专利名称：一种用于胚胎或细胞的冷冻液及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于胚胎学或细胞生物学领域，涉及ー种用于胚胎或细胞的冷冻液及其用途。本发明还涉及ー种用于胚胎或细胞冷冻的试剂盒、以及ー种冷冻胚胎或细胞的方法。
背景技术：
在胚胎或细胞冷冻的过程中，胚胎或卵母细胞所受到的伤害主要来自于冰晶的形成、冷冻保护剂的毒性以及渗透压压力。目前胚胎或卵母细胞的冷冻方法主要有两种慢速冷冻(又名程序化冷冻)和玻璃化冷冻。玻璃化冻存是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。该方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。
所述冷冻保护剂是指在冷冻液中添加的防止冰晶形成的试剂，主要分为两类渗透性冷冻保护剂和非滲透性冷冻保护剂。滲透性冷冻保护剂可以滲透到细胞内，一般是ー些小分子物质，主要包括甘油、DMS0、こニ醇、丙ニ醇、こ酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，滲透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分滲透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。非滲透性冷冻保护剂不能滲透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚こ烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚こニ醇、葡聚糖、白蛋白以及羟こ基淀粉等。其保护机制的假说很多，其中有ー种可能是，聚こ烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，減少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。非滲透型保护剂常用是ニ糖，例如蔗糖、半乳糖、海藻糖等，其中最常用的是蔗糖。不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。在冷冻的时候，非滲透型保护剂(常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。)通常是和渗透型保护剂混合使用的。其中二糖主要起维持渗透压的作用，并且可以减少进入细胞内的こニ醇，从而避免过多的こニ醇对细胞的毒性。因此，目前玻璃化冷冻过程中使用的冷冻液中一般都含有蔗糖。
发明内容
本发明人进行了大量的实验和创造性的劳动，得到了ー种不含有蔗糖的冷冻液，并且惊奇地发现，该冷冻液能够显著地提高胚胎或卵母细胞的存活率。由此提供了下述发明本发明的ー个方面涉及ー种用于胚胎或细胞的冷冻液，包含培养液、血清、以及冷冻保护剂，所述冷冻液不含有蔗糖。根据本发明的任一项所述的冷冻液，其中，所述冷冻液不含有蔗糖、半乳糖和海藻糖中的任何ー种。根据本发明的任一项所述的冷冻液，其中，所述冷冻液不含有任何ニ糖。根据本发明的任一项所述的冷冻液，其中，所述冷冻液不含有任何糖类。根据本发明的任一项所述的冷冻液，其中，所述培养液为选自TCM-199、PBSS、以及HTF中的ー种或多种。具体地，所述培养液(例如TCM-199、PBSS、和/或HTF)为使用Ifeps缓冲液配制。Heps缓冲液是ー种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。H印s缓冲液的使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
根据本发明的任一项所述的冷冻液，其中，按照冷冻液的总体积，所述培养液的含量为 30% -60% (v/v);具体地，为 40% -50% (v/v)。根据本发明的任一项所述的冷冻液，其中，所述血清为牛血清和/或马血清。具体地，所述牛血清为胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)或小牛血清(bovine serum, BS)。胎牛血清和小牛血清都可以，从技术效果来看，胎牛血清可能好ー些，但是从成本考虑，则优选小牛血清。根据本发明的任一项所述的冷冻液，其中，按照冷冻液的总体积，所述血清的含量为 5% -50% (v/v);具体地，为 15% -25% (v/v);更具体地，为 20% (v/v)。根据本发明的任一项所述的冷冻液，其中，所述冷冻保护剂为选自丙ニ醇、こニ醇(EG)、甘油、DMSO(dimethylsulfoxide, ニ甲基亚讽)中的一种或多种，根据本发明的任一项所述的冷冻液，其中，按照冷冻液的总体积，所述冷冻保护剂的含量为 20% -50% (v/v);具体地，为 30% -40% (v/v)。在本发明的一个实施方案中，所述冷冻液的组分及含量如下H印es 缓冲液配制的 TCM-19940% -50% (v/v)牛血清15% -25% (v/v)こニ醇15% -20% (v/v)DMSO15% -20% (v/v) 具体地，Hepe s 缓冲液配制的 TCM-199 的含量为 40%、41 %、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、或 50% ;和/或牛血清的含量为15%、16%、17%、18%、19%、20%、21 %、22%、23%、24%、或25% ;和/或こニ醇的含量为15%、16%、17%、18%、19%、或 20% ;和/或DMSO 的含量为 15 %、16 %、17 %、18 %、19 %、或 20% (v/v)。在本发明的ー个具体的实施方案中，所述冷冻液的组分及含量如下Hepes 缓冲液配制的 TCM-19944% (v/v)牛血清20% (v/v)こニ醇18% (v/v)DMSO18% (v/v)。本发明的冷冻液可以用于胚胎或者细胞的冷冻。
本发明冷冻液的制备可以按照上述任一项冷冻液所述的组分和含量，在室温下，将各组分混和均匀即可，可选地，还包含进 行搅拌的步骤。各组分的添加并无先后顺序，所述血清也可以预先加在培养液中。本发明的另ー个方面涉及ー种用于胚胎或细胞冷冻试剂盒，其包含本发明的冷冻液；优选地，所述试剂盒还包含预冻液。所述预冻液可以采用现有技术中已知的预冻液。在本发明的一个实施方案中，所述预冻液的组分及含量如下H印es 缓冲液配制的 TCM-19965% (v/v)牛血清20% (v/v)こニ醇7.5% (v/v)DMSO7.5% (v/v)。HEPES包括HEPES酸和HEPES盐，用于在溶液中起缓冲作用，所述“!fepes缓冲液配制的TCM-199”是指在TCM199中加入了 HEPES用于缓冲pH值。本发明的又一方面涉及ー种冷冻胚胎或者细胞的方法，包括使用本发明的冷冻液的步骤；具体地，包括下述步骤I)将胚胎或细胞在37°C _40°C预热的预冻液里平衡5-10分钟；2)将胚胎或细胞转移至37°C _40°C预热的冷冻液，在平衡20-30秒后，转移至玻璃化冷冻载体上，并且迅速将载体沉入液氮中。上述步骤I)和/或2)中，具体地，预热的温度为39°C。在本发明的一个实施方案中，所述玻璃化冷冻载体为Cryotop或0PS。在本发明的一个实施方案中，步骤2)中从胚胎或细胞放入冷冻液至放入液氮的时间控制在30-60秒之间；具体地，在43-48秒之间。本发明的还一方面涉及本发明的冷冻液在胚胎或细胞冷冻中的用途；具体地，所述胚胎为哺乳动物的胚胎特别是哺乳动物的囊胚，包括但不限干猪囊胚、牛囊胚、羊囊胚、或鼠囊胚；所述细胞为哺乳动物的生埴细胞或干细胞；具体地，所述生埴细胞为哺乳动物的卵母细胞，包括但不限于猪卵母细胞、牛卵母细胞、羊卵母细胞、或鼠卵母细胞；具体地，所述干细胞为胚胎干细胞，包括但不限于人胚胎干细胞、猪胚胎干细胞、牛胚胎干细胞、羊胚胎干细胞、或鼠胚胎干细胞。在本发明中，如果没有特殊说明，术语“含量”均为在冷冻液的总体积中的体积含量(v/v)。在本发明中，如果没有特殊说明，术语“胚胎”为哺乳动物的胚胎特别是哺乳动物的囊胚，包括但不限于猪囊胚、牛囊胚、羊囊胚、或鼠囊胚。在本发明中，如果没有特殊说明，术语“细胞”为哺乳动物的生殖细胞或干细胞；具体地，所述生殖细胞为哺乳动物的卵母细胞，包括但不限于猪卵母细胞、牛卵母细胞、羊卵母细胞、或鼠卵母细胞；具体地，所述干细胞为胚胎干细胞，包括但不限于猪胚胎干细胞、牛胚胎干细胞、羊胚胎干细胞、或鼠胚胎干细胞。发明的有益效果本发明的冷冻液能够有效提高胚胎或者细胞特别是卵母细胞和胚胎干细胞的冷冻存活率。在做对冷冻极其敏感的猪的囊胚的玻璃化冷冻试验吋，能够将冷冻存活率提高至70%以上甚至更高。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例I :用于胚胎或细胞的冷冻液的制备冷冻液的组分及含量如下Hepes 缓冲液配制的 TCM-199 44% (v/v)小牛血清20% (v/v)こニ醇18% (v/v)DMSO18% (v/v)。在室温下将上述各组分混和，并搅拌均匀，得到冷冻液。实施例2 :猪囊杯冷冻试齡I.试剂及耗材预冻液7.5% (v/v)こニ醇，7. 5% (v/v)DMS0, 20% (v/v)小牛血清，65% (v/v)Hepes缓冲液配制的TCM-199。预冻液的制备为现有技术，例如在室温下将上述各组分混和并搅拌均匀即可。冷冻液实施例I中制备的冷冻液。I号复苏液含20% (v/v)小牛血清和I. OM蔗糖的TCM-199。2号复苏液含20% (v/v)小牛血清和O. 5M蔗糖的TCM-199。3号复苏液含20% (v/v)小牛血清的TCM-199。4号复苏液含20% (v/v)小牛血清的TCM-199。2.试验方法冷冻流程I)将胚胎(猪囊胚)在39°C预热的预冻液里平衡5-10分钟。2)将胚胎转移至39°C预热的冷冻液，在平衡20-30秒后，将胚胎转移至Cryotop玻璃化冷冻载体上，并且迅速将载体沉入液氮中。从胚胎放入2号冷冻液到放入液氮，时间控制为43-48秒。复苏流程I)将载体迅速从液氮中拿出，将含胚胎的部分沉入39°C预热的I号复苏液，轻弹载体，使得胚胎从载体上脱落至复苏液。胚胎在I号复苏液中停留I分钟。2)将胚胎转入39°C预热的2号复苏液，停留3分钟。3)将胚胎转入39°C预热的3号复苏液，停留5分钟。4)将胚胎转入39°C预热的4号复苏液，停留5分钟。5)将胚胎转入胚胎培养液，如PZM-3，置入培养箱继续培养，并于16h后观察結果。按照上述方法将16批次生长状态良好的囊胚同时进行冷冻，每批次设置4- 6个平行试验。观察保存結果。同时设置常规冷冻液进行冻存对照试验，其中使用常规冷冻液的冷冻和解冻流程与使用本发明的冷冻液相同。常规冷冻液的配方如下47 % Hepes缓冲液配制的TCM-199，20 %小牛血清
(cattleserum), 16. 5% こニ醇，16. 5% DMS0, O. 3M 鹿糖(sucrose)。常规预冻液的配方如下65 % Hepes缓冲液配制的TCM-199，20 %小牛血清
(cattleserum), 7. 5% こニ醇，7. 5% DMS0,0. 7M 鹿糖(sucruse)。3.试验结果试验冻存的16个批次的囊胚，存活率如表I所示。统计后结果为Mean土S.E. :79.1% ±5%; 对照组囊胚存活率统计结果为Mean土S.E. :27. 9% ±2%。表I :本发明的冷冻液和常规冷冻液对猪囊胚的冻存效果
妣汝I_ 试验组 对照组_^
- 裳胚数「存活数「存活率囊胚数]存活数I存活率
154 80%5 ' I20%
255 100% 5 ' 240%
353 60%5 ' 2 40%
—4__5__2__40%__5__I__20% —
54375 % 4 ' I25%
65480% 5 ' 240%
755100% 5 ' I20%
86467 % 6 233%9 6350% 6 233%
1066100%6'I17%
116350%6'I17%
126583 %6'I17%
1366100%6'233%
1466100%6'233%
1555100%5'240%
165480%5'I20%总囊胚囊胚存平均存总囊胜囊胚存平均存—
__数活总数活率__数活总数活率
合计 I: 86 ] 68 J 79. I % J 86 ] 24 1: 27.9 %结果表明，本冷冻保护剂对囊胚的冻存效率比常规冷冻液高，并且性能更为稳定。实施例3 :猪卵母细胞冷冻试验I.试剂及耗材预冻液7.5% (v/v)こニ醇，7. 5% (v/v)DMS0, 20% (v/v)小牛血清，65% (v/v)Hepes缓冲液配制的TCM-199。冷冻液实施例I中制备的冷冻液。I号复苏液含20% (v/v)小牛血清和I. OM蔗糖的TCM-199。
2号复苏液含20% (v/v)小牛血清和O. 5M蔗糖的TCM-199。3号复苏液含20% (v/v)小牛血清的TCM-199。4号复苏液含20% (v/v)小牛血清的TCM-199。2.试验方法冷冻流程I)将培育成熟的卵母细胞在39°C预热的预冻液里平衡5-10分钟。2)将前述的卵母细胞转移至39°C预热的冷冻液，在平衡20-30秒后，将前述卵母细胞转移至Cryotop玻璃化冷冻载体上，并且迅速将载体沉入液氮中。从胚胎放入2号冷冻液到放入液氮，时间控制为43-48秒。
复苏流程I)将载体迅速从液氮中拿出，将含前述的卵母细胞的部分沉入39°C预热的I号复苏液，轻弹载体，使得前述的卵母细胞从载体上脱落至复苏液。前述的卵母细胞在I号复苏液中停留I分钟。2)将前述的卵母细胞转入39°C预热的2号复苏液，停留3分钟。3)将前述的卵母细胞转入39°C预热的3号复苏液，停留5分钟。4)将前述的卵母细胞转入39°C预热的4号复苏液，停留5分钟。5)将前述的卵母细胞转入胚胎培养液，如PZM-3，置入培养箱继续培养，并于16h后观察結果。按照上述方法将20批次生长状态良好的前述的卵母细胞同时进行冷冻，每批次设置10-30个平行试验，观察保存結果。同时设置常规冷冻液进行冻存对照试验，其中使用常规冷冻液的冷冻和解冻流程与使用本发明的冷冻液相同。常规冷冻液和常规预冻液的配方与实施例2中相同。3.试验结果试验冻存的20个批次的卵母细胞，存活率如表2所示。统计后结果为Mean土S.E. :77.8% ±1.69% ；对照组卵母细胞存活率统计结果为Mean土S.E. :27. 3% ± I. 78%。表2 :本发明的冷冻液和常规冷冻液对猪卵母细胞的冻存效果
权利要求
1.一种用于胚胎或细胞的冷冻液，包含培养液、血清、以及冷冻保护剂，所述冷冻液不含有蔗糖。
2.根据权利要求I所述的冷冻液，其中，所述冷冻液进ー步不含有半乳糖或海藻糖；更进ー步，所述冷冻液不含有任何ニ糖；再进ー步，所述冷冻液不含有任何糖类。
3.根据权利要求I所述的冷冻液，其中，所述培养液为选自TCM-199、PBSS、以及HTF中的ー种或多种，并且所述培养液的含量为30% -60% (v/v);具体地，为40% -50% (v/v)。
4.根据权利要求I所述的冷冻液，其中，所述血清为牛血清和/或马血清，并且所述血清的含量为5% -50% (v/v);具体地，为15% -25% (v/v);更具体地，为20% (v/v)。
5.根据权利要求I所述的冷冻液，其中，所述冷冻保护剂为选自丙ニ醇、こニ醇、甘油、DMSO中的ー种或多种，并且所述冷冻保护剂的含量为20%-50% (v/v);具体地，为30% -40% (v/v)。
6.根据权利要求I所述的冷冻液，其组分及含量如下面的(1)-(2)组中的任ー组所示 (1) Hepes 缓冲液配制的 TCM-199 40% -50% (v/v) 牛血清15% -25% (v/v) こニ醇15% -20% (v/v) DMSO15% -20% (v/v)； (2) H印es缓冲液配制的TCM-199 44% (v/v) 牛血清20% (v/v) こニ醇18% (v/v) DMSO18% (v/v) o
7.一种用于胚胎或细胞冷冻的试剂盒，其包含权利要求1-6中任一项所述的冷冻液；可选地，所述试剂盒还包含如下的预冻液 Hepe s 缓冲液配制的 TCM-199 65% (v/v) 牛血清20% (v/v) こニ醇7.5% (v/v) DMSO7. 5% (v/v) o
8.—种冷冻胚胎或者细胞的方法，包括使用权利要求1-6中任一项所述的冷冻液或者权利要求7所述的试剂盒的步骤；具体地，包括下述步骤 1)将胚胎或细胞在37°C_40°C或者39°C预热的预冻液里平衡5_10分钟； 2)将胚胎或细胞转移至37°C-40°C或者39°C预热的冷冻液，在平衡20-30秒后，转移至玻璃化冷冻载体上，并且迅速将载体沉入液氮中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤2)中从胚胎或细胞放入冷冻液至放入液氮的时间控制在30-60秒之间；具体地，在43-48秒之间；具体地，步骤2)中所述载体为Cryotop 或 0PS。
10.权利要求1-6中任一项所述的冷冻液在胚胎或细胞冷冻中的用途；具体地，所述胚胎为哺乳动物的胚胎，更具体地为哺乳动物的囊胚，进一歩具体地为猪囊胚、牛囊胚、羊囊胚、或鼠囊胚；具体地，所述细胞为哺乳动物的生殖细胞或干细胞；更具体地，所述生殖细胞为哺乳动物的卵母细胞，进ー步具体地，为猪卵母细胞、牛卵母细胞、羊卵母细胞、或鼠卵母细胞；更具体地，所述干细胞为胚胎干细胞，进一歩具体地，为人胚胎干细胞、猪胚胎干细胞、牛胚胎干细胞、羊胚胎干细胞、或鼠胚胎干细胞
全文摘要
本发明属于胚胎学或细胞生物学领域，涉及一种用于胚胎或细胞的冷冻液及其用途。具体地，所述用于胚胎或细胞的冷冻液，包含培养液、血清、以及冷冻保护剂，所述冷冻液不含有蔗糖。本发明还涉及一种用于胚胎或细胞冷冻的试剂盒、以及一种冷冻胚胎或细胞的方法。本发明的冷冻液能够有效提高胚胎或者细胞的冷冻存活率。
文档编号A01N1/02GK102648708SQ201110045660
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者刘田宾, 杜玉涛, 林琳 申请人:深圳华大基因科技有限公司, 深圳华大方舟生物技术有限公司