专利名称：一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及其应用，属微生物农药 技术领域。
背景技术：
植物病原真菌的危害给种植农业带来的危害是无法估量的。中国发现的烟草真菌 病害28种，所造成的经济损失占烟草病害的37. 8%，其中由Phytophthoranicotianae侵入 引起的烟草黑胫病危害最为严重(祝明亮，雷丽萍，2008)。云南作为我国名贵中药材三七 (Panax notoginseng)的主产区，产量占全国90%以上，2009年三七农业就创收16. 9亿元。 Fusarium spp.等病原菌引起的三七根腐病常年发病率一般在5% 20%，严重的可损失 70%以上，甚至绝收(缪作清等，2006)。由Plasmodiophora brassicae危害引起的十字花 科作物根肿病发病率一般在10-30%左右(王靖等，2008)。目前，对以上病害的防治仍然以 化学防治为主，由于都是土传病害，施用的一般都是高毒、高残留农药。近年来，随着人们对 生活质量的日益重视，有机农业及其产品迎来了前所未有的发展契机。有机蔬菜已逐步摆 上中高等收入家庭的餐桌；有机烟叶被认为是烟草行业未来的发展方向；三七出口常年面 临的绿色贸易壁垒。这些有机农业种植都迫切需要高效的生物农药。Bacillus methylotrophicus是韩国人2010年作为新种报道的一种可以代谢甲 醇、促进植物生长的细菌(Madhaiyan et al.，2010)。该微生物对植物病原真菌的拮抗特性 至今未见公开报道。参考文献祝明亮，雷丽萍.2008.烟草微生物学.科学技术出版社，北京，P1-384.缪作清等，2006.三七根腐病病原研究.中国农业科学，39(7) :1371-1378.王靖等，2008.油菜根肿病症状、病原形态及产量损失研究.中国油料作物学报， 30(1) :112-115.Madhaiyan Μ,Poonguzhali S,Kwon Sff,Sa TM. 2010. Bacillus methylotrophicus sp. nov.a novel species of methanol utilizing, plant-growth promoting bacteriumisolated from rice.International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology 60 :2490-2495.
发明内容
本发明的目的在于提供一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及其应用。本发明从烟草内生菌中筛选具有工业化生产前景的菌株，为农业生产提供一种具 较好的土传真菌病害生防微生物。本发明具体是这样实现的本发明人从云南烤烟品种N(^97叶片内生菌中利用选择性培养基筛选、改良后获 得Bacillus methylotrophicus Mo-^ii菌株。Mo-^ii已于2010年10月12日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 4207。Bacillus methylotrophicus Mo-Bm 在 AMS 培养基(MgSO4. 7H20 :lg，CaCl2O. 2g, EDTA 0. 004g, NH4Cl 0. 5g, FeSO4. 7H20 0. 02g，MnCl2. H2O 0. Olg，ZnSO4. 7H200. Olg，琼脂 18g，补水至 1000ml，pH6. 8)上菌落乳白色， 凸起，边缘规格，生长缓慢，下培养96小时菌落直径0. 2-lmm,最适生长温度为，最 适生长 PH 值为 7。利用引物 5，-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T_3，，5，_AGA GTT TGATCM TGG CTC AG-3’经PCR扩展该菌株的16S rRNA基因，获得的序列提交到GeneBank公共数据库， 其序列号为HQ325853，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。Mo-Bm菌株能耐受0. 5-2% (V/V)的甲醇，是鉴别该菌株的次要特征依据。利用Mo-aii菌株制备的生防菌剂对防治烟草黑胫病，十字花科蔬菜根肿病和三七 根腐病的防效在70%以上。能用于种子处理，移栽期和成株期。施用时将Mo-aii菌株制备 的生防菌剂施入作物根际周围或兑水灌根。对病害发生严重地区，种子处理，移栽期和成株 期分别施用一次效果最好。利用Bacillus methylotrophicus Mo-Bm菌株制备的生防菌剂具有成本低、防效 高、无残留、对人畜安全的特点，是有机农业种植中防治真菌病害的高效生物农药。
具体实施例方式1.本发明中Mo-Bm的培养及菌剂制备Mo-aii菌株试管斜面种子培养将该菌株的菌体到牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛 肉膏 5g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 20g，水 lOOOmL，琼脂 20g，pH 7.2-7.4)斜面上，15_40°C 下培养1-5天后获得斜面种子，适宜的培养条件是下培养2天。Mo-aii菌株液体种子的液体培养将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液 体培养基(牛肉膏蛋白胨固体培养基不添加琼脂)中，15-40°C，50-350rpm条件下摇床培养 2-7天。最适培养条件为^°C，200rpm条件下培养3。Mo-aii菌株发酵罐大量培养将液体种子按1-5% (V/V)的比例接入发酵罐中的 PDB (去皮马铃薯200g切碎，用水煮沸30分钟后过滤取滤液，蔗糖20g，补水至1000ml， PH自然)培养基中，在20-1000升发酵罐中的培养条件控制在温度^5-32°C，搅拌速度 150-250rpm，发酵时间48-96小时。Mo-Bm可湿性菌剂的制备经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢无作为原药 与适量的硅藻土、木钠、K12、蔗糖、海藻酸钠混合后在65°C以下烘干或晾干至水分含量小于 5 %，粉碎后制成可湿性粉剂。菌剂需保证Mo-aii的活菌数含量在IXlO9个/g以上。2.本发明菌剂对烟草黑胫病的防效试验烟草黑胫病病原菌(Phytophthora nicotianae)的培养在PDA培养基(在PDB 培养基的基础上添加20g琼脂)固体平板上接种分离自田间的烟草黑胫病病原菌，28°C下 培养5天后挑起新鲜菌丝体接种于PDB液体培养基中，下，200rpm下摇床培养5天后备用。供试药剂a.活菌数含量为5 X IO9个/g的Mo-Bm可湿性菌剂；b. 58%甲霜灵锰锌。防效试验方法烤烟常规漂浮育苗时，50g Mo-Bm可湿性菌剂用300ml水稀释后与 Ikg育基质混勻；阳性对照处理为58%甲霜灵锰锌可湿性粉剂(西安鼎盛生物化工有限公司)Ig用300ml水稀释后与Ikg育基质混勻；空白对照为300ml水与Ikg育基质混勻。待 烟苗长至5-6片叶子时，在直径为15cm的、装有500g 土壤(沙土 腐殖土 = 1 1)的每 一花钵移栽一株烟苗，在烟根接种烟草黑胫病病原菌5ml，每处理三个重复，每重复5盆。肥 水管理按常规方法进行，在室温温室内生长90天后统计各处理的烟草黑胫病病的发病率， 按以下公式计算发病率和防效发病率=发病株数/调查株数X 100%防效(％ )=空白对照的发病率-药剂处理的发病率试验结果表明空白对照的发病率为87. 5% ；甲霜灵锰锌可湿性菌剂处理的发病 率为10. 8%，防效为76. 7% ；Mo-Bm可湿性菌剂处理的发病率为11. 3%，防效为76. 2%，与 化学农药58%甲霜灵锰锌可湿性菌剂的防治效果相当。3. Mo-Bm菌剂防治白菜根肿病的田间试验由于白菜根肿病病原菌不能人工培养，本试验在重病田块进行。在白菜种子漂浮 育苗时，将菌体含量为5 X IO9个/g的Mo-Bm可湿性菌剂按1 300 (W/W)的比例与育苗基 质混合，其余管理按漂浮育苗的常规操作进行。移栽时在每株苗的根部周围撒施3克菌剂， 移栽后1个月，在每株作物地上部再撒施3克菌剂，结合浇水将菌剂冲入土壤中。对照药剂 为75%白菌清可湿性粉剂(淄博金苹果生化科技有限公司)，用量与和施用方法同Mo-Bm 可湿性菌剂。空白对照不施用任何药剂，每处理三个重复，每重复50株苗。白菜移栽后的 肥水管理按常规进行，移栽3个月后统计各处理的发病率，按以下公式计算发病率和防效发病率=发病株数/调查株数X 100%防效(％ )=空白对照的发病率-药剂处理的发病率试验结果表明空白对照的发病率为97. 3% ；白菌清处理的发病率为5.6%，防效 为91. 7% ；Mo-Bm可湿性菌剂处理的发病率为9. 5%，防效为87. 8%，略低于化学农药75% 白菌清可湿性粉剂。4. Mo-Bm菌剂防治防治三七根腐病的田间试验本试验在云南省文山州三七研究院的大棚试验地进行，在试验地连作三七25年， 三七根腐病的发病率在90 %以上。在三七育苗时，将IOOg菌体含量为5 X IO9个/g的Mo-Bm 可湿性粉剂用IL水溶化，加入Ikg三七种子混勻，使菌剂粘附在种子上，然后按常规育种方 法管理。移栽时每亩三七苗的用IOkg菌剂兑水200kg均勻灌根，移栽一年后用相同剂量的 菌剂和方式再施用一次。对照药剂为50%的农利灵可湿性粉剂(德国巴斯夫公司)，用量 为每亩^g，施用方法同Mo-aii粉剂。空白对照不施用任何药剂，每处理三个重复，每重复 100株苗。三七移栽后的肥水管理按常规进行，移栽两年后统计各处理的发病率，按以下公 式计算发病率和防效发病率=发病株数/调查株数X 100%防效(％ )=空白对照的发病率-药剂处理的发病率试验结果表明空白对照的发病率为100% ；农利灵处理的发病率为25. 6%，防效 为74. 4% ；Mo-Bm7可湿性粉剂处理的发病率为21. 5%，防效为78. 5%，与50%的农利灵可 湿性粉剂防效相当。
权利要求
1.一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物，其特征在于所用的生防微生物为 Bacillus methylotrophicus Mo-Bm菌株，该菌株2010年10月12日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC No. 4207。
2.权利要求1所述的广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物，其特征在于Mo-aii菌株 作为制备防治烟草黑胫病，十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病菌剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种广谱性拮抗植物病原真菌的生防微生物及其应用，属于微生物农药技术领域。本发明的微生物为Bacillus methylotrophicus Mo-Bm菌株，于2010年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.4207。Mo-Bm菌株的16S rRNA基因序列(此序列在GeneBank数据库中的序列号为HQ325853)是鉴别该菌株的主要特征依据；Mo-Bm菌株能耐受0.5-2％(V/V)的甲醇，是鉴别该菌株的次要特征依据。本发明的微生物菌体及其代谢产物，能与农药常规吸附载体和助剂制成Mo-Bm可湿性粉剂生防菌剂。该菌剂对烟草黑胫病，十字花科蔬菜根肿病和三七根腐病的防效在70％以上。本发明的生防菌剂具有成本低、防效高、无残留、对人畜安全的特点，是有机农业种植中防治真菌病害的高效生物农药。
文档编号A01N63/02GK102120969SQ201010561580
公开日2011年7月13日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者周峰, 林碧莲, 莫明和, 黄英 申请人:云南大学