一种大豆遗传转化方法

专利名称：一种大豆遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种大豆遗传转化方法。
背景技术：
大豆[Glycine max(L. )Merr.]属一年生豆科草本植物，中国是大豆的原产地，已 有4700多年种植大豆的历史。大豆是重要的油料作物和粮食作物，是世界上食用油和植物 蛋白的重要来源。然而，大豆再生和遗传转化的困难阻碍了大豆农艺性状的进一步提高和 功能基因组研究的进展。迄今为止，从大豆表达文库中获得的超过300，000的表达序列标 签(expressed sequence tages，ESTs)等待进一步的基因克隆和功能验证，这些EST序列 代表着与大豆器官建成、发育状态、基因型和环境条件等的一大类基因。大豆遗传资源亟待 人们去开发，并用来改良栽培大豆。相对于玉米、水稻等作物来说，大豆的转化进展比较缓慢。Hinchee (1988)最早报 道大豆转基因植株的获得，至今已经报道的大豆转化频率仍然较低。在大豆转基因中常用 的转基因方法是基因枪法和农杆菌介导法，其它转化方法应用的较少。McCabe等(1988) 首次报道了利用微弹轰击法成功转化大豆顶芽分生组织获得转基因植株，但都为嵌合体。 此后的报道采用此系统通过挑选含有被转化细胞的植株进行后期筛选，获得了非嵌合的转 基因植株。由于微弹轰击法不像农杆菌法那样受靶组织的限制，其应用于其他靶细胞组织 的报道也随后出现。Finer和McMullen(1991)首次报道用基因枪法转化体细胞胚性细胞 团并获得了转基因植株，以后这一系统得以快速发展，成为大多数实验室采用的手段。基 因枪法操作受受体材料的影响较小，且转化效率相对较高，且操作简便，可控度高。但是这 种方法导入DNA分子量一般不高于10kb，且容易在植物基因组多个位点整合造成拷贝数 较高，易引起基因沉默。自Hinchee等(1988)利用农杆菌转化大豆子叶节成功以来，大 豆转化普遍采用的都是这种基于农杆菌介导的子叶节分生组织再生系统。由于T-DNA整 合入分生组织的频率、对转化细胞的选择效率，不定芽再生频率和植株再生频率等不高， 农杆菌介导的大豆子叶节转化频率一直很低。试验中人们对大豆转化过程进行了许多 优化。在大豆遗传转化的过程中，尽可能选择那些致毒性强的农杆菌菌株。超声波处理 (SAATsoni cat ion-assisted Agrobacterium-mediated transformation)禾口辅助微弹轰击 也可以增加浸染位点的数目，采用胚性悬浮系、未成熟子叶或子叶节等为靶组织，使农杆菌 穿越表层细胞进入深层更加容易，可显著提高转化效率。虽然农杆菌介导的大豆子叶节转 化频率还很低，试验操作重现性也不高，但该方法还是被大多数实验室和公司所采用用来 进行转基因研究。相对于体细胞胚途径，农 杆菌介导子叶节途径取材方便，培养周期短(一 般8周得到再生植株)；而且所需试验条件简单，无需基因枪等设备，获得转基因植株成本 相对低廉。但整个操作过程对操作人员的技术要求比较高，试验的成功往往取决于操作人 员的熟练程度和经验。近年来，Liu et al. (2004)利用农杆菌介导胚尖分生组织系统，获得了较高的转 化频率。Paz et al. (2006)报道用农杆菌介导一个半种子途径，提高了子叶节途径的转化频率。但到目前为止，大豆还是公认的难转化的植物之一。这是因为大豆组织培养再生困 难，可重复性差，转化频率在基因型之间差异较大，使得利用基因工程手段对大豆进行遗传 改良受到了限制。因此，只有建立良好的转基因受体系统，并结合适宜的转基因方法，才有 可能使转基因技术在大豆的性状改良、新品种的培育中发挥作用，并建立一条有别于常规 育种技术的新途径。

发明内容
本发明的目的是提供一种大豆遗传转化方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)用含有外源基因的重组农杆菌溶液侵染大 豆的下胚轴，得到侵染后下胚轴；2)将步骤1)得到的侵染后下胚轴进行共培养得到共培养后下胚轴；3)将步骤2)得到的共培养后下胚轴进行芽诱导培养得到芽诱导后的下胚轴；4)将步骤3)得到的带芽的下胚轴进行筛选培养得到筛选后存活的下胚轴；5)从步骤4)得到的筛选后存活的下胚轴中取下不定芽，将不定芽进行生根培养， 得到转基因大豆幼苗。所述大豆的下胚轴为具有顶端分生组织的0.5cm-lcm长的下胚轴，所述大豆的下 胚轴具体为具有顶端分生组织的0. 5cm、0. 8cm或Icm长的下胚轴；所述受体大豆的下胚轴按照如下方法制备大豆种子萌发5天-6天，去除种皮、子 叶、顶芽，得到具有顶端分生组织的0. 5cm-lcm长的下胚轴；所述受体大豆的下胚轴具体按照如下方法制备大豆种子萌发5天或6天，去除种 皮、子叶、顶芽，得到具有顶端分生组织的0. 5cm、0. 8cm或Icm长的下胚轴。所述受体大豆种子萌发5天-6天后具有如下结构带有种皮、子叶、顶芽、下胚轴 和根，外层种皮破裂，子叶膨大，子叶内有顶芽，顶芽的初生叶还未露出子叶、子叶下有下胚 轴，下胚轴下有根。步骤1)中，所述含有外源基因的重组农杆菌溶液为按照如下方法制备所述含有 外源基因的重组农杆菌重悬于液体共培养培养基中，调至OD值为0. 3-0. 8，25°C静置lh，得 到重组农杆菌溶液；所述OD值具体为0. 3,0. 4,0. 5,0. 6或0. 8 ；所述液体共培养培养基按照如下方法制备向1/2MS培养基中添加2-吗啡酸-乙 磺酸、硫代硫酸钠、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、乙酰丁香酮、6-苄基腺嘌呤、硝酸银和蔗糖， 得到所述液体共培养培养基，所述2-吗啡酸-乙磺酸在所述液体共培养培养基中的浓度为 3. 9g/L，所述硫代硫酸钠在所述液体共培养培养基中的浓度为0. 2g/L，所述L-半胱氨酸在 所述液体共培养培养基中的浓度为400mg/L，所述二硫苏糖醇在所述液体共培养培养基中 的浓度为0. 154g/L，所述乙酰丁香酮在所述液体共培养培养基中的浓度为200ymol/L，所 述6-苄基腺嘌呤在所述液体共培养培养基中的浓度为4mg/L，所述硝酸银在所述液体共培 养培养基中的浓度为5mg/L，所述蔗糖在所述液体共培养培养基中的浓度为30，000mg/L， 所述液体共培养培养基的PH为5. 6 ；步骤2)中，所述共培养所用培养基按照如下方法制备向所述液体共培养培 养基中添加琼脂得到共培养所用培养基，所述琼脂在所述共培养所用培养基中的浓度为 6，000mg/L，所述共培养所用培养基的pH为5. 6 ；
步骤3)中，所述芽诱导培养所用培养基按照如下方法制备向1/2MS培养基中添加6-苄基腺嘌呤、吲哚丁酸、蔗糖、羧苄青霉素、噻孢霉素、硝酸银和琼脂，得到所述芽诱导 培养所用培养基，所述6-苄基腺嘌呤在所述芽诱导培养所用培养基中的浓度为4mg/L，所 述吲哚丁酸在所述芽诱导培养所用培养基中的浓度为0. 2mg/L，所述蔗糖在所述芽诱导培 养所用培养基中的浓度为30，000mg/L，所述羧苄青霉素在所述芽诱导培养所用培养基中的 浓度为300mg/L，所述噻孢霉素在所述芽诱导培养所用培养基中的浓度为300mg/L，所述硝 酸银在所述芽诱导培养所用培养基中的浓度为5mg/L，所述琼脂在所述芽诱导培养所用培 养基中的浓度为8，000mg/L，所述芽诱导培养所用培养基的pH为5. 8 ；步骤4)中，所述筛选培养所用培养基按照如下方法制备向所述芽诱导培养所用 培养基中添加卡那霉素，得到所述筛选培养所用培养基，所述卡那霉素在所述筛选培养所 用培养基中的浓度为100mg/L，所述筛选培养所用培养基的pH为5. 8 ；步骤5)中，所述生根培养所用培养基按照如下方法制备向1/2MS培养基中添加 蔗糖、噻孢霉素、卡那霉素和琼脂，得到所述生根培养所用培养基，所述蔗糖在所述生根培 养所用培养基中的浓度为20，000mg/L，所述噻孢霉素在所述生根培养所用培养基中的浓度 为150mg/L，所述卡那霉素在所述生根培养所用培养基中的浓度为10mg/L，所述琼脂在所 述生根培养所用培养基中的浓度为8，000mg/L，所述生根培养所用培养基的pH值为5. 6。步骤1)中，所述侵染的时间为0. 5h-8h ；所述侵染的方式为将所述受体大豆的 下胚轴浸入含有外源基因的重组农杆菌溶液振荡培养；所述侵染的时间具体为0. 5h，lh， 1.5h,2h,3h,4h,5h,6h,7h 或 8h ;步骤2)中，所述共培养的温度为22°C_25°C，所述共培养的温度具体为22°C、23°C 或25°C，所述共培养为暗培养，所述共培养的时间为2天-5天；所述共培养的时间具体为2 天、3天、4天或5天；步骤3)中，所述芽诱导培养的温度25°C _28°C，所述芽诱导培养的温度具体为 25°C、27°C或28°C，光照强度为70 μ En^S—1，光周期控制18/6h (光/暗)，培养时间为6天；步骤4)中，所述筛选培养的温度25°C _28°C，所述筛选培养的温度具体为25°C、 27°C或28°C，光照强度为70 μ Em、—1，光周期控制18/6h光/暗，且每周继代一次；所述筛 选培养的时间为4周；步骤5)中，所述生根培养的温度25°C _28°C，所述生根培养的温度具体为25°C、 271或281，光照强度为70 μ EnT2S-1,光周期控制18/6h光/暗，培养时间15天。步骤5)中，所述不定芽的长度为2. 5cm-4cm，所述不定芽的长度具体为2. 5cm, 3cm 或 4cm。在步骤2)后，步骤3)前，还包括依次用蒸馏水和含有羧苄青霉素和噻孢霉素液体 共培养培养基冲洗所述共培养后下胚轴的步骤；所述步骤5)中，所述取下不定芽为自不定芽的基部将不定芽切下；在所述取下不 定芽的步骤后，所述将不定芽进行生根培养步骤前，还包括将切下不定芽的剪切端浸入浓 度为2mg/L的吲哚丁酸水溶液中浸泡的步骤；所述依次用蒸馏水和含有羧苄青霉素和噻孢霉素液体培养基冲洗所述共培养后 下胚轴的步骤，按照如下方法操作先用无菌蒸馏水冲洗3次，然后用含有羧苄青霉素和噻 孢霉素液体培养基冲洗4次，所述含有羧苄青霉素和噻孢霉素的液体共培养培养基按照如下方法制备向所述液体共培养培养基中添加羧苄青霉素和噻孢霉素，得到的含有羧苄青 霉素和噻孢霉素的液体共培养培养基，所述羧苄青霉素在所述含有羧苄青霉素和噻孢霉素 的液体共培养培养基中的浓度为300mg/L，所述噻孢霉素在所述含有羧苄青霉素和噻孢霉 素的液体共培养培养基中的浓度为300mg/L ；所述将切下不定芽的剪切端浸入浓度为2mg/L的吲哚丁酸水溶液中浸泡的步骤 中，所述浸泡时间为2min-5min ；所述浸泡时间具体为2min、3min、4min或5min ；所述切下 所述不定芽的位置为紧贴不定芽的基部；所述方法中，在所述步骤5)后，还包括将生根培养得到的具有大于2cm的不定根 的幼苗移栽到混合土中，培养1周，得到转基因大豆植株的步骤，所述混合土由草炭土和蛭 石组成，所述草炭土和蛭石的质量比为1 1，所述不定根的长度优选为2cm-4cm，具体为 2cm、3cm 或 4cm。所述大豆的下胚轴制备方法中，所述萌发所用的培养基按照如下方法制备向 1/2MS培养基中添加蔗糖和琼脂，得到所述萌发培养所用的培养基，所述蔗糖在所述萌发培 养所用的培养基中的浓度为15，000mg/L，所述琼脂在所述萌发培养所用的培养基中的浓度 为7500mg/L，所述萌发所用的培养基的pH为5. 8 ； 所述萌发培养的温度为22°C _25°C，所述萌发培养的温度具体为22°C、23°C或 250C，光照强度为120 μ EnT2S-1,光照周期为18h/6h光照/暗。所述含有外源基因的重组农杆菌为如下1)或2)1)、将载体pCAMBIA2301导入根癌农杆菌LBA4404得到的重组农杆菌2)、将载体pCAMBIA2301导入根癌农杆菌EHA105得到的重组农杆菌。1/2MS培养基按照如下方法制备向去离子水中添加硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫 酸镁、磷酸二氢钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、甘氨酸、维生素 Bi、维生素B6、烟酸、肌醇、硫酸亚铁和乙二铵四乙酸二钠。所述硝酸铵在所述1/2MS培养 基中的浓度为825mg/L，硝酸钾在所述1/2MS培养基中的浓度为950mg/L，所述氯化钙在所 述1/2MS培养基中的浓度为220mg/L，所述硫酸镁在所述1/2MS培养基中的浓度为185mg/ L，所述磷酸二氢钾在所述1/2MS培养基中的浓度为95mg/L，所述硼酸在所述1/2MS培养基 中的浓度为3. lmg/L，所述硫酸锰在所述1/2MS培养基中的浓度为11. 15mg/L，所述硫酸锌 在所述1/2MS培养基中的浓度为4. 3mg/L，所述碘化钾0.415mg/L在所述1/2MS培养基中的 浓度为，所述钼酸钠0. 125mg/L在所述1/2MS培养基中的浓度为，所述硫酸铜在所述1/2MS 培养基中的浓度为0. 0125mg/L，所述氯化钴在所述1/2MS培养基中的浓度为0. 0125mg/L, 所述甘氨酸在所述1/2MS培养基中的浓度为lmg/L，所述维生素Bl在所述1/2MS培养基中 的浓度为0. 05mg/L,所述维生素B6在所述1/2MS培养基中的浓度为0. 25mg/L,所述烟酸在 所述1/2MS培养基中的浓度为0. 25mg/L，所述肌醇在所述1/2MS培养基中的浓度为50mg/ L，所述硫酸亚铁在所述1/2MS培养基中的浓度为13. 975mg/L，所述乙二铵四乙酸二钠在所 述1/2MS培养基中的浓度为18. 625mg/L。本发明的实验证明，在培养基中添加高浓度6-苄基腺嘌呤(BAP)可以诱导外植体 分生组织增殖产生不定芽的发生率；在培养基中添加银离子可以明显地促进大豆单个外植 体多芽的产生，使得诱导不定芽总数目显著增加；达到出芽多，再生苗能力强，与普通农杆 菌介导的转化方法相比，转化效率大幅度提高。本发明提供了的利用下胚轴为受体建立大豆遗传转化体系的方法，可在较短时间内快速高效产生不定芽，用于大豆基因工程的基本 操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和现实意义。


图1为芽诱导培养基中不同6-苄基腺嘌呤(BAP)浓度对大豆下胚轴再生频率的 影响的示2为在不定芽诱导阶段大豆下胚轴和子叶节再生频率的比较的示3为芽诱导培养基中添加5mg/L硝酸银(AgNO3)对大豆下胚轴外植体不定芽再 生的影响的示4为不同农杆菌菌株和培养基中硝酸银对大豆转化的影响的示5为菌液浓度对大豆下胚轴瞬时表达频率的影响的示6为浸染时间对农杆菌介导大豆下胚轴T-DNA转化效率的影响的示7为不同共培养时间对大豆下胚轴GUS基因瞬时表达频率影响的示8为抗氧化剂对组织培养过程中下胚轴褐化和⑶S基因表达的影响的示9为共培养培养基中乙酰丁香酮(AS)浓度对GUS基因瞬时表达频率的影响的 示10为质粒pCAMBIA2301的部分物理图谱图11为⑶S基因在农杆菌介导的大豆下胚轴表达的照片图12为农杆菌介导的下胚轴转化获得GUS阳性植株的染色照片
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中实验所涉及的药品均购自北京欣经科公司，Sigma公司及上海生工 公司。实施例1、大豆下胚轴再生植株获得的影响因素一、BAP浓度对下胚轴再生不定芽频率的影响1、受体大豆下胚轴的获得试验材料大豆(Glycine max)黑农44，记载在满为群、杜维广、陈怡、栾晓燕、刘 鑫磊、王凤丽，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品质的影响，黑龙江 农业科学，2004，5 1 -3，中，公众可从中国科学院植物研究所获得。大豆种子表面灭菌挑选无病、饱满的大豆种子平铺在敞口培养皿中，放入内置一 盛有IOOmL次氯酸钠原液烧杯的干燥器中，然后沿烧杯缓慢加入4mL浓盐酸，密闭干燥器， 置于通风橱中灭菌18h。将灭菌后的种子放置在萌发培养基(1/21^基本培养基+15，000!!^/ L蔗糖+7，500mg/L琼脂，pH 5.8)中，置于25°C、120 μ En^S—1光强(光照周期18/6h)的条 件下培养5d。大豆下胚轴培养5d时，此时萌发大豆种皮破裂，初生叶(primary leaves)还未 露出子叶。在超净工作台中取出大豆，小心去掉种皮，将子叶剥离。然后用手术刀将顶芽切 除，切取具有顶端分生组织的0. 5cm的下胚轴作为受体大豆下胚轴。
2、芽诱导培养将切好的大豆下胚轴分别转移到含有lmg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L或5mg/L 6-苄 基腺嘌呤的芽诱导培养基(1/2MS基本培养基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗糖，300mg/ L 羧苄青霉素，300mg/L 噻孢霉素，8，000mg/L 琼脂，lmg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L 或 5mg/ L 6-苄基腺嘌呤)上进行芽诱导培养，培养基的pH为5. 8，培养温度为27°C，光照强度为 70 μ Em-2S-1,光周期控制18/6h，培养6d，分别获得不定芽，统计不定芽的再生频率，再生频 率为再生出不定芽的外植体数目/外植体数目X100%。外植体的数目为50，实验重复三 次，结果取平均值。结果为含有lmg/L 6_苄基腺嘌呤的芽诱导培养基上，不定芽的再生频率为28. 2% ；其中 少于3个不定芽的再生频率为13.0%，多于4个不定芽的再生频率为15.2% ；含有2mg/L 6_苄基腺嘌呤的芽诱导培养基上，不定芽的再生频率为41 % ；其中少 于3个不定芽的再生频率为23.5%，多于4个不定芽的再生频率为17.5% ；含有3mg/L 6_苄基腺嘌呤的芽诱导培养基上，不定芽的再生频率为86. 7% ；其中 少于3个不定芽的再生频率为41. 2%，多于4个不定芽的再生频率为45. 3% ；含有4mg/L 6_苄基腺嘌呤的芽诱导培养基上，不定芽的再生频率为85. 3% ；其中 少于3个不定芽的再生频率为41. 6%，多于4个不定芽的再生频率为43. 7% ；含有5mg/L 6_苄基腺嘌呤的芽诱导培养基上，不定芽的再生频率为82. 0% ；其中 少于3个不定芽的再生频率为39. 6%，多于4个不定芽的再生频率为42. 4% ；作图如图1所示，从图中看出，4mg/L 6_苄基腺嘌呤显著提高不定芽的再生频率。 培养基添加6-苄基腺嘌呤的浓度对外植体不定芽的数目和频率有明显作用。含有4mg/ L6-苄基腺嘌呤条件下，大豆下胚轴能高效诱导多芽的产生，其再生频率显著提高。在更高浓度的6-苄基腺嘌呤培养基上培养，结果为虽然单个外植体产生多芽的 比率有所提高，但总的再生频率反而有所下降。二、下胚轴再生体系同子叶节再生体系的比较
1、受体大豆下胚轴的获得试验材料与上述一相同；大豆种子表面灭菌与上述一相同；大豆子叶节外植体取出在萌发培养基上培养5天的大豆种子，剥去种皮，切取根 和大部分的下胚轴，只留下距子叶节3mm的下胚轴部分。沿种脐将子叶分开，将初生叶和辅 芽全部切除，然后用手术刀在子叶节处做伤处理(垂直于子叶划10次)，使得分生能力强的 分生组织暴露，得到的子叶节作为大豆子叶节外植体。2、芽诱导培养与上述一的方法基本相同，不同的是其中芽诱导培养基配方如下 1/2MS基本培养基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30, 000mg/L蔗糖，300mg/L羧苄青霉素，300mg/L噻孢 霉素，8，000mg/L琼脂，4mg/L 6-苄基腺嘌呤，得到再生大豆植株(子叶节)组。分别统计5、10、15、20、25天(此处的天数为芽诱导培养的时间)由实施例1含有 4mg/L 6-苄基腺嘌呤的芽诱导培养基得到的再生大豆植株(下胚轴)组和上述得到的再生 大豆植株(子叶节)组在芽诱导培养得到的不定芽数目；统计不定芽的再生频率，再生频率 为再生出不定芽的外植体数目/外植体数目X100%。外植体的数目为50，实验重复三次，结果取平均值。结果为再生大豆植株(子叶节)组和再生大豆植株(下胚轴)组在芽诱导培养 5天时，不定芽的再生频率分别为0和6. 0% ；其中少于3个不定芽的再生频率分别为0和 5. 8%，多于4个不定芽的再生频率分别为0和0. 2% ；再生大豆植株(子叶节)组和再生大豆植株(下胚轴)组在芽诱导培养10天时， 不定芽的再生频率分别为4. 和51. 3% ；其中少于3个不定芽的再生频率分别为4. 1% 和31.6%，多于4个不定芽的再生频率分别为0和19. 7% ；再生大豆植株(子叶节)组和再生大豆植株(下胚轴)组在芽诱导培养15天时， 不定芽的再生频率分别为8. 5%和63. 5% ；其中少于3个不定芽的再生频率分别为7. 5% 和35. 7%，多于4个不定芽的再生频率分别为和27.8% ；再生大豆植株(子叶节)组和再生大豆植株(下胚轴)组在芽诱导培养20天时， 不定芽的再生频率分别为21. 0%和82. 5%;其中少于3个不定芽的再生频率分别为15. 4% 和42. 2%，多于4个不定芽的再生频率分别为4. 6%和40. 3% ；再生大豆植株(子叶节)组和再生大豆植株(下胚轴)组在芽诱导培养25天时， 不定芽的再生频率分别为40. 5%和82. 7%;其中少于3个不定芽的再生频率分别为22. 2% 和39. 8%，多于4个不定芽的再生频率分别为18. 3%和42. 9% ；作图如图2所示，大豆下胚轴能在很短时间内诱导高频不定芽高频再生，同时每 个外植体诱导多芽(大于3个不定芽)的比率也要高于子叶节再生体系。大豆下胚轴再生 频率是子叶节再生频率的2. 2倍。从图看出，相对于子叶节再生体系而言，大豆下胚轴再生 体系拥有较高的再生频率，表明下胚轴能在较短时间内快速高效产生不定芽，从而有利于 进一步的转化操作。三、硝酸银对大豆下胚轴再生的影响1、受体大豆下胚轴的获得试验材料与上述一相同；大豆种子表面灭菌与上述一相同；受体大豆下胚轴与上述一相同；2、芽诱导培养与上述一的方法基本相同，不同的是采用芽诱导培养基1培养得 到对照组；利用芽诱导培养基2培养，得到实验组。芽诱导培养基1配方如下1/2MS基本培养基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗 糖，300mg/L羧苄青霉素，300mg/L噻孢霉素，8，000mg/L琼脂，4mg/L 6-苄基腺嘌呤。芽诱导培养基2配方如下1/2MS基本培养基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗 糖，300mg/L羧苄青霉素，300mg/L噻孢霉素，8，000mg/L琼脂，4mg/L 6-苄基腺嘌呤，5mg/L 硝酸银。分别统计对照组和实验组在芽诱导培养得到的不定芽数目；统计不定芽的再生频 率，再生频率为再生出不定芽的外植体数目/外植体数目X100%。外植体的数目为50，实 验重复三次，结果取平均值。结果 如下实验组的总的不定芽数目为360个，再生频率为83. 0%，其中少于3个不定芽的再 生频率为21. 2%，多于4个不定芽的再生频率为61. 8% ；
对照组的总的不定芽数目为240个，再生频率为81. 2%，其中少于3个不定芽的再 生频率为42. 3%，多于4个不定芽的再生频率为38. 9% ；将上述结果作图如图3所示，图中条形柱编号分别为1和2，其中1表示不加硝酸 银处理(对照组)，2表示加硝酸银处理(实验组)。可以看出，通过在芽诱导培养基中添加 5mg/L硝酸银极大的促进了单个外植体多芽的产生，总的不定芽数目显著增加。不过，需要 指出的是，添加硝酸银后下胚轴再生频率(获得再生芽的外植体数)没有显著变化。四、再生芽的生根的影响因素1、受体大豆下胚轴的获得试验材料与上述一相同；大豆种子表面灭菌与上述一相同；受体大豆下胚轴与上述一相同；2、芽诱导培养与上述一的方法基本相同，不同的是采用芽诱导培养基2培养芽诱导培养基2配方如下1/2MS基本培养基，0. 2mg/L吲哚丁酸，3%蔗糖，300mg/ L羧苄青霉素，300mg/L噻孢霉素，8，000mg/L琼脂，4mg/L 6-苄基腺嘌呤，5mg/L硝酸银。3、再生植株的生根与移栽待不定芽长度大于2. 5cm时(下胚轴在筛选培养上培养4周)，紧贴不定芽的基部 将其切下，将切下的不定芽分为两组进行如下处理实验次生根组将切下的不定芽的切口浸入2mg/L吲哚丁酸水溶液中2min，然后 进行生根培养，得到的为实验次生根。对照次生根组1 将切下的不定芽直接插入生根培养基中进行生根培养，得到的 为对照次生根1。对照次生根组2 将切下的不定芽直接插入生根培养基2中进行生根培养，生根培 养培养基2为将吲哚丁酸添加到生根培养基中，使吲哚丁酸在生根培养基中的浓度为2mg/ L，得到的为对照次生根2。生根培养基的配方如下1/2MS基本培养基，2%蔗糖，150mg/L噻孢霉素，10mg/L 卡那霉素，8，000mg/L琼脂组成，pH值为5. 6。外植体的数目均为20，实验重复三次，结果取平均值。结果为实验次生根组生根培养15天后，1个不定芽长出3-7条次生根，生根率达97%。对照次生根组1 生根培养15天后，1个不定芽长出1-2条次生根，生根率达95%。对照次生根组2 生根培养15天后，1个不定芽长出0条次生根，生根率为0。从上述可以看出，培养在不含激素培养基上的伸长芽，诱导不定根的条数要少，而 且不定根的出育时间也要迟缓。若将吲哚丁酸直接加入生根培养基，则往往导致切口愈伤 过度增殖，反而影响了不定根的诱导。五、大豆下胚轴转化的影响因素A 农杆菌种类及硝酸银影响1、受体大豆下胚轴的获得试验材料与上述一相同；大豆种子表面灭菌与上述一相同；
受体大豆下胚轴与上述一相同；2、农杆菌制备和转化1)农杆菌制备农杆菌感受态的制备挑取土壤农杆菌EHA105 (Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS,Hoekema A(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer toplants. Transgenic Res 2 :208_218，公众可从中国科学院植物研究所获得。)单菌落接种于5mL含 50mg/L利福平，50mg/L链霉素的YEP液体培养基中。所述YEP液体培养基是按如下方法制 备向蒸馏水中加入胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠；所述胰蛋白胨在所述YEP液体培养基 中的浓度为10，000mg/L，所述酵母提取物在所述YEP液体培养基中的浓度为10，000mg/L, 所述氯化钠在所述YEP液体培养基中的浓度为5，000mg/L,所述YEP液体培养基的pH值为 7. O。28°C、250rpm振荡培养过夜；按1 100接种于40mL含50mg/L利福平，50mg/L链 霉素的YEP液体培养基中继续培养4-6h ；4°C，5，OOOrpm离心lOmin，去上清；用600 μ L冰 预冷0. 05mol/L的CaCL2溶液洗涤菌体；4°C，5，OOOrpm离心lOmin，去上清；用200 μ L冰预 冷0. 05mol/L的CaCL2重悬菌体，得到农杆菌EHA105感受态，于4°C保存。质粒向农杆菌的转化在农杆菌EHA105感受态中加入约0. 5 μ g的 PCAMBIA2301 (www. cambia. org. au)质粒DNA(该质粒含有选择标记基因NPTII及GUS报 告基因)，轻轻混勻，冰上放置5min ；然后置于液氮中3min ；迅速转移至37°C温育5min ； 加入500 μ L YEP液体培养基，28 °C振荡培养5_6h ；5, OOOrpm离心3min，去大部分上清， 剩200 μ L，悬浮菌体；均勻涂布于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的 YEP选择平板上，28°C倒置培养两天，得到单菌落。挑取单菌落接种于5mL含50mg/L利福 平，50mg/L链霉素的YEP液体培养基中，28°C、250rpm振荡培养过夜，取1 μ L进行PCR鉴 定，PCR 所用的上游引物为 NPTII-F :5，-GTCACTGAAGCGGGAAGGG-3，，下游引物为 NPTII-R 5，-CGGCGATACCGTAAAGCAC-3’，PCR 反应体系为20 μ L 的 PCR 反应混合液中含有2. 0 μ L 10XPCR buffer, 1. 6μ L 2. 5mM dNTP mixture，1. 0 μ L 待检测的农杆菌菌液，0. 5 μ L IOmM NPTII-F 引物 0. 5μ L IOmM NPTII-R 引物，13. 9 μ L ddH20。PCR 反应条件为-MV 10 分钟; 940C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分钟，30个循环；72°C 7分钟。阳性菌落得到493bp的特异 性条带，阳性菌落命名为EHA105/pCAMBIA2301。重组菌LBA4404/pCAMBIA2301 的制备和转化方法与上述 EHA105/pCAMBIA2301 的制备和转化方法相同，不同的是土壤农杆菌LBA4404 (Ooms G，Hooykaas PJJ, van Veen RJM, van Beelen P, Regensburg-Tuink AJG, Schi lperoort RA(1982)Octopine Ti-plasmiddeletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on the right sideof the T-region. Plasmid 7 :15-29，公众可从中国科学院植物研究所获得。) 替换 EHA105，得到重组菌 LBA4404/pCAMBIA2301。2)含有外源基因的重组农杆菌溶液的制备 将上述得到的重组菌EHA105/pCAMBIA2301接种在含有50mg/L利福平、50mg/L卡 那霉素和50mg/L链霉素的YEP培养基中中28°C振荡培养24h，至对数增长期(0D600约 0. 6-0. 8)，此时重组菌EHA105/pCAMBIA2301的菌液呈桔黄色可供转化使用。将0D600约0. 6-0. 8的重组菌EHA105/pCAMBIA2301的菌液放入30mL离心管，3725rpm离心lOmin，弃上清，收集管底菌体，分别用液体共培养培养基1和液体共培养培养 基2重悬菌体，将菌液浓度调至OD值为0. 5，25°C静置Ih后备用，分别得到含有外源基因的 重组农杆菌溶液1和含有外源基因的重组农杆菌溶液2。液体共培养培养基1的配方如下1/2MS基本培养基，3.9g/L 2_吗啡酸-乙磺酸， 0. 2g/L硫代硫酸钠，400mg/L L-半胱氨酸，0. 154g/L 二硫苏糖醇，200 μ mol/L乙酰丁香酮， 4mg/L 6-苄基腺嘌呤，30, 000mg/L 蔗糖，pH5. 6。液体共培养培养基2的配方和液体共培养培养基1的配方基本相同，不同的是液 体共培养培养基2包含5mg/L硝酸银。3)侵染 将50个由1得到的受体大豆下胚轴分别浸入30mL上述分别获得的两种含有外源 基因的重组农杆菌溶液中进行侵染，期间不断振荡，侵染时间为Ih ；4)共培养分别将经过侵染后的大豆下胚轴取出，在无菌的滤纸上吸干菌液，放在铺有滤纸 的共培养培养基(加6，000mg/L琼脂的液体共培养培养基)上，在25°C遮光条件下4d，分 别得到共培养后大豆下胚轴。共培养后将大豆下胚轴依次用蒸馏水冲洗3次，用含有羧苄青霉素和噻孢霉素液 体共培养培养基冲洗4次。5)芽诱导培养分别将上述得到的共培养后的外植体分别放入芽诱导培养基2中 进行芽诱导培养芽诱导培养基2配方如下1/2MS基本培养基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗 糖，300mg/L羧苄青霉素，300mg/L噻孢霉素，8，000mg/L琼脂，4mg/L 6-苄基腺嘌呤，5mg/L 硝酸银。6)筛选培养将上述培养得到的芽诱导后的下胚轴转移到筛选培养基(芽诱导培养基2中加 100mg/L卡那霉素，pH5.8)上，每周继代一次，培养4周后得到不定芽(此时不定芽长度为 3cm)。所述筛选培养的温度25-28°C，光照强度为70 μ EnT2S^光周期控制18/6h (光/暗)；7)再生植株的生根与移栽待不定芽长度为3cm时(下胚轴在筛选培养上培养4周)，紧贴不定芽的基部将 其切下，将切下的不定芽的切口浸入2mg/L吲哚丁酸水溶液的步骤，进行生根培养。得到 具有2cm的不定根的幼苗，将幼苗取出，用水冲去根部附着的培养基，然后移栽到混合土中 (草炭土和蛭石1 1，质量比)，保湿培养1周后转入温室进行正常的栽培管理，分别得到 EHA105介导的转pCAMBIA2301再生大豆植株(带有pCAMBIA2301质粒的EHA105菌株培养 基中不加硝酸银处理得到大豆植株)和EHA105介导的对照转pCAMBIA2301再生大豆植株 (带有PCAMBIA2301质粒的EHA105菌株培养基中加硝酸银处理得到大豆植株)；采用同样的方法将重组菌LBA4404/pCAMBIA2301进行上述实验，分别得到 LBA4404介导的转pCAMBIA2301再生大豆植株(带有pCAMBIA2301质粒的LBA4404菌株培 养基中不加硝酸银处理得到大豆植株)和LBA4404介导的对照转pCAMBIA2301再生大豆植 株(带有pCAMBIA2301质粒的LBA4404菌株培养基中加硝酸银处理得到大豆植株)；生根培养基的配方如下1/2MS基本培养基，20，000mg/L蔗糖，150mg/L噻孢霉素，10mg/L卡那霉素，8，000mg/L琼脂组成，pH值为5. 6。调查⑶S基因分别在上述4种转pCAMBIA2301的再生大豆植株(下胚轴)表达情 况，以期确定不同农杆菌对大豆下胚轴浸染能力和下胚轴对农杆菌的应答。统计⑶S基因的表达频率，⑶S基因的表达频率通过以下方法计算(通过⑶S组 织化学染色检测为阳性的芽数/得到的在筛选培养基上存活的所有抗性芽数)xioo%。所 述GUS组织化学染色是通过如下方法操作的将菌液侵染得到的不同的共培养外植体放入 含ImM 5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷(X-gluc)的⑶S染色液(Jefferson R A, KavanghT A and Bevan M W. (1987)GUS-fusions β -glucuronidase as a sensitive andversatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6 :3901_3907，公众可从中国科学院植物 研究所获得)中。打开管盖，放于抽真空容器中，抽真空约15min。置于37°C保温12h。染 色时间根据材料中GUS活性强弱而定。然后用95%酒精脱色。体视显微镜下拍照，体视显 微镜下呈现蓝色的芽鉴定为阳性芽，否则为阴性芽。外植体的数目均为50，实验重复三次， 结果取平均值。结果如图4所示，图中条形柱编号从左到右依次为1，2，3，4，其中分别代表4种 不同的处理(黑色柱代表抗性芽的产生频率，白色柱代表GUS基因的表达频率)。1为 EHA105介导的转pCAMBIA2301再生大豆植株，2为EHA105介导的对照转pCAMBIA2301再生 大豆植株，3为LBA4404介导的转pCAMBIA2301再生大豆植株，4为LBA4404介导的对照转 PCAMBIA2301再生大豆植株。从图4中可以看出，不同菌株对大豆下胚轴浸染，最终获得的转化效率存在着差 异，LBA440介导的转pCAMBIA2301再生大豆植株和LBA4404介导的对照转pCAMBIA2301再 生大豆植株⑶S基因的表达频率分别为9. 6%和6. 2%，而EHA105介导转pCAMBIA2301再 生大豆植株和EHA105介导对照转pCAMBIA2301再生大豆植株GUS基因的表达频率分别为 20%和10%。同时也可以看出，在侵染时的含有外源基因的农杆菌溶液中添加硝酸银对 这两种菌株介导的下胚轴转化都有促进作用，且EHA105介导的⑶S基因的表达频率高于 LBA4404 介导。B、农杆菌浓度对大豆下胚轴转化的影响1、受体大豆下胚轴的获得试验材料与上述一相同；大豆种子表面灭菌与上述一相同；受体大豆下胚轴与上述一相同；2、农杆菌制备和转化1)农杆菌制备与上述A方法相同。2)含有外源基因的重组农杆菌溶液的制备与A的方法基本相同，不同的是将重 组菌EHA105/pCAMBIA2301用液体共培养培养基2 (含有5mg/L硝酸银)分别稀释为0D600 为 0. 8,0. 5,0. 3 和 0. 1。3)侵染采用上述A的方法，分别浸染大豆下胚轴外植体Ih后；4)共培养采用上述A的方法；共培养3天后，分别得到共培养外植体，然后检测 共培养外植体的顶端分生区GUS组织化学染色情况，统计基因的转化率。基因的转化率通过以下方法计算(产生转基因阳性芽的外植体数/用于侵染的外植体数))X 100。所述转基因阳性芽是指通过⑶S组织化学染色检测为阳性的芽；所述 GUS组织化学染色与上述A相同。体视显微镜下拍照，体视显微镜下呈现蓝色的芽鉴定为阳 性芽，否则为阴性芽。实验重复三次，结果取平均值。统计结果如下0D600为0. 8侵染得到的共培养外植体的转化率为16. 1 % ；0D600为0. 5侵染得到的共培养外植体的转化率为25. 3% ；0D600为0. 3侵染得到的共培养外植体的转化率为13. 9% ；0D600为0. 1侵染得到的共培养外植体的转化率为4. 9% ；作图如图5所示，图中条形柱从左到右分别编号为1，2，3，4，分别代表重组农杆菌 稀释为0D600为0.8，0.5，0.3和0. 1的处理。从图中看出，随着菌液浓度的稀释，转化效率 大幅度降低，0D600为0.5时，转化率最高。当浸染下胚轴的农杆菌浓度为(0D600)0.8时， 下胚轴顶端分生组织在共培养基上很短时间就褐化坏死，严重影响了后期不定芽的再生。C、浸染时间对大豆下胚轴转化的影响1、受体大豆下胚轴的获得试验材料与上述一相同；大豆种子表面灭菌与上述一相同；受体大豆下胚轴与上述一相同；2、农杆菌制备和转化1)农杆菌制备与上述A方法相同，2)含有外源基因的重组农杆菌溶液的制备含有外源基因的重组农杆菌溶液的 制备与A的方法基本相同，不同的是将重组菌EHA105/pCAMBIA2301用液体共培养培养基 2 (含有5mg/L硝酸银)稀释为0D600为0. 5。3)侵染采用上述A的方法，不同的是侵染时间为0. 5h，lh，1.5h，2h，3h，4h，5h， 6h、7h、8h ；4)共培养采用上述A的方法；得到不同的共培养外植体。用上述A方法检测⑶S因瞬时表达频率。外植体的数目均为30，实验重复三次，结果取平均值。结果如下侵染时间为0. 5h，⑶S基因瞬时表达频率为12%，侵染时间为lh，⑶S因瞬时表达频率为12. 5%，侵染时间为1. 5h，⑶S基因瞬时表达频率为16. 6%，侵染时间为2h，⑶S基因瞬时表达频率为42. 3%，侵染时间为3h，⑶S基因瞬时表达频率为53. 6%，侵染时间为4h，⑶S基因瞬时表达频率为73%，侵染时间为5h，⑶S基因瞬时表达频率为53. 8%，侵染时间为6h，⑶S基因瞬时表达频率为37. 5%。作图如图6所示，图中条形柱编号从左到右依次为1，2，3，4，5，6，7，8。1为浸染 0. 5h，2 为浸染 lh，3 为浸染 1. 5h，4，5，6，7，8 分别为浸染 2，3，4，5，6h。
从图中看出，当外植体浸入0D600为0. 5的菌液中达4h时，⑶S基因瞬时表达频 率最高，频率达到73.0%。随着浸染时间的进一步延长，外植体在共培养培养基上易出现酶 促褐化，从而降低了转化效率。D、共培养时间对大豆下胚轴⑶S基因瞬时表达频率的影响1、受体大豆下胚轴的获得试验材料与上述一相同；大豆种子表面灭菌与上述一相同；受体大豆下胚轴与上述一相同；2、农杆菌制备和转化
1)农杆菌制备与上述A方法相同；2)含有外源基因的重组农杆菌溶液的制备与A的方法相同。3)侵染采用上述A的方法，不同的是将A中0D600为0.5的菌液EHA105/ PCAMBIA2301侵染，侵染时间为4h ；4)共培养采用上述A的方法；不同的是共培养2d，3d，4d，5d后得到不同的共培 养外植体。瞬时表达频率的检测GUS基因转化率通过以下方法计算(产生转基因阳性芽的 外植体数/用于侵染的外植体数))X100。所述转基因阳性芽是指通过⑶S组织化学染色 检测为阳性的芽；所述⑶S组织化学染色与上述A方法相同。体视显微镜下拍照，体视显微 镜下呈现蓝色的芽鉴定为阳性芽，否则为阴性芽。外植体的数目均为30，实验重复三次，结果取平均值。结果如下共培养2d得到的共培养外植体⑶S基因瞬时表达频率为50. 4% ；共培养3d得到的共培养外植体⑶S基因瞬时表达频率为81.4%;共培养4d得到的共培养外植体⑶S基因瞬时表达频率为79. 1 % ；共培养5d得到的共培养外植体⑶S基因瞬时表达频率为76. 3%。作图如图7所示，从图中看出，在3d时，GUS基因瞬时表达率大幅度上升，共培养4 和5d后，⑶S基因瞬时表达频率和3d相似。另外，共培养5d后，外植体开始大幅度褐化甚 至腐软，不利于诱导不定芽乃至最终成苗。因此，最适共培养时间为3d。E、抗氧化剂对⑶S基因在大豆下胚轴中瞬时表达的影响1、受体大豆下胚轴的获得试验材料与上述一相同； 大豆种子表面灭菌与上述一相同；受体大豆下胚轴与上述一相同；2、农杆菌制备和转化1)农杆菌制备与上述A方法相同。2)含有外源基因的重组农杆菌溶液的制备与A的方法相同，不同的是分别在液 体共培养培养基2和不添加抗氧化剂(L-半胱氨酸，二硫苏糖醇和硫代硫酸钠)的液体共 培养培养基(在液体共培养培养基2中不添加抗氧化剂L-半胱氨酸、二硫苏糖醇和硫代硫 酸钠)中培养；
3)侵染采用上述A的方法，不同的是将A中0D600为0.5的菌液EHA105/ PCAMBIA2301侵染，侵染时间为4h ；4)共培养采用上述A的方法；共培养3d，不同的是分别在共培养所用培养基和 不添加抗氧化剂(L-半胱氨酸，二硫苏糖醇和硫代硫酸钠)的共培养所用培养基中培养；分 别得到实验共培养外植体和对照共培养外植体。外植体的数目均为50，实验重复三次，结果取平均值。a:观察结果如下对照共培养外植体的表面(图8A)和切口面(图8E的左图)出现褐化现象，顶端 分生组织坏死(图8C，箭头所示，及图8E左图)，不利于诱导不定芽至最终成苗。实验共培养外植体褐化现象显著降低(图8B)；顶端分生组织正常(图8D)，降低 大豆下胚轴切口的褐化程度(图8E的右图，及8F的右图)。b 将实验共培养外植体和对照共培养外植体通过GUS组织化学染色，统计GUS基 因表达频率。结果如下对照共培养外植体GUS基因的表达频率为2.3%，实验共培养外植体 ⑶S基因的表达频率为62%。从上述结果可以看出，抗氧化剂处理可以减少褐化并增强⑶S基因在下胚轴分生 组织和顶端的表达。当把大豆下胚轴培养在不加抗氧化剂的培养基中时，GUS基因的瞬时 表达率为仅2. 3%，而将大豆下胚轴培养在含抗氧化剂培养基中，GUS基因的瞬时表达频率 增加到62%，比前者增加了 27倍。抗氧化剂可以显著降低大豆下胚轴切口的褐化程度，说 明GUS基因的瞬时表达率的提高与抗氧化剂降低大豆下胚轴切口的褐化程度有着密切的 关系。因此，在大豆的转基因过程中，在培养基中加入抗氧化剂能提高基因转化效率。对⑶S基因在下胚轴组织中的瞬时表达部位进行了研究，如图8E和8F (图8E为抗 氧化剂对下胚轴GUS基因瞬时表达的影响，且其中左图为无抗氧化剂处理的大豆下胚轴， 外植体褐化且未检测到GUS基因的表达。右图为GUS基因在抗氧化剂处理的下胚轴外植体 顶端分生组织表达。图8F为抗氧化剂增强大豆下胚轴⑶S基因的表达，其中左图为下胚 轴培养在无抗氧化剂的培养基上，外植体褐化。右图为下胚轴培养在含有抗氧化剂培养基， GUS基因在下胚轴强烈表达。)所示，染色部位大部分位于下胚轴维管束形成层组织。这些 结果说明，抗氧化剂主要增强了农杆菌对下胚轴的维管束形成层组织细胞的浸染。下胚轴 的维管束形成层细胞具有很强的分生能力，能迅速分化，这对提高大豆基因转化频率具有 重要作用。F、AS浓度对⑶S基因瞬时表达频率的影响1、受体大豆下胚轴的获得试验材料与上述一相同；大豆种子表面灭菌与上述一相同；受体大豆下胚轴与上述一相同；2、农杆菌制备和转化1)农杆菌制备与上述A方法相同；2)含有外源基因的重组农杆菌溶液的制备与A的方法基本相同，不同的是在液 体共培养培养基2中添加不同量的乙酰丁香酮(AS)，使乙酰丁香酮(AS)在液体共培养培养基 2 中的浓度分别为 O μ M，50 μ M，100 μ M，150 μ M，200 μ M，300 μ M 禾口 400 μ Μ，中培养；3)侵染采用上A的方法，不同的是将B中0D600为0. 5的菌液EHA105/ PCAMBIA2301侵染，侵染时间为4h ；4)共培养采用上述A的方法；共培养4周，在共培养所用培养基培养；得到共培 养外植体0、1、2、3、4、5、6。每处理外植体数为20个，实验重复三次，结果取平均值。GUS基因的转化率通过以下方法计算(产生转基因阳性芽的外植体数/用于侵染 的外植体数))X100。所述转基因阳性芽是指通过⑶S组织化学染色检测为阳性的芽；所 述⑶S组织化学染色与上述A方法相同。体视显微镜下拍照，体视显微镜下呈现蓝色的芽 鉴定为阳性芽，否则为阴性芽。结果显示，共培养外植体0(0 μ M)⑶S基因瞬时表达频率为21% ；共培养外植体1 (50 μ Μ)⑶S基因瞬时表达频率为52. 3% ；共培养外植体2 (100 μ Μ)⑶S基因瞬时表达频率为71. 2% ；共培养外植体3 (150 μ Μ)⑶S基因瞬时表达频率为77. 8% ；共培养外植体4(200 μ Μ)⑶S基因瞬时表达频率为83% ；共培养外植体5 (300 μ Μ)⑶S基因瞬时表达频率为81. 3% ；共培养外植体6 (400 μ Μ)⑶S基因瞬时表达频率为78. 6% ；作图如图9所示，图中条形柱从左往右编号依次为1，2，3，4，5，6，7，分别代表乙酰 丁香酮(AS)在液体共培养培养基中的为0μΜ，50μΜ，100μΜ，150μΜ，200μΜ，300μΜ和 400 μ M进行的7种处理。从图中看出，共培养阶段添加200 μ M乙酰丁香酮有助于转化频率 的提高和增加GUS基因瞬时表达频率。实施例2 转pCAMBIA2301质粒大豆植株及GUS基因在下胚轴的表达一、转pCAMBIA2301大豆植株的获得方法一1、受体大豆下胚轴的获得1)试验材料大豆(Glycine max)品种黑农442)大豆种子表面灭菌挑选无病、饱满的大豆种子平铺在敞口培养皿中，放入内 置-盛有IOOmL次氯酸钠原液烧杯的干燥器中，然后沿烧杯缓慢加入4mL浓盐酸，密闭 干燥器，置于通风橱中灭菌18h。将灭菌后的种子放置在萌发培养基(1/2MS基本培养基 +15，000mg/L 蔗糖 +7，500mg/L 琼脂，pH 5. 8)中，置于 25°C ,120 μ En^S-1 光强(光照周期 18/6h)的条件下培养5d。3)外植体的准备大豆下胚轴培养5d时，此时萌发大豆种皮破裂，初生叶(primary leaves)还未 露出子叶。在超净工作台中取出大豆，小心去掉种皮，将子叶剥离。然后用手术刀将顶芽切 除，切取具有顶端分生组织的Icm长的下胚轴作为受体大豆下胚轴。2、农杆菌制备和转化1)农杆菌制备农杆菌感受态的制备挑取土壤 农杆菌EHA105单菌落接种于5mL含50mg/L利福 平，50mg/L链霉素的YEP液体培养基(含10，000mg/L胰蛋白胨，10，000mg/L酵母提取物，5，000mg/L氯化钠，pH7. 0)中，28°C、250rpm振荡培养过夜；按1 100接种于40mL含50mg/ L利福平，50mg/L链霉素的YEP液体培养基中继续培养4_6h ；4°C，5，OOOrpm离心lOmin，去 上清；用600 μ L冰预冷0. 05mol/L的CaCL2溶液洗涤菌体；4°C，5，OOOrpm离心IOmin,去上 清；用200 μ L冰预冷0. 05mol/L的CaCL2重悬菌体，于4°C保存。质粒向农杆菌的转化在感受态农杆菌中加入约0. 5μ g的pCAMBIA2301 (www. cambia. org. au)质粒DNA (该质粒含有选择标记基因NPTII及⑶S报告基因)，轻轻混勻，冰 上放置5min ；然后置于液氮中3min ；迅速转移至37°C温育5min ；加入500 μ L YEP液体培养 基，28°C振荡培养5-6h ；5，OOOrpm离心3min，去大部分上清，剩200 μ L，悬浮菌体；均勻涂 布于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEP选择平板上，28°C倒置培养 两天，得到单菌落。挑取单菌落接种于5mL含50mg/L利福平，50mg/L链霉素的YEP液体培养 基中，28°C、250rpm振荡培养过夜，取1 μ L进行PCR鉴定，PCR所用的上游引物为NPTII-F 5，-GTCACTGAAGCGGGAAGGG-3，，下游引物为 NPTII-R :5，-CGGCGATACCGTAAAGCAC-3，，PCR 反 应体系为20 μ 1 的 PCR 反应混合液中含有2. 0 μ L 10XPCR buffer, 1. 6 μ L 2. 5mM dNTP mixture，1. 0μ L待检测的农杆菌菌液，0. 5μ L IOmM NPTII-F 引物 0. 5 μ L IOmM NPTII-R 引物，13. 9μ L ddH20。PCR 反应条件为94°C 10 分钟；94°C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 1 分 钟，30个循环；72°C 7分钟。阳性菌落得到493bp的特异性条带，阳性菌落命名为EHA105/ PCAMBIA2301。2)含有外源基因的重组农杆菌溶液的制备将上述得到的重组菌EHA105/pCAMBIA2301接种在含有50mg/L利福平、50mg/L 卡那霉素和50mg/L链霉素的YEP培养基中28°C振荡培养24h，至对数增长期(0D600约 0. 6-0. 8)，此时重组菌EHA105/pCAMBIA2301的菌液呈桔黄色可供转化使用。将0D6000. 8 的重组菌 EHA105/pCAMBIA2301 的菌液放入 30mL 离心管，3725rpm 离 心lOmin，弃上清，收集管底菌体，用液体共培养培养基(1/2MS基本培养基，3. 9g/L2_吗啡 酸-乙磺酸，0. 2g/L硫代硫酸钠，400mg/L L-半胱氨酸，0. 154g/L 二硫苏糖醇，200 μ mol/L 乙酰丁香酮，4mg/L 6-苄基腺嘌呤，5mg/L硝酸银，30，000mg/L蔗糖，pH 5.6)重悬菌体，将 菌液浓度调至OD值为0. 5，25°C静置Ih后备用，得到含有外源基因的重组农杆菌溶液。3)侵染将50个由1得到的受体大豆下胚轴浸入30mL上述获得的含有外源基因的重组农 杆菌溶液中进行侵染，期间不断振荡，侵染时间为4h ；4)共培养将经过侵染后的大豆下胚轴取出，在无菌的滤纸上吸干菌液，放在铺有滤纸的共 培养培养基(加6，000mg/L琼脂的液体共培养培养基)上，在25°C遮光条件下3d，得到共 培养后大豆下胚轴。共培养后将大豆下胚轴依次用蒸馏水冲洗3次，用含有羧苄青霉素和噻孢霉素液 体共培养培养基冲洗4次。5)芽诱导培养然后将冲洗后的大豆下胚轴转移到芽诱导培养基(1/2MS基本培养基，4mg/L 6 苄基腺嘌呤，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗糖，300mg/L羧苄青霉素，300mg/L噻孢霉 素，8，000mg/L琼脂，5mg/L硝酸银，pH 5.8)上恢复培养，培养温度为27°C，光照强度为70 μ EnT2S-1,光周期控制18/6h，培养6d，得到诱导后下胚轴。6)筛选培养将上述恢复培养后的诱导后下胚轴转移到筛选培养基(芽诱导培养基加100mg/L 卡那霉素，pH5. 8)上，每周继代一次，培养4周后得到不定芽(此时不定芽长度为2. 5cm)。 所述筛选培养的温度27°C，光照强度为70 μ EnT2S4,光周期控制18/6h光/暗。7)再生植株的生根与移栽待不定芽伸长为2. 5cm时，紧贴不定芽的基部将其切下，将切下的不定芽的基部 (即切口)浸入2mg/L吲哚丁酸水溶液中浸泡5min，然后用无菌滤纸吸干后转入生根培养 基(1/2MS基本培养基，20, 000mg/L蔗糖，150mg/L噻孢霉素，10mg/L卡那霉素，0. 8%琼脂， PH值为5. 6，27°C，培养15天，得到具有2cm的不定根的幼苗，将幼苗取出，用水冲去根部附 着的培养基，然后移栽到混合土中(草炭土和蛭石质量比1 1)，保湿培养1周后转入温室 进行正常的栽培管理，得到20株转pCAMBIA2301的再生大豆植株(下胚轴)。方法二、1、受体大豆下胚轴的获得1)试验材料与方法一相同；2)大豆种子表面灭菌与方法一基本相同，不同的是在22°C下培养6d;3)外植体的准备与方法一基本相同，不同的是切取具有顶端分生组织的0. 5cm 长的下胚轴作为受体大豆下胚轴；2、农杆菌制备和转化1)农杆菌制备与方法一相同；2)含有外源基因的重组农杆菌溶液的制备与方法一相同；3)侵染与方法一相同；
4)共培养与方法一基本相同，不同的是在22°C下培养；5)芽诱导培养与方法一基本相同，不同的是在25°C下培养；6)筛选培养与方法一基本相同，不同的是在25°C下培养；7)再生植株的生根与移栽与方法一基本相同，不同的是待不定芽伸长为3cm时， 紧贴不定芽的基部将其切下，将切下的不定芽的基部(即切口)浸入2mg/L吲哚丁酸水溶 液中浸泡2min ；且在25°C下培养得到具有3cm的不定根的幼苗。方法三、1、受体大豆下胚轴的获得1)试验材料与方法一相同；2)大豆种子表面灭菌与方法一基本相同，不同的是在23°C下培养6d;3)外植体的准备与方法一基本相同，不同的是切取具有顶端分生组织的0. 8cm 长的下胚轴作为受体大豆下胚轴；2、农杆菌制备和转化1)农杆菌制备与方法一相同；2)含有外源基因的重组农杆菌溶液的制备与方法一相同；3)侵染与方法一相同；4)共培养与方法一基本相同，不同的是在23°C下培养；
5)芽诱导培养与方法一基本相同，不同的是在28°C下培养；6)筛选培养与方法一基本相同，不同的是在28°C下培养；7)再生植株的生根与移栽与方法一基本相同，不同的是待不定芽伸长为4cm时， 紧贴不定芽的基部将其切下，将切下的不定芽的基部(即切口)浸入2mg/L吲哚丁酸水溶 液中浸泡3min ；且在28°C下培养得到具有4cm的不定根的幼苗。二、⑶S基因在下胚轴的表达检测方法一得到的下胚轴中的⑶S基因的表达。外植体的数目均为50，以下实验均重复三次，结果取平均值。用⑶S组织化学染色观察各个阶段的⑶S基因的表达，图10为质粒pCAMBIA2301 的部分物理图谱(含有GUS基因)。具体如下共培养结束两天后对外植体GUS组织化学染色，结果发现，GUS基因在外植体顶端 强烈表达，表达位置主要集中于初生芽(制备外植体时被切除)基部周围的分生组织(图 11A)。筛选培养一周后，对外植体⑶S组织化学染色，结果发现，表达⑶S基因的分生组 织开始增殖(图11B)并随着培养时间的延长逐步被诱导形成芽原基(图11C)。这些芽原基 分化形成不定芽，从图IlD可以看出，大豆下胚轴顶端分生组织分化形成芽原基并表达⑶S 基因，呈环状分布于初生芽基部周围。与之对比，初生芽残基组织和表皮组织没有被⑶S染 色，说明初生芽基部的分生组织具有强烈的分生和接受外源DNA的能力，是农杆菌转化下 胚轴过程中的“靶细胞组织”。在筛选培养两周的下胚轴高频再生不定芽，箭头所示为GUS阳性的再生不定芽， 其周围的非转化细胞逐步褐化死亡(图11E)。转化的下胚轴外植体在筛选培养基上培养4 周，不定芽即可伸长至3cm，可以转移至生根培养基。通过进一步⑶S组织化学染色转pCAMBIA2301质粒大豆植株的不定芽、叶片、种子 (图12B右图为成熟小叶的染色，图12C为不同转基因株系的成熟小叶的染色、图12D为未 成熟种子的染色)，对转基因植株进行筛选(图12)，结果为转pCAMBIA2301质粒大豆植株不定芽的⑶S染色阳性为20株(图12A)；转pCAMBIA2301质粒大豆植株的叶片的GUS染色阳性为20株(图12B、12C)；转pCAMBIA2301质粒大豆植株的种子的⑶S染色阳性为20株(图12D)；因此，共得到20株转pCAMBIA2301质粒大豆阳性大豆植株，且可育。采用同样的方法检测方法二和方法三得到的下胚轴中的GUS基因的表达，结果与 方法一无显著差异。
权利要求
1. 一种大豆遗传转化方法，包括如下步骤1)用含有外源基因的重组农杆菌溶液侵染大豆的下胚轴，得到侵染后下胚轴；2)将步骤1)得到的侵染后下胚轴进行共培养得到共培养后下胚轴；3)将步骤2)得到的共培养后下胚轴进行芽诱导培养得到芽诱导后的下胚轴；4)将步骤3)得到的芽诱导后的下胚轴进行筛选培养得到筛选后存活的下胚轴；5)从步骤4)得到的筛选后存活的下胚轴中取下不定芽，将不定芽进行生根培养，得到 转基因大豆幼苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述大豆的下胚轴为具有顶端分生组织的0. 5cm-lcm长的下胚轴，所述大豆的下胚轴 具体为具有顶端分生组织的0. 5cm、0. 8cm或Icm长的下胚轴；所述受体大豆的下胚轴按照如下方法制备大豆种子萌发5天-6天，去除种皮、子叶、 顶芽，得到具有顶端分生组织的0. 5cm-lcm长的下胚轴；所述受体大豆的下胚轴具体按照如下方法制备大豆种子萌发5天或6天，去除种皮、 子叶、顶芽，得到具有顶端分生组织的0. 5cm、0. 8cm或Icm长的下胚轴。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述含有外源基因的重组农杆菌溶液为按照如下方法制备所述含有外源 基因的重组农杆菌重悬于液体共培养培养基中，调至OD值为0. 3-0. 8，25°C静置lh，得到重 组农杆菌溶液；所述OD值具体为0. 3,0. 4,0. 5,0. 6或0. 8 ；所述液体共培养培养基按照如下方法制备向1/2MS培养基中添加2-吗啡酸-乙磺 酸、硫代硫酸钠、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、乙酰丁香酮、6-苄基腺嘌呤、硝酸银和蔗糖，得 到所述液体共培养培养基，所述2-吗啡酸-乙磺酸在所述液体共培养培养基中的浓度为 3. 9g/L，所述硫代硫酸钠在所述液体共培养培养基中的浓度为0. 2g/L，所述L-半胱氨酸在 所述液体共培养培养基中的浓度为400mg/L，所述二硫苏糖醇在所述液体共培养培养基中 的浓度为0. 154g/L，所述乙酰丁香酮在所述液体共培养培养基中的浓度为200ymol/L，所 述6-苄基腺嘌呤在所述液体共培养培养基中的浓度为4mg/L，所述硝酸银在所述液体共培 养培养基中的浓度为5mg/L，所述蔗糖在所述液体共培养培养基中的浓度为30，000mg/L， 所述液体共培养培养基的PH为5. 6 ；步骤2)中，所述共培养所用培养基按照如下方法制备向所述液体共培养培养基中添 加琼脂得到共培养所用培养基，所述琼脂在所述共培养所用培养基中的浓度为6，000mg/L， 所述共培养所用培养基的PH为5. 6 ；步骤3)中，所述芽诱导培养所用培养基按照如下方法制备向1/2MS培养基中添加 6-苄基腺嘌呤、吲哚丁酸、蔗糖、羧苄青霉素、噻孢霉素、硝酸银和琼脂，得到所述芽诱导培 养所用培养基，所述6-苄基腺嘌呤在所述芽诱导培养所用培养基中的浓度为4mg/L，所述 吲哚丁酸在所述芽诱导培养所用培养基中的浓度为0. 2mg/L，所述蔗糖在所述芽诱导培养 所用培养基中的浓度为30，000mg/L，所述羧苄青霉素在所述芽诱导培养所用培养基中的浓 度为300mg/L，所述噻孢霉素在所述芽诱导培养所用培养基中的浓度为300mg/L，所述硝酸 银在所述芽诱导培养所用培养基中的浓度为5mg/L，所述琼脂在所述芽诱导培养所用培养 基中的浓度为8，000mg/L，所述芽诱导培养所用培养基的pH为5. 8 ；步骤4)中，所述筛选培养所用培养基按照如下方法制备向所述芽诱导培养所用培养基中添加卡那霉素，得到所述筛选培养所用培养基，所述卡那霉素在所述筛选培养所用培 养基中的浓度为100mg/L，所述筛选培养所用培养基的pH为5. 8 ；步骤5)中，所述生根培养所用培养基按照如下方法制备向1/2MS培养基中添加蔗 糖、噻孢霉素、卡那霉素和琼脂，得到所述生根培养所用培养基，所述蔗糖在所述生根培养 所用培养基中的浓度为20，000mg/L，所述噻孢霉素在所述生根培养所用培养基中的浓度为 150mg/L，所述卡那霉素在所述生根培养所用培养基中的浓度为10mg/L，所述琼脂在所述生 根培养所用培养基中的浓度为8，000mg/L，所述生根培养所用培养基的pH值为5. 6。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述侵染的时间为0. 5h-8h ；所述侵染的方式为将所述受体大豆的下胚 轴浸入含有外源基因的重组农杆菌溶液中；所述侵染的时间具体为0. 5h，lh, 1. 5h，2h，3h， 4h，5h，6h、7h 或 8h ；步骤2)中，所述共培养的温度为22°C _25°C，所述共培养的温度具体为22°C、23°C或 25°C，所述共培养为暗培养，所述共培养的时间为2天-5天；所述共培养的时间具体为2 天、3天、4天或5天；步骤3)中，所述芽诱导培养的温度25°C _28°C，所述芽诱导培养的温度具体为25V、 27°C或28°C，光照强度为70 μ EnT2Sl光周期控制18/6h (光/暗)，培养时间为6天；步骤4)中，所述筛选培养的温度25 °C -28 °C，所述筛选培养的温度具体为25°C、27°C或 28°C，光照强度为70 μ EnT2S^光周期控制18/6h光/暗，且每周继代一次；所述筛选培养的 时间为4周；步骤5)中，所述生根培养的温度25 °C -28 °C，所述生根培养的温度具体为25°C、27°C或 28°C，光照强度为70 μ EnT2S-1,光周期控制18/6h光/暗，培养时间15天。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步骤5)中，所述不定芽的长度为2. 5cm-4cm0
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于步骤5)中，所述不定芽的长度为2. 5cm、3cm或4cm。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于在步骤2)后，步骤3)前，还包括依次用蒸馏水和含有羧苄青霉素和噻孢霉素液体共培 养培养基冲洗所述共培养后下胚轴的步骤。所述步骤5)中，所述取下不定芽为自不定芽的基部将不定芽切下；在所述取下不定芽 的步骤后，所述将不定芽进行生根培养步骤前，还包括将切下不定芽的剪切端浸入浓度为 2mg/L的吲哚丁酸水溶液中浸泡的步骤。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述依次用蒸馏水和含有羧苄青霉素和噻孢霉素液体共培养培养基冲洗所述共培养 后下胚轴的步骤中，所述含有羧苄青霉素和噻孢霉素的液体共培养培养基按照如下方法制 备向所述液体共培养培养基中添加羧苄青霉素和噻孢霉素，得到的含有羧苄青霉素和噻 孢霉素的液体共培养培养基，所述羧苄青霉素在所述含有羧苄青霉素和噻孢霉素的液体共 培养培养基中的浓度为300mg/L，所述噻孢霉素在所述含有羧苄青霉素和噻孢霉素的液体 共培养培养基中的浓度为300mg/L ；所述将切下不定芽的剪切端浸入浓度为2mg/L的吲哚丁酸水溶液中浸泡的步骤中，所述浸泡时间为2min-5min ；所述浸泡时间具体为2min、3min或5min ；所述切下所述不定芽 的位置为紧贴不定芽的基部；所述方法中，在所述步骤5)后，还包括将生根培养得到的具有大于2cm的不定根的幼 苗移栽到混合土中，培养1周，得到转基因大豆植株的步骤，所述混合土由草炭土和蛭石组 成，所述草炭土和蛭石的质量比为1 1，所述不定根的长度优选为2cm-4cm，具体为2cm、 3cm 或 4cm。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述大豆的下胚轴制备方法中，所述萌发所用的培养基按照如下方法制备向1/2MS 培养基中添加蔗糖和琼脂，得到所述萌发培养所用的培养基，所述蔗糖在所述萌发培养所 用的培养基中的浓度为15，000mg/L,所述琼脂在所述萌发培养所用的培养基中的浓度为 7，500mg/L，所述萌发所用的培养基的pH为5. 8 ；所述萌发培养的温度为22°C _25°C，所述萌发培养的温度具体为22°C、23°C、25°C，光 照强度为120 μ EnT2S^光照周期为18h/6h光照/暗。
10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述含有外源基因的重组农杆菌为如下1)或2)1)、将载体pCAMBIA2301导入根癌农杆菌LBA4404得到的重组农杆菌；2)、将载体pCAMBIA2301导入根癌农杆菌EHA105得到的重组农杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种大豆遗传转化方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将外源基因导入大豆的下胚轴中，得到转基因大豆。所述大豆的下胚轴为含有0.5cm-1cm顶端分生组织的下胚轴；所述大豆的下胚轴按照如下方法制备大豆种子萌发5天-6天，去除种皮、子叶、顶芽，得到含有0.5cm-1cm顶端分生组织的下胚轴为大豆的下胚轴。本发明提供了的利用下胚轴为受体建立大豆遗传转化体系的方法，可在较短时间内快速高效产生不定芽，用于大豆基因工程的基本操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和现实意义。
文档编号A01H5/00GK102002512SQ201010534520
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者刘超, 吴韩英, 武旺, 王戈亮, 许亦农, 赵明明 申请人:中国科学院植物研究所