专利名称：一种双关键酶基因共转化提高喜树碱含量的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种双关键酶基因共转化代谢工程策略提高喜树毛状根喜树碱含量的方法。
背景技术：
喜树碱(Camptothecin，CPT)是最早从中国特有的喜树(Camptotheca acuminata)中提取出来的一种具有显著抗肿瘤活性的生物碱。现有多种喜树碱类药物如依立替康(Irinotecan)和拓扑替康(Topotecan)获得美国FDA(1992)认证，在临床上被广泛用于治疗卵巢癌、直肠癌及白血病等多种恶性肿瘤，全球市场需求十分巨大。目前世界上喜树碱类药物的生产主要是从喜树等植株中提取，然而由于喜树天然资源数量有限，生长十分缓慢，喜树碱及其类似物在植物体内含量又非常低，且提取环节多、费时费力，所以从天然喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需求。多年来，国内外学者围绕着扩大喜树碱药源问题进行了诸多领域的研究如化学全合成，半合成及细胞培养等，并取得了一定的进展。喜树碱的化学全合成虽然已经成功，但因成本太高、产量太低、周期太长且易造成环境污染等因素而限制了其商业化生产；半合成方法虽然是目前最有效的途径之一，但其前体的提取分离仍然依赖于天然资源的供应；细胞悬浮培养则存在喜树碱含量低微及稳定性较差等问题同样难以实现工业化生产(Hengel et al 1992)。相比之下，利用基因工程技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因导入产喜树碱的资源植物中，继而获得转基因的发根系或再生植株等，并进行大规模的培养是实现从根本上提高喜树碱含量的最佳途径之一(Lorence and Nessler 2004，Lu et al 2008)。深入研究喜树碱生物合成的代谢途径及其分子调控是利用基因工程技术提高喜树碱产量的前提和基础。喜树碱的生物合成来自于萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids, TIAs) (Lorence and Nessler2004)。由莽草酸途径来的色胺(Tryptamine)与由5-磷酸脱氧木酮糖(DXP)途径(或甲羟戊酸MVA途径)经多步反应生成的裂环马钱子苷(Secologanin)，在异胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase, STR)催化下形成吲哚生物碱的共同前体异胡豆苷(Strictosidine，也称次番木鳖苷)，再经过几步酶促反应后最终生成喜树碱和10-羟基喜树碱。大量研究表明，异胡豆苷合成酶(STR)，色氨酸脱羧酶 (Tryptophan decarboxylase，TDC)，香叶醇-10-脱氢酶即栊牛儿醇-10-羟化酶(Geraniol 10-hydroxylase, GlOH)及 1_ 脱氧木酮糖 _5_ 磷酸合成酶(DXS，I-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Synthase)等关键酶在包括喜树碱在内的TIAs的生物合成中具有重要作用 (Canel et al 1998 ；De Luca et al 1989 ；Lopez-Meyer 1997 ；Yamazaki et al 2003 ； McKnight et al 1990 ；Kutchan 1989 ；Yamazaki et al 2003 ；Lu et al 2008)。采用基因工程手段，将上述的两个关键酶基因STR和GlOH共转化喜树，将有可能打破喜树碱生物合成途径的瓶颈效应，获得喜树碱高产的喜树毛状根或植株，为商业化生产喜树碱和羟基喜树碱提供新型优质药源。
发明内容
本发明的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高喜树毛状根喜树碱含量的方法。本发明还提供了实现上述方法的重组载体。本发明利用已克隆的长春花CrSTR和CrGlOH基因，构建含所述DNA分子的植物双价表达载体，以发根农杆菌(如C58C1等)为介导，将异胡豆苷合成酶CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶CrGlOH基因同时导入喜树(如下胚轴组织)中并再生出毛状根；PCR和荧光定量PCR检测目的基因CrSTR和CrGlOH的整合和表达情况，高效液相色谱测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量。本发明是通过以下技术方案实现的，一种用于提高喜树碱含量的重组载体，含有异胡豆苷合成酶基因和香叶醇-10-脱氢酶基因。一种双关键酶基因共转化提高喜树碱含量的方法，包括如下步骤(1)将异胡豆苷合成酶基因(CrSTR 基因，SEQ ID NO. 1，GenBank :Χ53602· 1)和香叶醇-10-脱氢酶基因(CrGlOH基因，SEQ ID NO. 2，GenBank :AJ251269. 1)插入植物表达载体，构建重组载体；根据从NCBI获得的CrSTR和CrGlOH基因的cDNA序列设计引物，以长春花幼苗 RNA为模板PCR获得CrSTR和CrGlOH基因片段；植物表达载体可选用pCAMBIA质粒或pBI质粒，尤其是pCAMBIA1304质粒；(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；发根农杆菌可选用发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株 L BA9402 ；(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化喜树，优选为喜树下胚轴，获得毛状根；(4)检测步骤(3)毛状根中的异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶基因CrGlOH，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；检测方法为PCR 及 Southern blotting 检测。PCR阳性的转基因毛状根克隆进行Southern blot检测，证明目的基因CrSTR和 CrGlOH已整合到喜树毛状根基因组中。荧光定量PCR测定喜树转基因毛状根中CrSTR和CrGlOH基因的相对表达量；并用高效液相色谱法测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量，进一步筛选喜树碱和羟基喜树碱含量显著提高的喜树转基因毛状根株系。所述的PCR检测中，分别在植物表达载体上启动插入基因(CrSTR，CrGlOH)表达的组成型表达启动子CaMV35S的内部及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物进行DNA 的PCR扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因毛状根株系。所述的荧光定量PCR检测CrSTR和CrGlOH基因的表达情况，具体方法为对经PCR 鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取并反转成cDNA第一条链，分别设计插入目的基因及看家基因ISSrRNA的引物，进行荧光定量PCR扩增，用相对定量法分析CrSTR和CrGlOH基因的相对表达量。本发明的双关键酶基因共转化策略提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，采用基因工程方法，将双关键酶基因(CrSTR，CrGlOH)导入喜树下胚轴中，获得了高产喜树碱的喜树毛状根株系。共转CrSTR及CrGlOH基因的毛状根中所检测的喜树碱和羟基喜树碱含量相比于对照组显著提高，平均含量为4. 95mg/g和0. 46mg/g，是对照组毛状根(1. 03mg/g和 0. 21mg/g Dff)的 4. 8 倍和 2. 2 倍。本发明应用一些常规生物学实验方法如载体构建、遗传转化、分子检测、荧光定量 PCR分析、喜树碱提取及含量测定等，建立了一种有效提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，为喜树毛状根商业化生产奠定基础，也为生产具重要临床需求的喜树碱和羟基喜树碱提供了一种新型优质药源。但目前尚未发现与本发明主题所提及的双关键酶基因共转化策略提高喜树毛状根喜树碱含量的相关报道。因此，本发明在实际解决喜树碱药源紧缺性的问题上具有十分重要的意义。
图1为实施例3转基因毛状根中目的基因glOh㈧和str⑶基因的PCR检测图， 其中，M :DL2000分子大小标记；PC 质粒(阳性对照)；NC 空载体转化得毛状根(阴性对照)。阿拉伯数字代表不同的转基因毛状根无性系。图2为荧光定量PCR检测转基因喜树毛状根中CrSTR和CrGlOH基因的表达
具体实施例方式下面结合具体实施例详细阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆(Sambrook等)，或按照制造厂商所提供的试剂或试剂盒所附带的说明书建议的条件。实施例1长春花CrSTR及CrGlOH基因编码序列的获得1.1.长春花总RNA的提取及cDNA第一链的合成使用TIANGEN公司提供的RNA prep pure plant kit从长春花幼苗中提取总 RNA(提取步骤参照试剂盒内的说明书)。用于提取总RNA的长春花幼苗的鲜重量为0. Ig 左右，在提取过程中样品中的DNA已用DNase工作液清除。将提取的RNA在分光光度计上测定相关的吸光值，计算所提取RNA的纯度及浓度。根据不同RNA样品的浓度通过计算后， 分别以0.5yg RNA为起始量，用反转录酶XL(AMV)进行第一链cDNA的合成(操作步骤参照Promega公司提供的相关说明书)。1. 2. CrSTR和CrGlOH编码序列特异引物的设计及目的基因片段的获得根据从NCBI获得的所述CrSTR基因的编码序列(SEQ ID NO. 1)和CrGlOH基因的编码序列(SEQ ID NO. 2)，分别设计扩增出完整编码框的上下游特异引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建植物表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank上登录的长春花CrSTR基因(SEQ IDNO. 1)和CrGlOH基因(SEQ ID NO. 2)的编码序列完全一致。引物序列为str-F 5' -GCGGATCCATGGCAAACTTTTCTGAATCTAAATCCAT-3’GGATCC 为 BamHI 酶切位点str-R 5' TCGAGCTCCT AGCTAGAAAC ATAAGAATTTCCCTTGT-3，GAGCTC 为 SacI 酶切位点glOh-F 5' -GGAGATCTATGGATTACCTTACCATAATATTAAC-3’AGATCT 为 BglII 酶切位点glOh-R 5' TCGGTGACCTTAAAGGGTGCTTGGTACAG-3‘GGTGACC 为 BstEII 酶切位点实施例2含长春花CrSTR及CrGlOH基因的植物表达载体的构建2.1.中间载体 pCAMBIA1304+的构建以pBI121和pCAMBIA1304为材料，构建植物表达载体pCAMBIA1304+。具体地， Hindlll/EcoRI 双酶切 pBI121 和 pCAMBIA1304 ；回收 pBI121_GUS 表达盒及 pCAMBIA1304 大片段；连接转化，挑取单克隆菌落抽提质粒酶切验证。结果表明，植物表达载体 pCAMBIA1304+ 构建成功。2. 2.植物表达载体 pCAMBIA1304+-CrG10H 的构建在上述构建成功的PCAMBIA1304+基础上，用从长春花中克隆到的CrGlOH基因替换其上的GUS基因。具体地，BamHI/SacI双酶切pMD18T_CrG10H和pCAMBIA1304+ ；回收 CrGlOH基因和pCAMBIA1304+大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，CrGlOH基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304+ 中，从而获得含CrGlOH基因的植物表达载体pCAMBIA1304+-CrG10H。2. 3.植物表达载体 pCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H 的构建以上述的pCAMB I Al 304+-CrG 1OH为基础，用从长春花中克隆的Cr STR基因替换 pCAMBIA1304+-CrG10H 上的 GFP+GUS 基因。具体地，Bglll/BstEII 双酶切 pMD18T_CrSTR 和 pCAMBIA1304+-CrG10H ；回收 CrSTR 基因及 pCAMBIA1304+_CrG10H 大片段；连接转化，挑取单克隆菌落PCR筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，CrSTR基因已被成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304+-CrG10H中，从而获得含CrSTR和CrGlOH的植物表达载体 pCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H。本实施例将萜类吲哚生物碱合成途径关键酶基因CrSTR和CrGlOH可操作性地连于表达调控序列，形成含CrSTR和CrGlOH基因的植物表达载体 PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高喜树中喜树碱含量。实施例3发根农杆菌介导CrSTR和CrGlOH基因遗传转化喜树获得转基因毛状根3. 1.含植物表达载体PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H发根农杆菌工程菌的获得将实施例2中含CrSTR和CrGlOH基因的植物双价表达载体 PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H转入发根农杆菌C58C1中，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含CrSTR和CrGlOH基因的植物表达载体已成功构建到发根农杆菌菌株C58C1中。3. 2.发根农杆菌介导CrSTR和CrGlOH基因遗传转化喜树3. 2. 1.外植体的预培养
剪取喜树无菌下胚轴(l-3cm)，接种到预培养培养基(B5)上，25°C暗培养2d。3. 2. 2.农杆菌与外植体的共培养将上述经预培养的喜树下胚轴外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的 1/2MS悬液中浸泡10分钟(轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触)后，取出浸染后的喜树下胚轴用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基4中，暗培养2d。3. 2. 3.毛状根的诱导和继代培养将上述的共培养2d的喜树外植体转接到除菌固体培养基(B5+Cef500mg/L)中， 250C 16h/ !光照培养2-3周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。剪下(大约l-3cm)的毛状根，接种于B5+Cef500mg/L培养基中暗培养3周。转入B5+Cef 250mg/L培养基中继代筛选，每2周继代培养一次。经过数次继代后即可完全脱菌。再将良好的喜树毛状根转入无抗生素的B5培养基上继续暗培养20d左右。3. 3.转基因喜树毛状根的PCR检测3. 3. 1.转基因毛状根基因组DNA的提取本发明采用CTAB法提取转基因毛状根基因组DNA。剪取3. 2. 3中除菌完毕的转基因毛状根5cm左右放入1. 5ml离心管中，加入适量的石英砂及600 μ 1 CTAB裂解液(65°C预热，含β巯基乙醇)，用研磨棒将材料充分磨碎。置于65°C水浴锅中40-50分钟，其间多次混勻样品(次/lOmin)，冷却至室温后加入等入体积的苯酚，轻轻颠倒混勻乳化lOmin， 12000rpm离心20min，小心吸取上清于新EP管中，加入等体积苯酚/氯仿(1 1)，轻轻混勻，12000rpm离心20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加等体积的氯仿混勻，12000rpm离心 20min，缓慢吸取上清于新EP管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，析出沉淀。用枪头将沉淀挑到新EP管中，加入75%乙醇4°C洗涤过夜。次日用75%乙醇再洗涤两次，吸出上清，室温晾干，加入30-50 μ 1水溶解沉淀，用RNA酶处理后于_80°C超低温冰箱冻存，备用。3.3.2.引物设计及PCR检测在PCAMBIA1304+-CrSTR-CrG10H上启动插入目的基因表达的组成型表达启动子 CaMV35S及插入基因上分别设计特异性上游及下游引物，用PCR方法对上述毛状根的总DNA 进行分子检测，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因喜树毛状根株系。引物序列为
权利要求
1.一种双关键酶基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将异胡豆苷合成酶基因和香叶醇-10-脱氢酶基因插入植物表达载体，构建重组载体；(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化喜树，获得毛状根；(4)检测步骤(3)毛状根中的异胡豆苷合成酶基因和香叶醇-10-脱氢酶基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆。
2.权利要求1所述一种双关键酶基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中的异胡豆苷合成酶基因和香叶醇-10-脱氢酶基因片段以长春花幼苗RNA为模板 PCR获得。
3.权利要求1所述一种双关键酶基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(1)中的植物表达载体为pCAMBIA质粒或pBI质粒。
4.权利要求1所述一种双关键酶基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(2)所述的发根农杆菌为发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株 L BA9402。
5.权利要求1所述一种双关键酶基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(3)中用含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化喜树下胚轴，获得毛状根。
6.权利要求1所述一种双关键酶基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，步骤(4)所述的检测方法为PCR及Southern blotting检测。
7.一种用于提高喜树碱含量的重组载体，其特征在于，含有异胡豆苷合成酶基因和香叶醇-10-脱氢酶基因。
全文摘要
本发明是一种生物技术领域的提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，从长春花中克隆出异胡豆苷合成酶基因CrSTR和香叶醇-10-脱氢酶CrG10H的编码框序列，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌介导法遗传转化喜树获得转基因的喜树毛状根。本发明获得的转基因喜树毛状根中喜树碱含量显著提高，喜树碱含量为对照的4.8倍，羟基喜树碱含量为对照的2.2倍。单独转CrSTR基因的毛状根喜树碱含量比对照提高了2.4倍，单独转CrG10H基因的毛状根喜树碱含量并无明显提高。本发明提供了一种提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，也为生产具重要临床需求的抗癌药物喜树碱和羟基喜树碱提供了一种新方法。
文档编号A01H5/06GK102212549SQ20111008405
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者周聪聪, 季倩, 开国银, 李姗姗, 王伟 申请人:上海师范大学