatory sequence)。肌动蛋在真核生物中广泛存在，是构成肌小节和细胞骨架的主要成分([1] SHETERLINE P, SPARROWJ. Protein profile actin[Μ]. London =London Academic Press。 1994 1-62)。单体肌动蛋白为球蛋白，一般由375 377个氨基酸残基组成，分子量约为 42000。肌动蛋白具有重要的生理功能，几乎参与了真核细胞的所有生理过程([2]TOLCH M D。 H0LTZMAN D A, DRMBIND G. The yeast actin cytoskcleton[J]. Cμ rr Opin Cell Biol, 1994,6 110-119 ； [3]STAIGERC J, SCHLIffA M. Actin localization and function in higher plants [J]. Protoplasm, 1987,141 :1-2)，如细胞分裂、染色体运动、细胞器运 动、细胞激化、胞质流动等。高等动物细胞内的肌动蛋白分为α，β，Y三类([4]MIWA Τ, MANABE Y, KMROKAffA K, et al. Str μ ct μ re, chromasome location, and expression of the human smooth my scle (enteric type) - y -actin gene :evol μ tion of six human actin genes [J], Mol Cell Biol, 1991,11 =3296-3306) 肌动蛋白非常保守，各种生物间 氨基酸序列的同源性(Identity)高达 70% 以上([5] HM S. YAN L. Actin ande μ karyotic evoly tion[J].Acta Zoolngi—Ca Sinica. 1999. 45 :440_447)，在鱼类中 β-肌动蛋白的 同原性更高。自20世纪80年代Perler建立了氨基酸取代与保守蛋白基因进化年代的线性 关系后，β-肌动蛋白作为一种进化上的分子标记被广泛采用([6]PERLER F,EFSTRATIADIS A,LOMEDICO P,et al. The evolμ tion of genes :the chicken preproins μ Iin gene[J]· Cell,1980, 20 555~566 ； [7]HWANG G，RAHMAN M A，RAZAK s，et al.Isolation and characterization oftilapia β —actin promoter and comparison of its activity with carp β-actin promoter[J]. BiochimieaBiophysiea Acta, 2003,1625 :11_18 ; [8] TAKAGI S, SASADO T, TAMIYA G,et al. An efficientexpression vector for transgenic medaka constr μ ction [J]. Mol Mar Biol Bioteehnol，1994，3 :192-199 ; [9] w μ J，LIM T, HE F. A discussion about the genesis and existing significance of intronsin animal genes[J]. Acta Genefica Sinica, 1998，25 :409_415 ; [10]ZHOM R，LIM L，GM0Y，et al.Similar gone str μ ct μ re of two Soxga genes and their expression patterns d μ ring gonadaldifierenti · ation in a teleost fish, rice field eel(Monopter μ s alby s) [J]. Mol Reprod Dev，2003，66 (3) :211_217) β-actin启动子序列能高效，稳定，广 泛的启动活性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供大黄鱼肌动蛋白启动子序列。
本发明的目的之二在于提供大黄鱼肌动蛋白启动子的克隆方法。本发明的目的之三在于提供大黄鱼肌动蛋白启动子的应用。本发明所述大黄鱼β -肌动蛋白启动子序列为CTGGGCCCACCTTTTTTAATTTATTTATATTTCCTTATCACAGAAATGCAGCTTTATCATGAATTTAAA GTTTTAGGGCTGACAGGTTACACAGGTACAAATAAAGTTTGAGATTTGACCCTTAATGGTGCGATTAAAGACCTGTA AATCAATAAGTGGGCCCAGTAGACCTTTGGTCCCCCTTCCTCATGTCCATAAACTAACTGAGAGCGTCTATATGAGC ACAGAGTCAAACTCAAGATCTGAAATATGTTACACAAGTCATTGTCAGCTTTCCACATGATAAAAGTCACTGAGGTG ACTCTAATTTAAAGGGGGGAGGTCACACGACAACAATAATGTCCTTTTAAAGTCAACTGCAACAGCATGAATGAACACGAGGAAAAGAAGAAAGAGAG AGAGAAAAAAACTGATACATAGGAGTTGATGCAACTGAGAGGAAAGGGAAGTGGTAAAGGAGGAACAGAAGAAGTT GCTGAATGTCTCAGGGTGTGCAGTTAAAGCTTTTAAATGGCACCGAGGGCCGCCCAGTCATTCAAACACTCATGG TTTAGGGGCATAAAACGTATAAAAGTGTGCGCCAGATGTTATATATTAAAAGAAAGATGGGTAGAAGATAGATGG TGGACGTATGGGAGAGGTGGGAAGGGGCTTAAAGAAAGAAGAAATTCATTTCACTGCAGCATAATTAATGATAATGATTTAGTGAATCAAGAATGTA AATTTTTTACAAGCCTAGCCTAAAAATCTTTAGTCTGAGATTGTGTCACATGGGCCTCATTAGTCAGGATGTGAATG CCCCCCAAtGCTTTCCACTTTTACGGTaATGCAGCACAATCAGGAAGTGGTACTAGGAGTGGTGTGTGTCTTATGTG TGTGTTTTATTTAATAAAGAGATGTTAAACCAAGGAGATAAAGGCCAGCACGTCCTGTTTCATGACATAGCCATATGATTGAACGGTGGCTGAAAC AGCAACTGAAAACCCCTGGGGTACTTTCACTCATCTAAGAAGAGGGTAAACTCTCCTTTTAACACAACATCTAGTGC ACTGCAAGCAGTCCATGCTACCAAATAACATCCTGTATCTGAAGGCAGTGAACGAGCAGAGATATTCAGGAGGACAT GTGGCCACAAAGCACAAATACTTGATCAATAAATCAACATTATCAGCGAGCTGGCCTACAGTAAGTGCCTCAGCCTG TGTCTTAGCCTGTGGCAGCTTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTATGTATGTCATGTGTTTGACCCGGTGATGCA GTCCCA CTGAACTGTTTTTTGTTGTTTTTTTCAAAGCAACATCAGCATCAACACCAACAACCTACTGTCATGTCTG AAATACATCAAATAATGTGAGATTAATTAAGATATAGGCTTTAGGACGACAGCAGGGAGGAGTCCTGGGTGCAAAGC TCTTCCAGTTATCATAGAAGTATGAGTCTTAGAGCAGGTGCAGGCAGGCGCGTTCACACGTATTAAAGTTTATATAT CATTTAAAATGTATATAACACAGTATATGAAGAGATTAAGCTCACTAGGCCT CACAGCATCAATCCCTTCCCTCTTCTTCTCTCCAATCCTTCGCTATCATCGCCTCCCTCTCTCTCTCTG TCCCTCAAATCGCGAGCGCCCAGTGCACCACAGCGTGCACGCGACGTGCCCCAGTGCATGACGCCGGACCAATCAGAGAGCGC CATTCCGAAAGTTTACCTTTTATGGCTAGAGCCGGGCAACTGACGCGGTATAAAAGGCGAGCGCCCACAGCCAACA GATTCACTCTGAGCGCCGTCACACGCAGCTTTGTGCGGGATATCATTTGCCTGAAACCGGTTCCCTTAAAGCGAAAAGCCCCCCCA CCCAAAGGTAAGAAGGACTGAAAACATTTGCATTTTTCTAATTTTGGAACGATATTCATCAAGTAAACAATGAGTTG AGTTGTTTTTTGACTGTAGCCGTTGACGAAATTTGTGAATTTGAATATAAAAGATGGCGTGGACCACGAGGGTCTTT GTCTTGGCATTACACCACTGTACTGCTAATTTAAATTAAATTTAAAAAAAGATGTAATGATTAAAAACTGTCAGATT CTGCTTGTCTTATAATGAATGCAGTATTAACGATCAGAAACCGTTATTAACCGTTGCCATTAACTGGCGACAGGTGC CTTTTTTTTTTTACCGGCTTATAATAATGAAAGTGAACGTTCGTCTACAAATTAGACTGTCAGCGTGTAGTTGTGCA ACATTTTGCTGTCTTACCTCCTTCCCCCTCCTCCACCTCTTCCACCCAAGCAAGTATTTAGTTTTTGAAAGAGGCTT TTGAGTTGAGGTCGTCTGGATCCCGGCTGCTCCCTCCTTTGTGCGCCCGATGCGGCGGGGTGTGACCTACTTTAGCATATTAGCCTAGCCACGCCAGGCTAaCGCCGCCcTTCAGACtTTGAAGCAAAATACTAAAAACAAGATTtCCTcCCTT CATGCACACTGGAGGGAGGCTCTTTAAATGCCTCAtTTTCTTAAGAATAATTCATTCACTTTTAAAGTGGAAGTCTT TATAAAGACTCAAGTACATGAGGCCTCTAAAAAAAAAGCACTAATTGTTTAAACTAACAAACGGTTTTGCTGTGATT TTGTCTTTTCACGGCTCACTTGTAAAAAAAAAAAAAGGGTAAATTTCGAGTGACTACTCTTTTAGAAAAGGCGTGGC TTTCAGGAAATGGGAGCATCAGTCAAGGACTTGTGACCATTCATGAGTCAACACGAGTTCATTATGCAACTTTTTAT TTCTCTCTCTCATAACGCAACCCCCAACGGCTGATTTTTGAAAAATGTCCGTTACAGCCTGGCAGCGGTGTCAATGA ATGAAAGCGGCTGGTTATGACGCAGTGGTATTGAAGCGAGGCGTTCTTGTCGGGTATCAAACCCCAGTGATTGAGCA ACAATAGGAGGGTGGGGTGGTTGGGGGGTGGGGGGGGTATATCTGGAGGAAGTTAACTGTAGTGGGAGTGGTCGCGA GGCGCCGGGTCTGATAATGTCGAATGTACGCTCTGGCCGCGCGCCATGGCGCCGGTAGCCGCAAAGCTGCTCAAAGC CCGAACCATGTCCTTATATGGTAATAACAGAATGCAGCGCCACTTTTTGTCTGGCTTCGCGCGGAATGTGGCGGCAC GAGCGCCACCCAGTGGTTGAGCGCGTGAACTGCCTTTAGGATTTTTTATTTTTTTTAAACAGGAAGTGGGAGCTCGA GTCGGGCTGATGTTGGGAGGAAGTGAATGTAAGACTCTTTGCAGTGTCTTTAACGGGTTTTTGTTTTTTGTCTTATC AACAGTTCAGCC。本发明所述大黄鱼β-肌动蛋白启动子的克隆方法，包括以下步骤一、大黄鱼beta-actin 5，调控序列分离1)米用 Clontech 公 司(www. Clontech. com)的 Genomeffalker Universal Kit (CatalogNo. 638904)构建酶(Dra I，EcoR V, Pv μ II & St μ I)四个 DNA 核酸内切酶 库；具体操作为(1)基因组纯度分析A 取1 μ 1基因组DNA在0. 6 %的琼脂糖凝胶上电泳；B:用 Dra I 酶去试切，体系为5 μ 1 实验基因组 DNA，1. 6 μ 1 Dra Ι，2μ1 IOXDra I 1311 61~，11.4“1双蒸馏无菌!120，总体系为2(^1 ；(2)基因组酶切消化A 标记5个1. 5ml的EP管DL1，DL2，DL3，DL4和一个阳性对照；B 加入酶切体系，组分为25μ 1基因组DNA(0. lyg/μ 1)，8μ 1限制内切 酶(lOunits/μ 1)，10μ 1限制内切酶buffer (10 X)，57 μ 1双蒸馏无菌H2O,总体系为
100μ 1 ，
C轻柔混合均勻，并瞬时离心，37°C消化2h ；
D低速涡旋5 IOs并瞬时离心，37度。C过夜消化；
(3)基因组纯化。
A在每一个反应管中加入等体积的苯酚；
B低速涡旋5 IOs并瞬时离心；
C把上层水相转移至另外一个1. 5ml EP管中，并加入等体积的氯仿；
D低速涡旋5 IOs并瞬时离心，转移上层水相至另外一个新的EP 1豪中，并向水相中加入2倍体积冰冷的95%的乙醇，1/10体积的乙酸钠(PH = 4. 5)和20 μg的糖苷
E低速涡旋 5 IOs 并离心(14000rpm, 15min，4°C )；
F弃上清并用100 μ 1冰冷的80%乙醇洗涤，离心(14000rpm，10min,4°C )
G弃上清并在空气中干燥后用20 μ 1 ΤΕ(10/1ρΗ = 7. 5)溶解；
7
(4) Adaptor连接到消化后的基因组上A 连接体系4 μ 1消化并纯化后的基因组DNA，1. 9 μ 1 Genome Walker Adaptor (25 μ Μ)，1· 6 μ 1 连接 buffer (10 X)，0· 5 μ 1 Τ4 DNA 连接酶(6units/ μ 1)；B:连接条件16°C过夜连接；C 终止连接条件70C 5min ；D 加入:75μ 1 TE (10/1 ρΗ = 7. 5)；2)采用两轮toy ch-down-PCR方法克隆出5，-端序列，具体步骤与Genome Walker MniversalKit 一致，具体步骤如下(1)第一轮 to μ ch-down PCR 体系
a 第一轮 PCRmix 配置40 μ 1无菌双蒸馏水；5μ 1 IOXAdvantage 2 PCR buffer (clontech Advantage2 PCE Enzyme System)；1 μ 1 dNTP (每个 IOmM) (clontech Ad碰tage2 PCE Enzyme System)；1μ 1 API (10 μ Μ)；1 μ 1 Advantage 2 Polymerase mix (50 X) (clontech Advantage2 PCK Enzyme System)；1 μ 1 基因特异的 Primer (GSPl)；1 μ 1 酶切文库 DNA ；总体系50μ1;b:PCR 程序7 个循环 940C 25s 72°C 3min ；32 个循环 94°C 25s 67°C 3min 67°C 7min ；(2)第二轮to μ nch-down PCR组分以第一轮的PCR产物为模板，槽式引物(AP2 和GPS2)体系跟第一轮一样；程序5个循环 94°C 25s 72°C 3min ；20 个循环 94°C 25s 67°C 3min 67°C 7min ；二、扩增出来的PCR产物连接到pMD18T-Simple vector (TaKaRa)进行回收并测序。(Invitrogen 上海)本发明所述大黄鱼β-肌动蛋白启动子的应用如下。1)大黄鱼β-肌动蛋白启动子可以应用于外源基因真核表达。2)大黄鱼β-肌动蛋白启动子可以应用于转基因鱼以及转基因“全鱼”。本发明的突出优点和技术效果如下本发明克隆的大黄鱼肌动蛋白启动子具有启动活性强，能够恒定广泛地表达 于各个组织的优点，所使用的克隆技术稳定可靠。
图1为转染有大黄鱼β-肌动蛋白启动子驱动的报告基因(绿色荧光蛋白)EPC细 胞荧光和对应的光镜图。在图1中，A为转染有大黄鱼β-肌动蛋白启动子驱动的报告基因 (绿色荧光蛋白)EPC细胞荧光图(10Χ) ；B为转染有大黄鱼β-肌动蛋白启动子驱动的报 告基因(绿色荧光蛋白)EPC细胞光镜图(10Χ) ；pEGFPl-beta-actin-pro质粒转染入草鱼EPC细胞系中，草鱼EPC细胞接入24孔细胞培养板(1 X IO5个/ml)，过夜培养后，把0. 4 μ g 的质粒和1 μ 1的LipOfectamineTM2000 (Invitrogen)转染试剂混合(具体方法按照转染试 剂说明说进行)加入到24孔板中，4h后更换新鲜L15 (5% FBS)培养基；转染后48h倒置荧 光显微镜下观察。图2为不同浓度的LPS和Poly(I:C)刺激转染有大黄鱼beta-actin启动子驱动的 荧光素酶活变化。在图2中，大黄鱼beta-actin启动子插入到无启动子载体pGL-3-Basic 中，构建好的载体pGL-3-Basic-beta-actin-pro (0. 4 μ g/孔)转染草鱼EPC细胞，24h后 加入脂多糖(LPS) 1 μ /ml 禾口 2 μ g/ml 和病毒 RNA 模拟物 poly (I C) 100ng/ml 和.1 μ g/ml 进行刺激；24h后收获细胞并进行酶活性测定，其中质粒pSV-ii-GalactosidaseO). 2μ g/ 孔)与pGL-3-Basic-beta-actin-pro共转染进入EPC细胞作为内参，M为没有刺激转染 有beta-actin启动子载体的EPC细胞，LPS-I用1 μ g/ml LPS刺激转染有beta-actin启 动子载体的EPC细胞，LPS-2用2 μ g/ml LPS刺激转染有beta-actin启动子载体的EPC细 胞，poly(I:C)-100，用 100ng/ml poly(I:C)刺激转染有 beta-actin 启动子载体的 EPC 细 胞，poly (I: O-I用1 μ g/ml poly (I: C)刺激转染有beta-actin启动子载体的EPC细胞； pGL-3-Basic空载质粒。
具体实施例方式pGL-3-Basic-lyc beta-actin-pro 禾口 pEGFP 1-lyc beta-actin-pro 构建1. Beta-actin 5，调控序列 PCR 扩增1)合成带有 Small (5‘ -AAGGTACCCTGGGCCCACCTTTTTTA-3‘)和 Kpn 1(5' -AAC CCGGGAATCTGTAGTTTTAATTCATTGTG-3 ‘)核酸内切酶位点。用 Clontech 保真酶 Platin μ m Taq polymerase High Fidelity 进行 PCR 扩增。体系为10XHighFidelty PCR buffer :5μ 110-mM dNTP mixt μ re 1 μ 150mMMgS04 :2μ 1primer Mix(IOmM) 1 μ 1Genomic DNA template (100ng/ul) 0. 5μ 1Platin μ m Taq High Fidelity :0·2 μ 1 (6units/μ 1)无菌双蒸馏水至50 μ 1反应条件为95°C2min。2)用胶回收试剂盒(Promega 100次)，进行PCR回收。3)回收后的PCR产物和无启动子的空载(PEGFPl(Clontech)/ pGL-3-Basic (Promega))进行双酶切(Kpnl 和 Small)，37°C过夜。4)再胶回收酶切产物，并16°C过夜。连接体系1μ 1 双酶切后的空载(pEGFPl (Clontech)/pGL-3-Basic (Promega))7. 5μ 1双酶切后的PCR产物片段1μ 1 连接酶 buffer (IOX) 0. 5 μ 1 T4DNA 连接酶(6units/ μ 1) 5)挑取阳性单克隆，用小量质粒试剂盒(Promega)提取质粒，并双酶切鉴定和测序。2.细胞转染，酶活分析和荧光显微镜观察1) 1 X IO5个/ml 500 μ 1 EPC细胞接种于24孔细胞培养板(Costar)上，于生化培 养箱25 °C过夜培养。2) A 对于 Luciferase 酶活分析，构建好的质粒(pGL-3-Basic-actin-pro) 0. 4 μ g 以及内对照质粒(pSV-beta-galctosidase) 0. 1 μ g，用 Lipofectamine 2000 转染试剂 (Invitrogen)共转染进入EPC细胞，pGL-3-Basic同时转染作为阴性对照。对于荧光观察， 0. 4 μ g pEGFPl-actin-pro 质粒转染进 EPC 细胞。B :4h后把培养基换成新鲜完全培养基(5 % (Clontech)胎牛血清 L15 (Invitrogen)培养基)。C:在转染 24h 后，加入 LPS (Sigma)和 Poly (I: C) (Invitrogen)刺激剂于转染有 Iuciferase报告基因的EPC细胞中。4)转染48h后收获细胞或者荧光显微镜观察。对于Iuciferase酶活测定，步骤参 考Iuciferase酶活分析试剂盒(Promega Catalog μ e No. E4030)已经半乳糖苷酶活分析 试剂盒(Promega Catalog μ e No. E2000)方法。具体步骤为A 用1 XPBS洗涤转染48h的EPC细胞两次，尽量吸干剩余液体。B:加入 160μ1 IXReporter Lysis Buffer 于孔中，常温裂解 15min，并摇动几 次。C:吹打细胞裂解液，转移至1.5ml的EP管中，振荡15s并12000g常温离心15s。D 取上清用于Iuciferase酶活和半乳糖苷酶活性测定。对于分析Luciferase酶活性，取20 μ 1步骤D中上清加入100 μ 1 Iuciferase酶 底物，振荡混合立即用luminatOer20/20进行检测。对于分析半乳糖苷酶活性，去100 μ 1步骤D中上清，再加入50 μ 1 IXReporter LysisBuffer0加入150 μ 1半乳糖苷酶底物，37度反应30min，取出立即加入IM Na2CO3取100 μ 1 反应液于分光光度计上测定吸光值(0D420)。5) Luciferase酶活性用用半乳糖苷酶的活性校正(每个样品重复3次)。
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权利要求
大黄鱼β 肌动蛋白启动子，其序列为CTGGGCCCACCTTTTTTAATTTATTTATATTTCCTTATCACAGAAATGCAGCTTTATCATGAATTTAAAGTTTTAGGGCTGACAGGTTACACAGGTACAAATAAAGTTTGAGATTTGACCCTTAATGGTGCGATTAAAGACCTGTAAATCAATAAGTGGGCCCAGTAGACCTTTGGTCCCCCTTCCTCATGTCCATAAACTAACTGAGAGCGTCTATATGAGCACAGAGTCAAACTCAAGATCTGAAATATGTTACACAAGTCATTGTCAGCTTTCCACATGATAAAAGTCACTGAGGTGACTCTAATTTAAAGGGGGGAGGTCACACGACAACAATAATGTCCTTTTAAAGTCAACTGCAACAGCATGAATGAACACGAGGAAAAGAAGAAAGAGAGAGAGAAAAAAACTGATACATAGGAGTTGATGCAACTGAGAGGAAAGGGAAGTGGTAAAGGAGGAACAGAAGAAGTTGCTGAATGTCTCAGGGTGTGCAGTTAAAGCTTTTAAATGGCACCGAGGGCCGCCCAGTCATTCAAACACTCATGGTTTAGGGGCATAAAACGTATAAAAGTGTGCGCCAGATGTTATATATTAAAAGAAAGATGGGTAGAAGATAGATGGTGGACGTATGGGAGAGGTGGGAAGGGGCTTAAAGAAAGAAGAAATTCATTTCACTGCAGCATAATTAATGATAATGATTTAGTGAATCAAGAATGTAAATTTTTTACAAGCCTAGCCTAAAAATCTTTAGTCTGAGATTGTGTCACATGGGCCTCATTAGTCAGGATGTGAATGCCCCCCAAtGCTTTCCACTTTTACGGTaATGCAGCACAATCAGGAAGTGGTACTAGGAGTGGTGTGTGTCTTATGTGTGTGTTTTATTTAATAAAGAGATGTTAAACCAAGGAGATAAAGGCCAGCACGTCCTGTTTCATGACATAGCCATATGATTGAACGGTGGCTGAAACAGCAACTGAAAACCCCTGGGGTACTTTCACTCATCTAAGAAGAGGGTAAACTCTCCTTTTAACACAACATCTAGTGCACTGCAAGCAGTCCATGCTACCAAATAACATCCTGTATCTGAAGGCAGTGAACGAGCAGAGATATTCAGGAGGACATGTGGCCACAAAGCACAAATACTTGATCAATAAATCAACATTATCAGCGAGCTGGCCTACAGTAAGTGCCTCAGCCTGTGTCTTAGCCTGTGGCAGCTTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTATGTATGTCATGTGTTTGACCCGGTGATGCAGTCCCACTGAACTGTTTTTTGTTGTTTTTTTCAAAGCAACATCAGCATCAACACCAACAACCTACTGTCATGTCTGAAATACATCAAATAATGTGAGATTAATTAAGATATAGGCTTTAGGACGACAGCAGGGAGGAGTCCTGGGTGCAAAGCTCTTCCAGTTATCATAGAAGTATGAGTCTTAGAGCAGGTGCAGGCAGGCGCGTTCACACGTATTAAAGTTTATATATCATTTAAAATGTATATAACACAGTATATGAAGAGATTAAGCTCACTAGGCCTCACAGCATCAATCCCTTCCCTCTTCTTCTCTCCAATCCTTCGCTATCATCGCCTCCCTCTCTCTCTCTGTCCCTCAAATCGCGAGCGCCCAGTGCACCACAGCGTGCACGCGACGTGCCCCAGTGCATGACGCCGGACCAATCAGAGAGCGCCATTCCGAAAGTTTACCTTTTATGGCTAGAGCCGGGCAACTGACGCGGTATAAAAGGCGAGCGCCCACAGCCAACAGATTCACTCTGAGCGCCGTCACACGCAGCTTTGTGCGGGATATCATTTGCCTGAAACCGGTTCCCTTAAAGCGAAAAGCCCCCCCACCCAAAGGTAAGAAGGACTGAAAACATTTGCATTTTTCTAATTTTGGAACGATATTCATCAAGTAAACAATGAGTTGAGTTGTTTTTTGACTGTAGCCGTTGACGAAATTTGTGAATTTGAATATAAAAGATGGCGTGGACCACGAGGGTCTTTGTCTTGGCATTACACCACTGTACTGCTAATTTAAATTAAATTTAAAAAAAGATGTAATGATTAAAAACTGTCAGATTCTGCTTGTCTTATAATGAATGCAGTATTAACGATCAGAAACCGTTATTAACCGTTGCCATTAACTGGCGACAGGTGCCTTTTTTTTTTTACCGGCTTATAATAATGAAAGTGAACGTTCGTCTACAAATTAGACTGTCAGCGTGTAGTTGTGCAACATTTTGCTGTCTTACCTCCTTCCCCCTCCTCCACCTCTTCCACCCAAGCAAGTATTTAGTTTTTGAAAGAGGCTTTTGAGTTGAGGTCGTCTGGATCCCGGCTGCTCCCTCCTTTGTGCGCCCGATGCGGCGGGGTGTGACCTACTTTAGCATATTAGCCTAGCCACGCCAGGCTAaCGCCGCCcTTCAGACtTTGAAGCAAAATACTAAAAACAAGATTtCCTcCCTTCATGCACACTGGAGGGAGGCTCTTTAAATGCCTCAtTTTCTTAAGAATAATTCATTCACTTTTAAAGTGGAAGTCTTTATAAAGACTCAAGTACATGAGGCCTCTAAAAAAAAAGCACTAATTGTTTAAACTAACAAACGGTTTTGCTGTGATTTTGTCTTTTCACGGCTCACTTGTAAAAAAAAAAAAAGGGTAAATTTCGAGTGACTACTCTTTTAGAAAAGGCGTGGCTTTCAGGAAATGGGAGCATCAGTCAAGGACTTGTGACCATTCATGAGTCAACACGAGTTCATTATGCAACTTTTTATTTCTCTCTCTCATAACGCAACCCCCAACGGCTGATTTTTGAAAAATGTCCGTTACAGCCTGGCAGCGGTGTCAATGAATGAAAGCGGCTGGTTATGACGCAGTGGTATTGAAGCGAGGCGTTCTTGTCGGGTATCAAACCCCAGTGATTGAGCAACAATAGGAGGGTGGGGTGGTTGGGGGGTGGGGGGGGTATATCTGGAGGAAGTTAACTGTAGTGGGAGTGGTCGCGAGGCGCCGGGTCTGATAATGTCGAATGTACGCTCTGGCCGCGCGCCATGGCGCCGGTAGCCGCAAAGCTGCTCAAAGCCCGAACCATGTCCTTATATGGTAATAACAGAATGCAGCGCCACTTTTTGTCTGGCTTCGCGCGGAATGTGGCGGCACGAGCGCCACCCAGTGGTTGAGCGCGTGAACTGCCTTTAGGATTTTTTATTTTTTTTAAACAGGAAGTGGGAGCTCGAGTCGGGCTGATGTTGGGAGGAAGTGAATGTAAGACTCTTTGCAGTGTCTTTAACGGGTTTTTGTTTTTTGTCTTATCAACAGTTCAGCC。
2.如权利要求1所述大黄鱼肌动蛋白启动子的克隆方法，其特征在于包括以下步骤一、大黄鱼beta-actin 5’调控序列分离1)采用 Clontech 公司的 Genome Walker Universal Kit (Catalog No. 638904)构建酶 (Dra I，EcoR V, Pv μ II & St μ I)四个 DNA 核酸内切酶库； 具体操作为(1)基因组纯度分析A 取1 μ 1基因组DNA在0. 6%的琼脂糖凝胶上电泳；B:用Dra I酶去试切，体系为5 μ 1实验基因组DNA，1. 6 μ 1 Dra Ι，2μ1 IOXDra I buffer, 11. 4 μ 1双蒸馏无菌H2O,总体系为20 μ 1 ；(2)基因组酶切消化A 标记5个1. 5ml的EP管DL1，DL2，DL3，DL4和一个阳性对照； B 加入酶切体系，组分为25μ 1基因组DNA，8y 1限制内切酶，10 μ 1限制内切酶 buffer (10 X)，57 μ 1双蒸馏无菌H2O,总体系为100 μ 1 ； C 轻柔混合均勻，并瞬时离心，37°C消化2h ； D 低速涡旋5 IOs并瞬时离心，37度。C过夜消化；(3)基因组纯化A 在每一个反应管中加入等体积的苯酚； B 低速涡旋5 IOs并瞬时离心；C 把上层水相转移至另外一个1. 5ml EP管中，并加入等体积的氯仿； D 低速涡旋5 IOs并瞬时离心，转移上层水相至另外一个新的EP管中，并向水相中 加入2倍体积冰冷的95%的乙醇，1/10体积的乙酸钠和20 μ g的糖苷 E 低速涡旋5 IOs并离心； F 弃上清并用100 μ 1冰冷的80%乙醇洗涤，离心； G 弃上清并在空气中干燥后用20 μ 1 TE溶解；(4)Adaptor连接到消化后的基因组上A 连接体系4μ 1消化并纯化后的基因组DNA，1.9y 1 Genome Walker Adaptor, 1· 6 μ 1 连接 buffer (10X) ,0. 5μ 1 T4 DNA 连接酶；3B:连接条件16°C过夜连接； C 终止连接条件70°C 5min ； D 加入 75 μ 1 TE ；(2)采用两轮to μ ch-down-PCR方法克隆出5’ -端序列，具体步骤如下(1)第一轮to μ ch-down PCR 体系 a 第一轮PCR mix配置(40 μ 1无菌双蒸馏水；(5 U 1 IOX Advantage 2 PCRbuffer(clontech Advantage2 PCR Enzyme System)；(1 μ 1 dNTP ( "S^^h IOmM) (aontech Advantage2 PCE Enzyme System)；(1 μ 1 API (10 μ Μ)；Ιμ Advantage 2 Polymerase mix (50 X) (clontech Advantage2 PCIi Enzyme System)； 1 μ 1 基因特异的 Primer (GSPl)； 1 μ 1酶切文库DNA ； 总体系50μ 1 ；b:PCR 程序7 个循环 94°C 25s 72°C 3min ；(32 个循环 94°C 25s 67°C 3min 67"C 7min ；(2)第二轮toynch-downPCR组分以第一轮的PCR产物为模板，槽式引物(AP2和 GPS2)体系跟第一轮一样；程序5 个循环 94°C 25s 72°C 3min ；(20 个循环 94°C 25s 67°C 3min 67°C 7min ； 二、扩增出来的PCR产物连接到pMD18T-Simple vector (TaKaRa)进行回收并测序。
3.如权利要求1所述的大黄鱼肌动蛋白启动子应用于外源基因真核表达。
4.如权利要求1所述的大黄鱼β-肌动蛋白启动子应用于转基因鱼以及转基因“全
全文摘要
大黄鱼β-肌动蛋白启动子序列及其应用，涉及一种启动子。本发明提供大黄鱼β-肌动蛋白启动子序列及其克隆方法与应用。克隆方法1、大黄鱼beta-actin 5’调控序列分离构建酶四个DNA核酸内切酶库；基因组酶切消化；基因组纯化；Adaptor连接到消化后的基因组上；采用两轮touch-down-PCR方法克隆出5’-端序列，具体步骤与Genome Walker Mniversal Kit一致。2、扩增出来的PCR产物连接到pMD18T-Simple vector(TaKaRa)，进行回收并测序。大黄鱼β-肌动蛋白启动子可以应用于外源基因真核表达、转基因鱼以及转基因“全鱼”。
文档编号A01K67/027GK101914535SQ201010218110
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月2日 优先权日2010年7月2日
发明者敖敬群, 肖小强, 陈新华 申请人:国家海洋局第三海洋研究所