专利名称：一种快速检测水稻温敏不育系的方法
技术领域：
本发明涉及植物品种的检测方法，具体涉及快速检测水稻温敏不育系株IS及其他温敏不育系的方法。
背景技术：
随着世界人口的不断增长以及工业的发展，人们对粮食的需求量日益增加，水稻作为主要的粮食作物之一，普遍受到人们的欢迎。据报道，世界上近一半人口，包括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为食。同样，水稻作为我国主要粮食作物之一，是我国人民最受欢迎的日常食物。随着人口的增长和耕地面积的减少，提高水稻产量成为解决我国粮食问题的重要途径。现代生物技术是培育高产水稻的重要手段之一，中国的杂交水稻为粮食增产作出了重要贡献。目前，中国杂交水稻年种植面积占水稻种植总面积的5 I %，产量约占水稻总产的6 O %,中国亚种间杂交稻一般比品种间杂交稻具有2 O %以上的增产潜力。利用水稻亚种间杂交优势是现阶段战略重点，二系法杂交水稻是突破亚种间水稻杂交困难的重要方法。水稻光、温敏两系不育资源的发现和在杂交水稻上的广泛应用，为利用两系法选育超级杂交水稻打开了新的局面。由于光温敏两系不育系受隐性核基因控制，与三系不育系相比，两系不育系具有自我繁殖，配组范围广，基因资源丰富等特点。因此，利用两系不育系选育超级杂交稻成为我国杂交水稻育种的主攻方向和发展趋势。 根据光周期和温度对育性的影响，两系不育系分为光敏型、温敏型和光温敏互作型等三个主要类型。农垦58S及其衍生的粳稻不育系属于典型的光敏型核不育系，在长日照条件下表现为不育，短日照条件下又可以恢复育性。而安农S-1、Y58S、株IS等则属于典型的温敏性不育系，即在高温不育，低温可育。另外，还有一些不育系既受光照影响同时也受到温度的调控，这类不育系称为光温互作型，如培矮64S等。株IS和陆18S是在生产实践中广泛应用的两系不育系，属于典型的温敏型不育系。株IS和陆18S是从遗传距离较远的不同生态型水稻杂交组合F2群体中发现的不育株，经“自然环境和人工环境双重压力选择法”选育的新低不育起点温度核不育系。由于淘汰了低世代变异群体中不育起点温度高和短期低温引起的育性波动不育类型，株IS和陆18S不育起点温度低，不育性稳定。其中，株IS的育性转育温度在22. 6°C左右，陆18S在23°C左右；并且对连续6天日平均23°C的低温不敏感，是国内不育起点温度低，不育性稳定的优良两系不育系。在实际生产中，株IS和陆18S生殖生长期耐低温能力强，大面积制种安全可靠，繁殖产量高，解决了低不育起点温敏不育系的繁殖难题。株IS和陆18S综合农艺性状好，抗性强，米质较优，分别于1999、2000年通过湖南省品种鉴定。目前，株IS已成为培育两系不育系的重要不育基因资源，利用株IS已转育成湘陵628S、潭农S等6个新不育系。株IS和陆18S配合力强，亲和谱广，已育成48个组合通过审定，其中国审早稻组合10个，省审早稻组合34个，分别占同期长江流域国审和省审两系早稻组合的62. 5%和44. 2%。株IS和陆18S所配组合亚种间优势明显，其中株两优819比对照增产10%，被农业部认定为首个早熟超级杂交早稻，并作为南方稻区区试对照和农业主导品种。陆两优819比对照增产8. 08%，也被农业部认定为超级杂交早稻。截止到2010年，株IS及陆18S所配品种在我国的累计种植面积超过9100万亩。株IS是培育两系超级水稻的重要不育资源，但是由于株IS株系缺少分子检测标记，在利用株IS培育其他不育系时，只能通过不育基因纯合后代的表型来鉴定，需要到F2代才能通过表型观察判定。通常而言，在某一品种与株IS杂交获得具有温敏特点的新不育系时，需要将纯合的杂交后代不育系与目标品种回交>5代，以得到具有该品种特性的新不育系，在常规育种条件下，由于每一次回交都需要在F2代才能确定不育系的表型，大大增加了育种的时间和工作量。本发明提供一种利用分子标记检测株IS或温敏不育系中控制温敏不育基因的方法，该方法在杂交F1代即可检测到携带温敏不育基因的株系，利用该株系与目标品种继续回交，直到回交目标代数，自交即获得具有温敏不育基因的新不育系，大大减少了育种的时间和工作量，对于加快我国杂交水稻的新品种的选育、提高水稻产量、解决我国粮食问题具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测水稻温敏不育系的方法。本发明所述的温敏不育性是指株IS或不育基因来源于株IS的不育系，包括但不限于株1S、以及由株IS培育的不育系。本发明所述的快速检测水稻温敏不育系的方法，包括以下步骤
1)对要检测的不育系和野生型材料提取基因组DNA；
2)利用引物进行PCR反应；
3)对PCR产物进行电泳；
4)电泳结果中比野生型材料PCR产物电泳条带，电泳速度快的为携带不育基因的不育
系O步骤2)所述的引物，其特征在于，引物序列由A或B所示的序列之一组成
A、RMZ-1IF:CCTCTGTATCCACGAAGGAT和RMZ-1IR: CACTCGGAGGTCTACAATCT ；
B、RMZ-13F:GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和RMZ-13R: GCGATGACTTGCCGCTGT ；
本发明还提供准确检测水稻温敏不育系的方法，包括以下步骤
1)对要检测的不育系和野生型材料提取基因组DNA；
2)PCR进行测序反应；
3)比较不育系与野生型材料测序序列的差异，区分是否为温敏不育系；
步骤3)所述的温敏型不育系测序序列与野生型的差异为携带不育基因的不育系，其特征在于，所述不同包含以下特征之一(以L0C_0s02gl2290基因的起始密码子“ATG”的“A”为O位置，“A”前面的序列为ATG以后的序列为“ + ”，并其与“A”的碱基数代表其位置。)
A、与野生型相比，待测株系第+70的核苷酸由C变成A;
B、与野生型相比，待测株系第-1640位的核苷酸从C到T;C、与野生型相比，待测株系第-1132位的核苷酸从T到A;
D、与野生型相比，待测株系第-1125位缺失AGA；
E、与野生型相比，第-791位的核苷酸A到C；
F、待测株系第-468位的核苷酸T到C;
G、野生型相比，待测株系第-122位的核苷酸从A到C;
H、与野生型相比，待测株系第+69位的核苷酸从G到T;
I、与野生型相比，待测株系或第+70位的核苷酸A到C；
J、与野生型相比，待测株系第-121位的核苷酸缺失T ；
K、待测株系第+1128位的核苷酸从G到A ;
L、与野生型相比，待测株系或第+1199位的核苷酸从A到T。
图1为RMZ-11F和RMZ-11R为引物PCR电泳图，1 :杂合株系，2 :93_11，3 :株1S，
4 :陆 18S ；。图2为RMZ-13F和RMZ-13R为引物PCR电泳图，1 :杂合株系，2 :株1S，3 :93_11， 4 :陆 18S。图3为以CX7958测序的峰图。
具体实施例方式实施例1、株1S温敏不育基因的图位克隆
首先，我们将株1S与93-11进行杂交，获得匕种子。F1种植以后自交，得到F2群体。 在 7500株&群体中，我们一共鉴定出1872株不育单株。通过SSR引物进行连锁分析， 我们将控制株1S育性的基因初步定位在标记RM7575与RM5897之间。进一步加密标记，最 终将控制株1S育性的基因定位在标记RMZ-17与RMZ-11之间。对表及之间的基因片段进 行测序，结果发现L0C_0s02gl2290的编码区出现了一个单碱基突变，该突变造成了一个终 止密码子，使翻译提前终止。这证明L0C_0s02gl2290为造成株1S温敏不育系的主要候选 基因。
实施例2、L0C_0s02gl2290基因组片段回复株1S的育性
我们利用酶切的方法从BAC上克隆了包含L0C_0s02gl2290的基因组DNA片段，并将其 构建进PCAMBIA2300的双元表达载体。通过农杆菌介导的方法，我们将L0C_0s02gl2290的 基因组片段导入株1S的基因组中。在高温条件下，株1S完全不育，没有花粉产生；而转基 因互补植株能够恢复株1S的育性，并且能够很好地结实。这证明L0C_0s02gl2290是控制 株1S温敏不育的育性基因。
实施例3、利用PCR反应检测不育系
我们对L0C_0s02gl2290附近的DNA进行了基因组测序，并鉴定出新的标记RMZ-11和 RMZ-13。标记 RMZ-11 距离 L0C_0s02gl2290 约 3. 34kb，是一个 75bp 的缺失。在 93—11 基因组中含有这一片段，株1S，陆18S中均不含有该片段。我们根据RMZ-1l和RMZ-13位置设计引物进行PCR反应检测不育系。首先按照以下方法对待检测的株系和野生型水稻提取DNA
1，将适量植物材料在研钵中研磨，加入Iml CTAB溶液，转入1.5ml EP管中，65°C温育30-60分钟，并不时颠倒地混匀。2，12000rpm离心5-10分钟，取上清，加入等体积氯仿异戊醇(24:1)混合液，颠倒混匀，IOOOOrpm离心5分钟，取上清移至新EP管中。3，上清中加入700 uL异丙醇，-20°C沉淀I小时，12000rpm离心5分钟，沉淀用75%乙醇洗涤，干燥后，溶于100 uL水中，待用。试剂配置2X CTAB 溶液2%CTAB，O. 1%PVP40，20mM EDTA (pH 8. 0), IOOmMTris-HCl (pH 8. 0)，1. 4M NaCl。RMZ-1IF: CCTCTGTATCCACGAAGGAT 和 RMZ-11R: CACTCGGAGGTCTACAATCT 为引物，以提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应体系如下
10XPCR buffer2. O uL
2. 5mM each dNTP1. O uL
RMZ-1lF (10 uM)O. 5 uL
RMZ-1lR (10 uM)O. 5 uL
DNA 模板1. OuL
rTaqO. 2 uL
用H20补充到20 uL
PCR反应条件95°C for 2min; (95°C for 20s, 58°C for 30s, 72°C for 20s) X 32个循环；
72°C for IOmin; keep at 4。。。PCR产物用1. 5%琼脂糖进行电泳，150V电泳20分钟，不育性的产物比野生型的产物电泳速度快，如附图1所示。标记RMZ-13距离L0C_0s02gl2290编码区起始密码子仅6bp，较野生型多出6bp。以 RMZ-13F: GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和
RMZ-13R: GCGATGACTTGCCGCTGT 为引物，PCR 反应体系如下
10XPCR buffer2. O uL
2.5mM each dNTP1. O uL
RMZ-13F (10 uM)0. 5 uL
RMZ-13R (10 uM)0. 5 uL
DNA 模板1. OuL
rTaq0. 2 uL
用H20补充到20 uL
PCR反应条件95°C for 2min; (95°C for 20s, 60°C for 20s, 72°C for 20s) X 32个循环；
72°C for IOmin; keep at 4....
PCR产物电泳速度慢的为不育系。用10%PAGE胶进行电泳，400V电泳180分钟，如附图2所示。
实施例4、利用测序反应检测不育系
通过对L0C_0s02gl2290基因组片段进行直接测序，我们鉴定出9个SNP，即SNP-Zl SNP-Z9。另外，还检测到两个InDel，SP InDel-Zl和InDel_Z2。以下通过测序获得的覆盖L0C_0s02gl2290的株IS基因组序列，共约3. 6 kb。在携带不育基因的株系中上述SNP和InDel的序列与野生型不同，所以可以用测序的方法检测上述SNP和InDel，从待检测材料中检测出不育株系。利用实施例3所述的提取基因组的方法提取待检测株系和野生型株系的基因组 DNA，利用实施例 3 所述的 PCR 体系以 cx8867: CCGAGTAGACATTGACTTGG 和 cx7958:GTCTTGAAGGCCTTCACCTT为引物，进行PCR反应，PCR产物经琼脂糖回收后，提交测序，测序引物是cx7958。经测序后+70位置的核苷酸从C变成A，由于cx7958是反向测序引物，即为附图3箭头所示的从G变成T。由于该位点的突变直接导致了株IS的温敏不育，所以直接对该位点直接测序是检测株IS温敏不育基因最直接、最准确的方法。同时，我们对国内主要的温敏不育系进行了 DNA直接测序，结果发现生产应用主要温敏不育系均是该位点发生了有C到A的突变。由此我们证明该方法不仅适用于株IS和由株IS不育基因培育的不育系，还包括其他生产上应用的主要温敏不育系，如C815S，Y58S，广占63S以及有它们为不育基因供体培育不育系，如图4所示。其他SNP和InDel的检测方法如下
以 cx7953: CTCAGCAACAGACAGAGGAGT; cx7954: AAATTTCGGACCCTCACCGG 为引物，进行PCR反应，PCR产物经琼脂糖回收后，提交测序，测序引物是CX7953。与野生型相比，待测株系第-1640位的核苷酸从C到T，即为附图4箭头，或第-1132位的核苷酸从T到A，或第-1222位缺失AGA ；
以 cx7955: GGTTGCTCGATCTGAAGCAT; cx7956: TTGAGAAGGGCTTCTCCTCG 为引物，进行PCR反应，PCR产物经琼脂糖回收后，提交测序，测序引物是cx7955。与野生型相比，第-791位的核苷酸A到C，第-468位的核苷酸T到C。以 cx7957: TGCCGATGCAACCTCTTGC; cx7958: GTCTTGAAGGCCTTCACCTT 为引物，进行PCR反应，PCR产物经琼脂糖回收后，提交测序，测序引物是CX7957。与野生型相比，待测株系第-122位的核苷酸从A到C，或第+69位的核苷酸从G到T，或第+70位的核苷酸C到A，第-121位的核苷酸缺失T 。以 cx7961: CTTCAAGCACGGATATCAG; cx7962: CTCTACTTCTGAAAGAGGGT 为引物，进行PCR反应，PCR产物经琼脂糖回收后，提交测序，测序引物是CX7961。与野生型相比，待测株系第+1128位的核苷酸从G到A，或第+1199位的核苷酸从A到T。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所湖南亚华种业科学研究院
<120>一种快速检测水稻温敏不育系的方法
<130>I
<160>12
< 170>PatentIn version 3.5
<210>I
<211>20
<212>DNA
<213>Oryzasativa
<220>
<221 >miscdifference
<222>(1)..(15)
<400>I
cctctgtatc cacgaaggat20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Oryzasativa
<220>
<221 >misc difference
<222>(1)..(20)
<400>2
cactcggagg tctacaatct20
<210>3
<211>22
<212>DNA<213>Oryzasativa
<220>
<221>miscdifference
<222>(1)..(22)
<400>3
gtaatgtcgt aaggaaatgc cc22
<210>4
<211>18
<212>DNA <213>Oryzasativa
<220>
<221>miscdifference
<222>(1)..(18)
<400>4
gcgatgactt gccgctgt18
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>Oryzasativa
<220>
<221>miscdifference
<222>(1)..(21)
<400>5
ctcagcaaca gacagaggag t21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>Oryzasativa
权利要求
1.一种快速便捷检测水稻温敏不育系的方法，包括以下步骤 对要检测的株系和野生型提取基因组DNA ； 利用引物进行PCR反应； 对PCR产物进行电泳； 电泳结果中比野生型产物电泳速度快的为携带不育基因的温敏不育系； 步骤2)所述的引物，其特征在于，引物序列由A或B所示的序列之一组成A、RMZ-1lFCCTCTGTATCCACGAAGGAT 和 RMZ-11R: CACTCGGAGGTCTACAATCT ；B、RMZ-13F:GTAATGTCGTAAGGAAATGCCC 和 RMZ-13R: GCGATGACTTGCCGCTGT。
2.一种快速准确检测水稻温敏不育系的方法，包括以下步骤 对要检测的待检测材料提取基因组DNA ； 进行测序反应； 测序序列与野生型以及株IS序列比较，与株IS相同的为携带不育基因的不育系；步骤3)所述的测序序列与野生型不同的为携带不育基因的不育系，其特征在于，所述不同包含以下特征之一 A、与野生型相比，待测株系第+70的核苷酸由G变成A; B、与野生型相比，待测株系第-1640位的核苷酸从C到T; C、与野生型相比，待测株系第-1132位的核苷酸从T到A; D、与野生型相比，待测株系第-1222位缺失AGA； E、与野生型相比，第-791位的核苷酸A到C； F、与野生型相比，待测株系第-468位的核苷酸T到C; G、与野生型相比，待测株系第-122位的核苷酸从A到C； H、与野生型相比，待测株系第+69位的核苷酸从G到T;1、与野生型相比，待测株系或第+70位的核苷酸C到A; J、与野生型相比，待测株系第-121位的核苷酸缺失T ； K、与野生型相比，待测株系第+1128位的核苷酸从G到A ; L、与野生型相比，待测株系或第+1199位的核苷酸从A到T。
全文摘要
本发明的目的是提供一种快速检测水稻温敏不育系的方法。首先对要检测的株系和野生型提取基因组DNA；利用引物进行PCR反应；对PCR产物进行电泳；电泳结果中比野生型产物电泳速度快的为携带不育基因的温敏不育系。此结果还可以进一步利用测序反应准确检测。该方法大大减少了育种的时间和工作量，对于加快我国杂交水稻的新品种的选育、提高水稻产量、解决我国粮食问题具有重要的意义。
文档编号A01C1/00GK103026821SQ20111029292
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者曹晓风, 杨远柱, 周明, 胡小淳 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所, 湖南亚华种业科学研究院