专利名称：以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养方法。
背景技术：
滇杨iPopulus yunnanensis)是杨柳科杨属青杨派树种，尚有的少量滇杨原始野生植株仅存于部分海拔较高的山区，现存滇杨林分主要以人工林为主，且基本由雄株组成， 雌株极为少见。滇杨作为林木遗传育种中的模式植物，其组织培养包括基本培养基及外源激素选择，外植体选择、消毒、分化、增殖与生根培养及炼苗移栽等步骤。杨树外植体的选择上，与茎尖分生组织接连的腋芽、叶片、茎尖具有较强的形态发生能力，通常从优树上选取相应组织部分复幼后再取外植体。金顺玉等在“黑林1号杨(小黑杨X波兰15A)的组织培养与植株再生”(植物生理学通讯[J]，2003, 39(6) :639)中，利用叶片作为外植体，用75% 乙醇消毒Imin附加Naao消毒^iin获得了无菌苗。“3个杨树品种叶片再生体系的建立” (沈周高，等.[J].中国农学通报，2006，22 (11):90-92.)，对3种黑杨杂种叶片不同时长的消毒处理结果中，0. l%HgCl2溶液消毒^iin处理，叶片污染率为20%，出愈率为76%。经过诱导，外植体重新开始细胞分裂与器官分化，形成完整植株。不同杨树的生长环境与生物学习性不同，导致适合其诱导、增殖及生根培养的培养基不同。例如，京2杨生长需要较高的营养，MS培养基更适于腋芽的启动和生长。(张蕾， 苏晓华等.京2杨组培条件的优化及再生体系建立[J].林业科学研究，2007，20 (6) 787-793)。欧美杨“山地一号”丛生芽的增殖以MH为基础培养基，用0.3-0. 8mg/L浓度 6-BA与0. 05mg/L浓度的NAA混配(杨传平等，“欧美杨‘山地1号’组织培养再生系统的建立”[J].分子植物育种，2006，4 ): 579-582.)。杨树的生根培养大都采用1/2MS为基础培养基，附加一定量的NAA、IAA、IBA。史绍林等诱导新西伯利亚银白杨的根，采用1/2MS+0. 1 mg/LNAA +0.02 mg/LIBA作为根诱导培养基配方，生根率达90%，根数多，生长健壮。(“新西伯利亚银白杨组织培养基配方的筛选与应用” [J].防护林科技，2008，(6):25-26.)在杨树组培苗炼苗移栽过程中，韩玉琴等在“山新杨微繁工厂化配套生产技术”中选择黑土和草炭土附加少量草木灰、细沙、马粪为移栽基质(黑龙江农业科学[J]，2005，(2) :59-60.)。康冰等在欧美速生杨炼苗移栽中，选用干净河沙为基质，保持温度^°C，相对湿度为85%，30d 后成活率达到90%以上(“速生欧美黑杨愈伤组织诱导及植株再生” [J].植物生理学通讯， 2004，40(5): 582·)。
此外，光照作为杨树组织培养过程中重要的影响因子，不同强度和波长的光照将直接影响再生体系的建立。与滇杨组织培养相关的文献中，有张春霞等以初春时采摘二年生滇杨枝条在室温下水培长出新叶，取水培新叶的叶柄消毒得到的无菌材料作为外植体，利用1/2MS 基本培养基附加苯基噻二唑基脲(TDZ)、NAA等组成的三种培养基对叶柄诱导分化、增殖以及生根等进行离体再生的研究(“滇杨的组织培养和植株再生”，植物生理学通讯 [J]，2006，42(6) 1131)。但该方法作为实验室研究，而在工业化条件下叶柄取材量大，基础
3培养基和外源激素要求较高，尤其是对叶柄进行的离体组织培养实验较为单一，未对不同生长因子或激素的可能组合的培养基进行对比。
发明内容
本发明目的是用滇杨离体嫩茎作为外植体进行组织培养，建立以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，为滇杨离体的工厂化快速繁殖和育苗、以及滇杨生理遗传性质研究提供方法。本发明目的通过下述方法实现
以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，包括以下步骤
(1)取生长健壮、无病虫害的3年生滇杨枝条，摘除枝条上叶片，置于室温下水培一个月，待其长出嫩茎后剪下作为外植体；
(2)将步骤(1)嫩茎置入烧杯中，加入m次氯酸钠，振荡6min，无菌水冲洗3遍，再加 70%酒精消毒40s，之后加0. l%HgCl2消毒7 min，最后用无菌水冲洗5遍；
(3)用MS+6BA0.5mg/L+NAA0. 05mg/L作为滇杨嫩茎不定芽诱导的分化培养基，将步骤 (2)消毒后的无菌嫩茎平放入该培养基，20 25天生长出愈伤组织，约30天在愈伤上长出丛生不定芽；
(4)用MS+6BA0.lmg/L+NAAO. 02mg/L作为滇杨增殖培养基，将步骤(3)诱导后产生的不定芽接入该培养基，25天左右培养一代；
(5)用lAMS+NAAO.02mg/L作为滇杨生根培养基，将步骤(4)增殖培养后的壮苗插入该培养基，培养生根苗，15天左右生根；
(6)将步骤(5)的生根瓶苗在组织培养室培养25天，转到普通实验室内闭瓶培养3天、 开瓶培养2天进行炼苗前预处理，然后移栽到基质中炼苗；
以上步骤(2) (5)消毒接种工作均在超净工作台中操作，试管苗的培养均在组织培养室内进行，其培养条件为温度25士2°C、光照1500-2000LX、光照时间12h/d、湿度70% 80%。所述方法的步骤(6)移栽炼苗基质的配方为河沙腐质土 珍珠岩=1:1:1。所述方法的步骤(6)炼苗基质以0. 3 %的高锰酸钾溶液淋溶消毒，盖上小棚膜，7 天后移栽炼苗。与现有技术相比，本发明具有的突出的进步和积极效果是
1、本发明采集滇杨3年生枝条摘除老叶，水培复幼，取材方便快捷，且不受季节的限
制；
2、以滇杨新生嫩茎为外植体，通过12种不同细胞分裂素和生长素配比的增殖培养基进行培养，生成愈伤组织后在愈伤上分化出丛生芽，筛选出嫩茎芽分化率较高的6BA和NAA 培养基，其诱导发芽率高，更适合滇杨离体快繁及获取同一规格的组培苗；
3、本发明选用4种不同激素配比的生根培养基进行培养，通过主根和须均多且健壮的生根组培苗，获得了适合滇杨离体快繁生根的培养基，为后期移栽炼苗的高成活率提供保障；
并且，6-BA及NAA试剂均较为廉价；
4、本发明选用7种不同基质配比的移栽炼苗基质进行生根组培苗移栽炼苗，并进行死亡率、30天成活率、苗高及苗的地径生长情况分析，筛选出适合滇杨生根组培苗移栽炼苗的培养基质配方，首次筛选了滇杨组培苗的炼苗基质。因此，本发明建立的滇杨离体培养再生体系，对滇杨离体快速繁殖和遗传改良有重要的意义。
图1是不同炼苗预处理对组培苗成活率的影响图。图2是不同基质中移栽死亡情况随时间的变化3是不同基质对组培苗高生长的影响图。图4是不同基质对组培苗地径的影响图。
具体实施例方式(一)外植体的消毒
取西南林业大学校园生长健壮、无病虫害的三年生滇杨枝条，将枝条上的叶片全部摘除后，置于室温下水培一个月，待其长出嫩茎后剪下作为外植体材料。将嫩茎在烧杯中用自来水冲洗池后，放入三角瓶中，加入洲的次氯酸钠，振荡Smin后，取出嫩茎材料，用无菌水冲洗叶柄3遍；再用70%乙醇消毒嫩茎40sec，之后分别放入4个无菌瓶中，I :+ 的次氯酸钠 IOmin ； II :+10%H202IOmin ；III :+0. l%HgCl27min ；IV :+0. l%HgCl27min+2% 的次氯酸钠 8min。用无菌水冲洗叶柄6遍。选用MS为基础培养基接种。MS配方如表1
表1 MS培养基成分配方表
成分蔽里(mg/t )成分数簠(mg/L)ι t n —- ^fc 大里兀索微素HHJMQI1650MnSOi ■ 4Hs022. 3勵1900ZnSOi ■ mo8.6IHaPQi17。腳，6.2HgSO, ■ TByD370KI0.83CaCli ■ 2HD440Na ■ IoO, ■ 2tW0. 25有机物CuSOa ■ SHsO0.025肌握100CoCia ■ eao0.025烟酸0. B维生素B10.1甘觀2.0FeSOi ■ THsO37. 3维生素&0.1Ia ■ EDTA ■ 2ftO27.8
十五天后统计污染率、死亡率，并进行数据分析。设计和效果见表2
表2不同消毒剂对滇杨嫩茎的消毒效果
权利要求
1.以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，包括以下步骤(1)取生长健壮、无病虫害的3年生滇杨枝条，摘除枝条上叶片，置于室温下水培一个月，待其长出嫩茎后剪下作为外植体；(2)将步骤(1)嫩茎置入烧杯中，加入m次氯酸钠，振荡6min，无菌水冲洗3遍，再加 70%酒精消毒40s，之后加0. l%HgCl2消毒7 min，最后用无菌水冲洗5遍；(3)用MS+6BA0.5mg/L+NAA0. 05mg/L作为滇杨嫩茎不定芽诱导的分化培养基，将步骤 (2)消毒后的无菌嫩茎平放入该培养基，20 25天生长出愈伤组织，约30天在愈伤上长出丛生不定芽；(4)用MS+6BA0.lmg/L+NAAO. 02mg/L作为滇杨增殖培养基，将步骤(3)诱导后产生的不定芽接入该培养基，25天左右培养一代；(5)用lAMS+NAAO.02mg/L作为滇杨生根培养基，将步骤(4)增殖培养后的壮苗插入该培养基，培养生根苗，15天左右生根；(6)将步骤(5)的生根瓶苗在组织培养室培养25天，转到普通实验室内闭瓶培养3天、 开瓶培养2天进行炼苗前预处理，然后移栽到基质中炼苗；以上步骤(2) (5)消毒接种工作均在超净工作台中操作，试管苗的培养均在组织培养室内进行，其培养条件为温度25士2°C、光照1500-2000LX、光照时间12h/d、湿度70% 80%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(6)用于炼苗的基质的配方为河沙腐质土 珍珠岩=1:1:1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是步骤(6)用于炼苗的基质以0.3%的高锰酸钾溶液淋溶消毒，盖上小棚膜，7天后移栽炼苗。
全文摘要
以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，属于植物组织培养方法。本发明采集滇杨3年生枝条水培后以嫩茎为外植体，无菌嫩茎平放入分化培养基，在愈伤上长出丛生不定芽，再分别接入增殖、生根培养基，移栽炼苗基质等。本发明取材方便快捷，各阶段的培养基和炼苗基质都分别进行筛选比较，为滇杨工厂化快速繁殖、育苗以及滇杨生理遗传性质研究提供了方法。
文档编号A01G31/00GK102246700SQ20111023683
公开日2011年11月23日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者何承忠, 刘岩, 周军, 李根前, 段安安, 胥辉, 辛培尧 申请人:西南林业大学