专利名称：木质纤维素原料堆肥的三段式接种工艺及微生物菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及木质纤维素原料堆肥的三段式接种工艺及微生物菌剂。
背景技术：
尽管国内外学者在堆肥的微生物菌剂领域已做了大量工作，但与微生物接种和堆肥研究相关的问题是值得商榷的。一是堆肥中高温对菌剂的影响。在所有的菌剂研究中， 几乎都采取全部混合且一次性投加微生物菌剂的方法，如陈芙蓉等(基于木质素生物降解的堆肥化接种剂开发，生态与农村环境学报，2008，M O) :84-87)从农林废物堆肥中筛选得到的5种菌，按照个数比细菌放线菌真菌为85 5 :10，枯草芽孢杆菌铜绿假单孢菌为55 :25，黑曲霉简青霉为2 1配比制作菌剂。但这种全部混合且一次性投加微生物菌剂的合理性是值得商榷的。在堆肥过程中，微生物是随升温、高温、降温三个阶段进行演替。 在升温阶段以嗜热微生物为主，而在高温阶段(我国《粪便无害化卫生标准》(GB7959-87) 的好氧堆肥工艺设计标准和规范，要求高温发酵过程必须保证堆体内物料温度在50°C以上并保持5 7天)时，嗜热微生物则上升为主导微生物。由于长时间的高温，许多微生物会死亡，即一次性投加接种剂中的木质素、纤维素降解菌会受到抑制甚至死亡，必将影响这些微生物在降温阶段时对木质纤维素的分解速度和效果，这表明一次性投加微生物接种剂的方法使得菌剂中的微生物的作用受到抑制。二是木质素对纤维素降解的影响。堆肥化中的限速有机物的降解一直被认为是快速堆肥的关键，也是高效复合菌剂开发的理论基础。牛粪木质纤维素含量高，水分较多，碳氮比不在适宜的堆肥范围，常常加入农业秸秆等进行调整。因此，牛粪和农业秸秆堆肥时， 木质纤维素的降解是促进堆肥化进程的关键。由于木质素一般都包裹在纤维素外，纤维素的快速且充分降解需要将木质素去除或破坏，尽管褐腐真菌能在不破坏木质素的情况下缓慢降解纤维素，但在其它纤维素降解菌(如木霉等)中并未发现具有此能力。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，根据堆肥的温度变化特点及木质纤维素原料最难降解的成分是木质纤维素的情况，提供一种木质纤维素原料的三段式堆肥发酵接种新工艺，其特点为分别制备高温菌剂、木质素降解菌剂、纤维素降解菌剂，且将菌剂的投加方式由常规的一次性投加改为三次投加，在堆置初期投加高温菌剂，保证堆体实现高温过程且避免了高温对木质纤维素降解菌的影响；在高温后期投加木质素降解菌剂，木质素降解菌剂对木质素有效降解避免了木质素对纤维素降解的阻碍；在木质素降解菌作用的后期投加纤维素降解菌剂对纤维素进行降解，三段式堆肥发酵接种新工艺可以充分发挥高温菌剂、木质素降解菌和纤维素降解菌的作用。本发明通过以下方法实现 (1)木质纤维素原料的前处理
根据高温菌剂的优化组合及培养条件的研究结果，调节木质纤维素原料的C/N比为25-35、含水率为 65-80%、pH 为 5-8。(2)微生物菌剂的配制
将分离得到的嗜热放线菌 sp GFl^Thernioactinoiwces sp GF2 按1-2 :1-5 :1-3的比例混合制得高温菌剂，将担子菌Cb/Tri/ms sp MFl和Cb/Tri/ms sp MF2按1-3:1-2的比例混合制得木质素降解菌剂，将纤维素降解菌Trichodenm sp XFl和 Rhizopus sp XF4按1-3:1-2的比例混合制得纤维素降解菌； (3)原料的堆置，此阶段分为以下三个步骤
第一步高温菌剂的投加，将高温菌剂与牛粪和秸秆充分混合，接种浓度达到每克堆料 1 X IO7-I X IO9个菌体，并将混合后的木质纤维素原料进行堆置；
第二步木质素降解菌剂的投加，当堆体的温度下降到40°C _35°C时，开始投加木质素降解菌剂，接种浓度为质量比0. 1- 0. 5%，对原料中的木质素进行降解；
第三步纤维素降解菌剂的投加，在木质素降解菌剂作用的后期即木质素降解菌剂的投加18-23天后，开始投加纤维素降解菌剂，接种浓度为每克堆料1 X IO7-I X IO9个菌体，对暴露的纤维素进行降解，降解作用持续10-15天。其中高温菌剂由采用55°C的培养条件从牛粪中分离获得两种嗜热放线菌配制而得。在菌剂的制备中，将嗜热细菌进行摇瓶培养。将两株嗜热放线菌分别经过含PDA培养基的平板培养，获得其孢子，配制浓度为每毫升IXlO9个孢子液。将以上2株菌的孢子按照1-5 1-3的比例混合，即获得三段式堆肥微生物菌剂中的高温菌剂。木质素降解菌剂由分离自牛粪上的2株具有木质素降解能力的担子菌组成。在菌剂的制备中，2株菌分别经过含PDA培养基的平板培养，获得其菌丝。将以上2株菌的菌丝体按照1-3 1-2的比例混合，即获得三段式堆肥微生物菌剂中的木质素降解菌剂。木质素降解菌剂分离自牛粪，且2株菌都具有纤维素降解能力。在菌剂的制备中， 2株菌分别经过含PDA培养基的平板培养，获得其分生孢子，浓度为每毫升IX IO9个孢子。 将以上2株菌的孢子按照1-3 1-2的比例混合，即获得三段式堆肥微生物菌剂中的纤维素降解菌剂。本发明相对于现有技术的优点是三段式堆肥发酵接种新工艺避免了高温对木质纤维素降解菌的影响，将木质素与纤维素的降解分开，充分发挥木质素降解菌和纤维素降解菌的作用从而提高堆肥的效率、缩短堆肥时间、改善堆肥质量，为快速高效的牛粪和农业堆肥的新工艺，为进一步拓宽堆肥的规模化应用奠定基础。
图1是木质纤维素原料堆肥的三段式接种工艺流程图。
具体实施例方式实施例1三段式堆肥中使用的微生物菌剂的制备，具体步骤如下 (1)高温菌剂的制备
以牛粪浸出液为培养基和的培养条件作为筛选条件，从牛粪中分离获得能在55 °C的培养条件下在牛粪浸出液培养基上正常生长的两种嗜热微生物 Thermoactinomyces sp GFl 禾口 Thermoactinomyces sp GF20
在菌剂的制备分为两个阶段。具体为
第一阶段是发酵。将两株菌分别接种到含PDA培养基的平板，置于55°C的培养箱中培养5-7天，待两株菌在平板上生长产生孢子后采用无菌水将孢子分别洗脱、收集，分别获得两株菌的孢子悬液。采用高速离心机对两株菌的孢子悬液离心，离心速度为8000 r/min,获得两株菌的孢子。然后分别将两株菌的孢子稀释制备成浓度为每毫升IX IO9个孢子的悬液。第二阶段是高温菌剂的配置。将第一阶段获得的两株菌的孢子液按照1 :1的比例混合，即获得三段式堆肥微生物菌剂中的高温菌剂。(2)木质素降解菌剂的制备
木质素降解菌剂由分离自牛粪上的2株具有木质素降解能力的Cb/TTi/ws sp MFl和 Coprinus sp MF2组成。在菌剂的制备中，将两株菌分别接种到含PDA培养基的平板上，放置在的培养箱中培养5-7天，待两株菌在平板上生且铺满整个平板时，采用药勺将平板上的两株菌的菌丝刮取并收集，分别获得两株菌的菌丝体。将两株菌的菌丝体按照1 :1 的比例混合，即获得三段式堆肥微生物菌剂中的木质素降解菌剂。(3)纤维素降解菌剂的制备
采用纤维素为唯一碳源木质素降解菌剂分离自牛粪，且都具有纤维素降解能力的2株真菌组成。在菌剂的制备中，将斤icAoiferaa sp XFl和Rhizopus sp XF4分别接种到含 PDA培养基的平板，置于55°C的培养箱中培养5-7天，待两株菌在平板上生长产生孢子后采用无菌水将孢子分别洗脱、收集，分别获得两株菌的孢子悬液。采用高速离心机对两株菌的孢子悬液离心，离心速度为8000 r/min，获得两株菌的孢子。然后分别将两株菌的孢子稀释制备成浓度为每毫升IXlO9个孢子的悬液。将以上2株菌的孢子按照1:1的比例混合，即获得三段式堆肥微生物菌剂中的纤维素降解菌剂。实施例2牛粪和秸秆堆肥的三段式接种工艺 (1)牛粪和秸秆的前处理
根据高温菌剂的优化组合及培养条件的研究结果，调节牛粪和秸秆混合物的C/N比为 27、含水率为75%、pH为7. 5。(2)微生物菌剂的配制配制方法如实施例1。(3)原料的堆置，此阶段分为以下三个步骤
第一步将高温菌剂360 ml与牛粪和秸秆混合物36. 4 kg充分混合，接种浓度达到每克堆料1 X IO8个菌体，并将混合后的牛粪和秸秆进行堆置，从堆置的第二天开始监测堆体温度。堆体第二天的温度达到47°C，第4天达到最高温度68°C，堆体的温度在50-60°C间，且维持55°C的高温时间达到6天。从第8天温度开始，堆体温度低于55°C且逐步下降。第二步当堆置12天后，堆体的温度下降到35°C时，开始投加木质素降解菌剂，接种浓度为质量百分比0.1%，对牛粪和秸秆中的木质素进行降解。第三步在木质素降解菌剂作用的后期即木质素降解菌剂投加的21天后，木质素降解菌剂的子实体消失，开始投加纤维素降解菌剂，接种浓度达到每克堆料1XIO8个菌体， 对暴露的纤维素进行降解，降解作用持续12天。经过45天的堆置，木质素和纤维素的降解率分别达到43%和62%，堆体的体积减少 70%。
实施例3猪粪和秸秆堆肥的三段式接种工艺 (1)秸秆的前处理
根据高温菌剂的优化组合及培养条件的研究结果，调节秸秆混合物的C/N比为25、含水率为65%、pH为6。(2)微生物菌剂的配制配制方法如实施例1。(3)原料的堆置，此阶段分为以下三个步骤
第一步将高温菌剂470 ml与猪粪和秸秆混合物47kg充分混合，接种浓度达到每克堆料1 X IO8个菌体，并将混合后的猪粪和秸秆进行堆置，从堆置的第二天开始监测堆体温度。 堆体第二天的温度达到50°C，第3天达到最高温度73°C，堆体的温度维持55°C的高温时间达到5天。从第7天温度开始，堆体温度低于55°C且逐步下降。第二步当堆置12天后，堆体的温度下降到35°C时，开始投加木质素降解菌剂，接种浓度为质量百分比0. 5%，对猪粪和秸秆中的木质素进行降解。第三步在木质素降解菌剂作用的后期即木质素降解菌剂投加的17天后，木质素降解菌剂的子实体消失，开始投加纤维素降解菌剂，接种浓度达到每克堆料1 X IO8个菌体， 对暴露的纤维素进行降解，降解作用持续12天。经过41天的堆置，木质素和纤维素的降解率分别达到46%和68%，堆体的体积减少 77%。
权利要求
1.一种木质纤维素原料的三段式堆肥发酵接种新工艺，其特征在于按如下步骤进行(1)木质纤维原料的前处理调整木质纤维原料的C/N比为25-35，含水率为65-80%，pH值为5_8 ；(2)三段式堆肥中使用的微生物菌剂的制备将分离得到的浓度为每毫升IXlO9个孢子或菌体的 erffloacii/^fflj^^s sp GFl和 Thermoactinomyces sp GF2按1-5 :1_3的比例混合制得高温菌剂；将担子菌Cb/Tri/ws sp MFl和Copri匪s sp MF2的菌丝按1_3:1_2的比例混合制得木质素降解菌剂；将浓度为每毫升 IXlO9 个孢子的sp XFl 禾Π Rhizopus sp XF4 按 1-3 1-2 的比例混合制得纤维素降解菌；(3)三段式堆肥发酵接种新工艺的堆置过程可以分为以下三个步骤第一步将高温菌剂与木质素原料充分混合，接种浓度达到每克堆料1 X IO7-I X IO9个菌体，并将混合后的木质纤维素原料进行堆置；第二步当堆体的温度下降到40°C-35°C时，按质量百分比为0. 1- 0. 5%的浓度投加木质素降解菌剂；第三步在木质素降解菌剂作用的后期即木质素降解菌剂投加1813天后，开始投加纤维素降解菌剂，接种浓度为每克堆料IXIO7-IXIO9个菌体，降解作用持续10-15天。
2.用于权利要求1所述方法的微生物菌剂，其特征在于高温菌剂由 Thermoactinomyces sp GFl 私 Thermoactinomyces sp GF2 按 1—5 1—3 的 t匕例混合制得。
3.用于权利要求1所述方法的微生物菌剂，其特征在于木质素降解菌剂由Coprinus sp MFl和Cb/Tri/HAS sp MF2的菌丝按1_3 1_2的比例混合制得。
4.用于权利要求1所述方法的微生物菌剂，其特征在于纤维素降解菌剂由 Trichoderma sp XFl 禾口 Rhizopus sp XF4 的孢子按 1-3 1-2 的比例混合制得。
全文摘要
本发明公开了一种木质纤维素原料堆肥的三段式接种工艺及微生物菌剂，三段式接种采用的微生物菌剂为高温菌剂、木质素降解菌剂和纤维素降解菌剂，将菌剂的投加方式由常规的一次性投加改为三次投加，在堆置初期投加高温菌剂，保证堆体实现高温过程且避免了高温对木质纤维素降解菌剂的影响；在高温后期投加木质素降解菌剂，木质素降解菌剂对木质素有效降解且打破了木质素对纤维素降解的阻碍；在木质素降解菌作用后期投加纤维素降解菌剂对纤维素进行降解。三段式堆肥发酵接种新工艺可以充分发挥高温菌剂、木质素降解菌和纤维素降解菌的作用且提高了堆肥效率、改善了堆肥质量，缩短了堆肥周期，是一种快速高效的木质纤维素原料堆肥新工艺。
文档编号C05F17/00GK102424614SQ20111027516
公开日2012年4月25日 申请日期2011年9月16日 优先权日2011年9月16日
发明者刘张, 周成, 宁平, 许菲, 黄兆林 申请人:昆明理工大学