专利名称：草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因、编码的重组蛋白及其时空表达图谱的构建方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生命科学技术领域，尤其涉及草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (grass carp Tissue inhibitor of metalloproteinases-2，gcTIMP-2)基因、编码的重组蛋白及其时空表达的构建方法，本发明还涉及草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (grass carp Tissue inhibitor ofmetalloproteinases-2, gcTIMP-2)基因的用途。
背景技术：
草鱼是一种草食性鱼类，饲养成本低，养殖地域广，是我国淡水养殖的主要品种， 其产量约占淡水养殖总产量的20%。但草鱼病害多，而其中以草鱼出血病最甚，给养殖业带来巨大的损失。目前水生动物暴发性出血病病因现已基本查明，其代表菌株为嗜水气单胞菌。因此对于嗜水气单胞菌所产生毒素的抑制成为一个主要的研究方向。基质金属蛋白酶抑制因子-2(Tissue inhibitor ofmetalloproteinases-2, TIMP-2)是基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase 2，mmp-2)的天然抑制物，是一组能抑制基质金属蛋白酶-2的多功能因子。而基质金属蛋白酶-2作为一种作用范围最广的基质金属蛋白酶近来受到越来越多的关注，同时其也是嗜水气单胞菌最重要的致病因子之一。TIMP-2的主要功能是对基质金属蛋白酶的抑制作用，调节细胞外基质的代谢；同时还在细胞生长、繁殖及刺激血管生成等生理和病理学方面发挥一定的作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种可作为基因工程疫苗的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP-2)基因。本发明另一目的在于提供上述草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因编码的重组蛋白。本发明的另一目的在于提供上述草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因时空表达图谱的构建方法。本发明的另一目的在于上述草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因及其编码的重组蛋白的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现本发明依据已有的草鱼头肾cDNA文库中所挑选的TIMP-2EST序列为基础，采用 RACE法克隆得到该草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因的编码区序列及5’端非编码区序列。本发明通过对以上草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP-2)基因进行序列测定，得到草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP-2)基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO=I 所示，并通过基因工程方法表达出重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
本发明的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因一种典型的基质金属蛋白酶抑制剂，由218个氨基酸组成，含有12个高度保守的半胱氨酸残基，形成6个二硫键的环状结构，每3个环状结构形成1个结构域，N末端3个环状结构较大，可与mmps的活性中心结合，抑制mmps活性；C末端3个环状结构较小与抑制mmps无关，但参与timps的其他功能。本发明的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因的时空表达图谱的构建方法是根据获得的cDNA序列设计RT-PCR引物，检测gcTIMP-2基因在草鱼组织和发育过程中的表达情况，考察了其在草鱼血液、中肾、头肾、脾脏、鳃、肠、心脏、脑、肌肉、肝脏、表皮、鳍条的mRNA水平，考察了其在受精卵、0phf、16cell、桑椹期、原肠期、眼基期、尾鳍出现期、肌肉效应期、心跳期及受精后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天和15天的表达图谱。本发明的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因可用于草鱼的人工育
田ο本发明的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因可用于制备草鱼的饲料添加剂。本发明的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因编码的重组蛋白可用
于草鱼的人工育苗。本发明的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因编码的重组蛋白可用于制备草鱼的饲料添加剂。本发明的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因在血液、中肾、头肾、 脾、鳃、肠、心中大量转录，在脑、肌、肝、皮中有微量转录，在鳍条中检测到极其微量mRNA的存在。该基因从尾鳍期开始大量转录，在鱼苗3天达到最大表达量。根据本发明的gcTIMP-2的基因序列和氨基酸序列，以及其它已知物种的TIMP-2 相应序列，采用生物信息学方法可得出TIMP-2在不同物种之间的进化关系和保守程度。本发明对研究TIMP-2的生理功能，TIMP-2与肿瘤侵袭转移，胚胎发育和伤口愈合的关系及其对于嗜水气单胞菌毒力的抑制提供了实验基础，τ并为该基因在草鱼的人工育苗中的作用和在饲料添加剂中的应用提供实验基础。
图1为Signal P程序分析显示出的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子_2 (gcTIMP-2) 基因的信号肽位置示意图。图1表明通过Signal P程序对其蛋白存在信号肽的可能性进行了分析，发现其N-端的M个氨基酸肽段极有可能为信号肽，其信号肽酶的可能切割位点位于第M位和25位氨基酸之间，提示该蛋白为分泌型蛋白。图2为RT-PCR检测草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2 (gcTIMP-2)基因在草鱼组织中的表达图谱示意图。图2表明该基因在血液、中肾、头肾、脾、鳃、肠、心中大量转录，在脑、 肌、肝、皮中有微量转录，在鳍条中检测到极其微量mRNA的存在。图3为RT-PCR检测草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP_2)基因在草鱼胚胎发育过程中的表达图谱示意图。图3表明该基因从尾鳍期开始大量转录，在鱼苗3天达到最大表达量。
具体实施例方式本发明以下具体实施方式
仅限于对本发明的说明，并构成对本发明保护范围的限制。1、序列比对根据Ironl995年的报道，只要两个序列间用BLAST软件比对后Ε-Value值小于 0.005，两个序列之间具有绝对的同源性，即证明序列为同一种基因序列。依据本实验室已有的草鱼头肾cDNA文库所标记的EST序列，在NCBI进行BLAST检索。得到草鱼TIMP-2基因的部分编码区和3’端核苷酸序列。根据该序列设计基因特异性引物。2、草鱼 TIMP-25，端克隆草鱼总RNA提取采用TaKaRa公司的组织RNA提取试剂提取草鱼总RNA，经琼脂糖凝胶电泳证明所提取总RNA没有降解，没有DNA污染，可满足后续实验要求。按Clontech公司SMART RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行，包括下列步骤(1)第一链 cDNA 合成1. 0 μ 1 草鱼总 RNA (1 μ g)1. 0μ 1 5，-CDS 引物 A(5，-(T)25VN-3，N = A, C，G，or T ;V = A, Gor C)1. 75μ 1 去离子水将上述试剂在0. 2ml离心管内混勻，72°C 2分钟，42°C 2分钟，然后再加入下列试
剂
1. μ 1 SMART 寡核苷酸(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX-3')
2.0μ15X第一链缓冲液
1. Ομ 1DTT (20 mM)
Ι.Ομ 1dNTP Mix (IOmM)
0.25 ulRNA 酶抑制齐IJ (40U/u 1)
Ι.ΟμΙSMARTScribe 逆转录酶(100U)
10μ1总体积混勻上述试剂，置42°C 90分钟，降温至70°C 10分钟。加入0. 5M的乙二胺四乙酸二钠缓冲液至200 μ 1。(2) gcTIMP-25，端 PCR 扩增模板用上述合成cDNA，正向引物为5，PCR通用引物 5，-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，，反向引物为 5，特异性引物 5，-GCTAATGGAACAGGGAATGACG GAAC-3’。反应体系液如下
权利要求
1.一种草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO :1所示。
2.权利要求1所述草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因编码的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.权利要求2所述的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因的时空表达图谱的构建方法，其特征在于，是根据获得的cDNA序列设计RT-PCR引物，检测gcTIMP-2基因在草鱼组织和发育过程中的表达情况，考察了其在草鱼血液、中肾、头肾、脾脏、鳃、肠、心脏、脑、肌肉、 肝脏、表皮、鳍条的mRNA水平，考察了其在受精卵、0phf、16cell、桑椹期、原肠期、眼基期、 尾鳍出现期、肌肉效应期、心跳期及受精后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天和15 天的表达图谱。
4.权利要求1所述的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子_2(gcTIMP-2)基因在草鱼的人工育苗中的应用。
5.权利要求1所述的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子_2(gcTIMP-2)基因在制备草鱼的饲料添加剂中的应用。
6.权利要求2所述草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP-2)基因编码的重组蛋白在草鱼的人工育苗中的应用。
7.权利要求2所述草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2(gcTIMP-2)基因编码的重组蛋白在制备草鱼的饲料添加剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因、编码的重组蛋白及其时空表达图谱的构建方法和用途。本发明草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。该核苷酸序列编码的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。将本发明的草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因在草鱼组织和发育过程中的表达，该基因在血液、中肾、头肾、脾、鳃、肠、心中大量转录，在脑、肌、肝、皮中有微量转录，在鳍条中检测到及其微量mRNA的存在。该基因从尾鳍期开始大量转录，在鱼苗3天达到最大表达量。本发明还公开了草鱼基质金属蛋白酶抑制因子-2基因、编码的重组蛋白在草鱼育苗和作为草鱼饲料添加剂中的应用。
文档编号A23K1/16GK102268438SQ20111012783
公开日2011年12月7日 申请日期2011年5月17日 优先权日2011年5月17日
发明者宣云峰, 徐晓雁, 李家乐, 沈玉帮, 王荣泉 申请人:上海海洋大学