专利名称：提高棉花衣分含量的Gbyucca10基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够提高棉花衣分含量的(ibyuccaio基因及其编码的多肽。
背景技术：
棉花衣分是除铃数、铃重之外的棉花产量的一个重要构成因素。衣分含量是指籽棉纤维的重量与籽棉重量的比值，通常用百分率来表示。衣分含量的高低是评定棉花品种优劣的一条重要标准。大量的研究证明提高棉花纤维的衣分含量能够显著提高棉花的产量。通过基因工程方法提高棉花衣分含量，使之更加适应生产的需要是当前棉花纤维遗传改良的重要方向。但是，有关利用基因工程方法提高棉花衣分含量目前未见报道。棉花纤维的发育历经纤维起始、纤维伸长、次生壁增厚及脱水成熟四个阶段形成成熟纤维。研究证明在纤维发育起始阶段，增加胚表皮的IAA(生长素)含量能够提高单位面积中胚表皮细胞的突起数目，从而提高衣分的含量。研究证明植物通常有2条不同的IAA合成途径(1)色氨酸经过色氨酸脱氨酶、色氨酸脱羧酶合成吲哚乙酸的代谢通路。 (2)色氨酸经过通过YUCCa、CYP79B2/3、CYP83B2等合成吲哚乙酸的代谢通路。经过研究发现，在棉花的胚表皮中第二条代谢途径十分重要，对于保持胚表皮细胞中的IAA浓度十分关键。近期的研究进一步也表明，胚特异表达细菌IAA合成相关的酶类(IAAM)有助于提高胚表皮细胞的突起数目(Zhang Mi et al. , Nature Biotechnology，2011 :453-459)。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的能够提高棉花衣分含量的基因，并得到所述基因表达的蛋白产物。本发明首次采用分子克隆方法，从构建的海岛棉cDNA库中分离获得了新的 (ibyuccalO基因，并且通过转基因实验证实了它具有高提高棉花衣分含量的功能，从而达到了发明目的。本发明利用胚特异表达启动子在棉花中特异表达(GbyuccalO基因提高棉花的胚表皮细胞的突起数目，从而提高棉花的衣分含量。本发明包括以下内容1、提供了一种新的分离出的(ibyuccalO蛋白质多肽，包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽；(b)将 SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花衣分含量功能的(GbyuccalO蛋白质活性的由(a)衍生的多肽。2、提供了编码上述多肽的多核苷酸，选自(a)编码上述(ibyuccalO蛋白质多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO 1中M2-1183位的序列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-1406位的序列。
3、提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。4、提供了制备上述(ibyuccalO蛋白质多肽的方法，该方法包含(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。5、提供了上述多核苷酸和(ibyuccalO蛋白质多肽的用途，S卩，在培育提高棉花衣分含量的棉花品种方面的应用。6、提供了一种提高棉花衣分含量的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有SEQ ID NO :1所示序列的多核苷酸，所述的(ibyuccalO选自下组(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花衣分含量的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使(ibyuccalO基因编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入(ibyuccalO基因的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。在本发明中，术语“(ibyuccalO蛋白质”、“(ibyuccalO多肽”、“IAA合成酶”或“提高棉花衣分含量蛋白”可互换使用，都指具有提高棉花衣分蛋白(ibyuccalO氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的(ibyuccalO蛋白质。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的(ibyuccalO蛋白或多肽”是指(ibyuccalO多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化(^byuccalO蛋白质。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括(ibyuccalO蛋白质的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然(ibyuccalO蛋白质相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。 根据本文所述，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“(ibyuccalO多肽”指具有生长素合成酶功能能够提高棉花衣分含量的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与(ibyuccalO蛋白质相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C 末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括(ibyuccalO蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨程度条件下能与(ibyuccalO杂交的DNA、cDNA所编码的蛋白、以及利用抗(ibyuccalO多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含 (ibyuccalO多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 (ibyuccalO 多肽的可溶性片段。通常，该片段具有(ibyuccalO多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供(ibyuccalO蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然(ibyuccalO多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。表 权利要求
1.一种分离的(ibyuccaio蛋白质多肽，包含具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽， 或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.权利要求1所述的多肽，所述保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的，且具有提高棉花衣分含量功能的多肽。
3.权利要求1或2所述的多肽在提高棉花衣分含量方面的功能与应用。
4.一种分离的多核苷酸，包含(a)编码权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)与(a)互补的多核苷酸。
5.权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，其序列选自(a)具有SEQID NO :1中242-1183位的序列；或(b)具有SEQ ID NO :1 中 1-1406 的序列。
6.权利要求4或5所述的多核苷酸在提高棉花衣分含量方面的功能与应用。
7.一种载体，其特征在于含有权利要求4或5所述的多核苷酸。
8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于含有权利要求7所述的载体。
9.权利要求1或2所述多肽的制备方法，包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有(ibyuccalO蛋白质活性的多肽。
10.一种提高棉花衣分含量的方法，包括(a)提供携带权利要求7所述的表达载体的农杆菌；(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所携带的表达载体中的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(c)选择出转入有(ibyuccalO蛋白质的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
全文摘要
本发明提供了一种能够提高棉花衣分含量的Gbyucca10基因及其编码的Gbyucca10蛋白质多肽，以及经重组技术产生这种Gbyucca10蛋白质的方法。本发明还公开了Gbyucca10基因在提高棉花衣分含量方面的功能与应用。
文档编号A01H5/00GK102304497SQ20111025353
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者左开井, 王劲, 陈强, 陈继军 申请人:左开井, 王劲