专利名称：Cre/loxP重组酶系统在菊花转基因育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物育种领域，具体涉及利用Cre/loxP重组酶系统删除选择标记基因，获得无选择标记基因的转基因菊花的方法。
背景技术：
在植物的转基因研究中，标记基因普遍被用来从大量的转化细胞中筛选出阳性转化子，目前采用最多的为抗生素抗性基因或除草剂抗性基因。虽然，在观赏植物中使用标记基因不会对食品安全产生影响，但是，随着转基因技术的不断发展突破，转基因植物对生态环境污染等方面的问题越来越受到重视。目前，Cre/loxP系统是最完善也是应用最广泛的删除标记基因的方法，它可以定向删除转基因植物中的标记基因。Chakraborti等将Cre/ IoxP重组系统应用于烟草中，通过有性杂交获得了无标记基因的烟草。Koper等利用种子特异启动子诱导Cre酶的表达，在甘蓝型油菜中实现了标记基因的删除。利用诱导删除系统，在拟南芥、玉米、烟草、马铃薯、番茄、水稻等作物中都成功删除了标记基因。目前，诱导删除系统主要在双子叶植物中应用，在单子叶植物中的删除效率非常低。rd29A启动子可以在低温、干旱以及高盐胁迫下快速应答，常被应用于植物抗逆转基因研究中。李新玲等通过将拟南芥rd29A启动子转化烟草，表明其可在逆境胁迫诱导下驱动下游目的基因的超量表达，杨春霞等的试验也表明rd29A启动子在低温、干旱、高盐等环境胁迫下可以增强gus基因的表达。根据rd29A启动子的这一特点，将其构建到Cre/ IoxP系统的植物表达载体上，可以先利用抗性标记基因筛选出阳性转化子，然后在低温等诱导条件下诱导Cre重组酶基因表达，从而实现抗性标记基因的删除。地被菊植株低矮、株型紧凑、冠型丰满、花朵繁多、花色丰富，是极具绿化、美化及香化前景的优良园林地被植物。目前，地被菊主要在我国北京、天津及“三北”地区应用；在南方，由于气候湿热，还未得到广泛引种栽培。另外，随着全球气候条件的持续恶化，加强观赏植物的抗逆育种迫在眉睫，植物分子育种比传统的育种方法更具有预见性和创新性， 并能大大缩短育种周期。转基因植物的安全性以及遗传稳定性一直遭到质疑，利用Cre/ IoxP系统开展地被菊抗逆转基因育种方面的研究，为观赏植物的安全转基因育种提供技术参考。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供Cre/loxP重组酶系统在菊花育种中的应用。本发明中，所述的应用是将目标基因和Cre/loxP分别构建到不同的植物表达载体中，共转化菊花，并诱导Cre基因表达后删除选择标记基因，获得无选择标记基因的转基因株系。在一个具体的实施方案中，将P5CS-F129A、NP-I和Cre/loxP构建到不同的植物表达载体中，共转化菊花，并诱导Cre基因表达后删除选择标记，获得无选择标记基因的转P5CS-F129A和NP-I基因的菊花转基因株系。其中，诱导Cre基因表达的启动子可为本领域公知的诱导型启动子，优选为 rc^9A，该启动子可在低温条件下诱导Cre重组酶表达，从而实现抗性标记基因的删除， 具体诱导方法为，将转基因阳性株系进行分化培养，并在分化培养过程中用4°C低温处理 12 24小时。本发明中，将选择标记基因构建于两个同向的IoxP位点之间。本发明中，可使用本领域公知的转化方法将携带不同基因的表达载体共转化菊花，优选的共转化方法为基因枪法或农杆菌介导法，最优选为基因枪法。本发明还提供一种无选择标记基因的菊花转基因方法，其为将目标基因和Cre/ IoxP分别构建到不同的植物表达载体中，共转化菊花，并诱导Cre基因表达后删除选择标记基因，获得无选择标记基因的转基因株系。本发明利用基因枪介导的方法，将分别携带外源P5CS、NP_1基因以及Cre/loxP的植物表达载体共同转化地被菊，通过PCR及Southern杂交检测，确定获得了多基因整合转化的转基因株系；在通过4°C低温处理，使Cre表达，从而删除位于两个同向IoxP位点间的选择标记基因，经过分子手段检测，证明所得结果正确，得到了不含有标记基因npt-II的地被菊转基因株系。
图1所示为本发明涉及的植物表达载体示意图。其中A为HiSb-rd29A-Cre/lOX 构建图；B 为 PBin35s-NP-l ；C 为 pBPC_P5CS_FU9A。图2所示rd29A启动子PCR结果。图3为PCR鉴定Cre基因片段的结果。1，2为扩增得到的Cre片段。图4为酶切鉴定Cre基因片段结果。M为Marker DL2000 ；1，2为酶切鉴定阳性。图 5 为 PCR 鉴定 RD29A-Cre-Nos 结果。M 为 Marker DL2000 ；1-12 为 PCR 产物图6为酶切鉴定RD^A-Cre-nos结果。M为Marker DL2000 ；1-12为酶切结果，其中 1，2，5，7，8，9，10，11，12 鉴定阳性。图7所示为地被菊‘北林黄’抗性生根植物的获得。A，外植体分化；B，分化的外植体单体；C，分化芽在抗性培养基上的筛选；D，抗性芽继代筛选；E，抗性芽生根；F，完整抗性植株获得。图8所示为部分转基因株系PCR检测。M，DL 2000 (Takara) ； 1，阳性质粒；2，非转化植株；3 14，同一植株的扩增产物混合后琼脂糖凝胶电泳检测。 图9所示为转化株系Southern杂交检测。C，质粒阳性对照；1，未转化植株阴性对照；A，Bar基因探针针；B，Cre基因探针；C，NP-I基因探针；2 9为转化株系。图10所示为低温处理对外植体分化的影响。左图，低温使外植体分化的不定芽莲座化严重；右图，低温使外植体分化的不定芽玻璃化严重。图11所示为部分G1代转基因株系PCR检测。M, DL2000 (Takara) ； 1，阳性质粒；2， 非转化植株；3 16，同一植株的扩增产物混合后琼脂糖凝胶电泳检测。图12所示为G1代转基因株系的Southern检测。C为阳性质粒对照。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例Pksb-rc^gA-Cre/lox植物表达载体构建先从拟南芥中PCR扩增出启动子rc^9A，用^CbaI和BamHI双酶切，与同样用)(bal 和BamHI双酶切的中间载体pUC18大片段相连得到中间载体pUC18_rd29A。WpCre质粒中 PCR扩增出目的基因Cre,并用NcoI和PstI双酶切，同时将pUC18_rd29A用NcoI和PstI 双酶切，连接得到中间载体pUC18-rd29A-Cre、再用PCR的方法从Pucl8-rd29A_Cre载体中扩增出rc^9A-Cre-nos读码框序列，并用&icl和MuI双酶切，与同样用&icl和MuI双酶切的表达载体Pksb连接得到消除选择标记系统的植物表达载体I^Sb-rd29A-Cre/lOX。(l)rd29A启动子的PCR扩增上游引物P1 (5 ‘ -GTCTCTAGACGACTCAAAACAAACAAACTTACG-3 ‘ )、rd29A 下游引物 P 2 (5 ‘ -CTTGGATCCMTCAMCCCTTTATTC-3 ‘ )。rd29A 的 PCR扩增体系为 25 μ L :40 IOOngDNA, 10ymol/L 弓| 物 PI、P2 各 1 μ L，IOXPCR 缓冲液 2. 5 μ L, lOmmol/LdNTP 混合液 2 μ L，Taq 酶0. 5U，用ddH20补足至终体积25 μ L。反应条件94°C预变性^iin ；94°C 45s,58°C 45s、 72°C lmin，30个循环；72°C延伸7min。电泳回收PCR产物(图2)，并连接到T-Easy载体， 送上海生工测序。O) Cre基因的PCR扩增以pCre质粒(携带有Cre基因的克隆载体)为模板，以上游引物P3 :5 ‘ -GCTCCA TGGAT-GTCCAATTTACTGA-3 ‘(含Nco I 酶切位点)，下游引物 P4 5 ‘ -GTCCTGCAGTTCTTACTM TCGCCA-3'(含I^st I酶切位点)为引物进行PCR扩增。Cre基因的PCR扩增体系为25μ L 10 40ng pCre 质粒 DNA, 10 μ mol/L 引物 P1、P2 各 1 μ L, 10XPCR 缓冲液 2. 5 μ L, IOmmol/ L dNTP混合液2 μ L，Taq酶0. 5U，用ddH20补足至终体积25 μ L。反应条件94°C预变性 4min ；94°C 45s,58°C 45s,72°C 70s，30个循环；72°C延伸7min。的琼脂糖凝胶电泳得到一个IOOObp左右的片段(图3)，回收PCR产物，并连接到T-Easy载体，Nco I和I^st I双酶切鉴定为正确(图4)。送上海生工测序，测序结果表明克隆为Cre基因。(3)植物表达载体Pksb-RD^A-Cre/Lox构建及鉴定用PCR得到的rd29A启动子替换掉pUC18中间载体上的35S启动子；用 NcoI和I3StI双酶切Cre基因的PCR回收产物，同时用NcoI和I3StI双酶切中间载体pUC18-rd29A，切掉其原有的cDNA区域，将Cre基因插入到pUC18_rd29A中，得到中间载体pUC18-RD-Cre-n0S，然后设计引物PCR得到两端带有McI和MuI酶切位点的 RD29A-Cre-nos读码框序列。PCR产物用&icl和MuI双酶切，同时用&icl和MuI双酶切I^ksb植物表达载体，切除其原有的GUS读码框，将RD^A-Cre基因片段与得到的大片段 Pksb连接，最终得到载体Pksb-RD^A-Cre/Lox。RD29A-Cre-Nos经PCR(图5)和酶切验证正确(图6)。本发明的Pksb-RD^A-Cre/Lox的构建方法还可参见石君等，2009，利用 Cre/loxp系统和rd29A启动子构建诱导型植物标记基因删除载体，分子植物育种，7 (5) 1040-1044。本研究将诱导Cre重组酶表达的诱导型启动子RD29A与Lox位点-标记基因-Lox 位点及Cre构建于同一个质粒同一 T-DNA区域，希望在一定的转化介导，通过一定的逆境环境诱导RD29A的表达，从而将标记基因及Cre基因一并切除，这将可以从转基因植物的当代通过PCR的方法筛选出无选择标记的转基因植物。并且比安全标记基因有着更广泛的应用前景。PBin35s-NP-l根据张秀海，沈元月，2001，兔防御素NP_1基因在转基因番茄中表达的初步研究，公开的方法进行构建。pBPC-P5CS-F129A由根据李志亮等，2005，利用基因枪法向高羊茅导入P5CS基因的研究，公开的方法构建。实施例2基因枪介导转基因菊花的获得1.外植体的预培养选取培养30d左右的大小和营养长势较一致的‘北林黄’无菌菊花苗上部嫩叶、中部叶片及下部老叶剪成小块，放在MS+0. 2mol/L山梨醇+0. 2mol/L甘露醇的高渗培养基上培养1 1。2.金粉与子弹制备微粒子弹的制备参照Sanford等的方法。金粉悬液的制备1)称取直径为LOym的金粉颗粒30mg于1. 5mL的离心管中。2)加入无水乙醇 lmL，涡旋 3_5min，静置 15min，15000rpm 离心 5min。3)小心去除上清，加入ImL无菌蒸馏水，充分涡旋lmin，静置lmin，离心，弃上清。4)用无菌水重复洗3次。5)加500 μ L 50%的甘油于金粉中，微弹浓度大约60mg/mL。DNA 的包被1)涡旋保存在甘油中的金粉5min。取金粉悬液50 μ L，加入无菌的离心管中。2)依次加入质粒DNA (质量比为 1 1 1 混合的PBin;35s-NP-l、pBPC-P5CS-FU9A 和 Pksb-RD29A-Cre/Lox) 5 μ L (DNA 浓度 1 μ g/ μ L)，50 μ L 2. 5Μ 的 CaCl2,并涡旋混勻。加入20 μ L的0. IM的亚精胺。混合物涡旋混勻2min，静置lmin。3)离心20s，弃去上清。4)加入500yL 70%乙醇，洗涤金粉沉淀。离心，小心去除上清。5)加入500 μ L无水乙醇，洗涤金粉沉淀。离心，小心去除上清(重复两次)。6)加70 μ L无水乙醇，轻轻敲击离心管数次悬浮金粉，低速涡旋。3.基因枪轰击方法参考杨成民的方法的方法，略作改进。(1)先将基因枪放置于一个较大型号的超净工作台上，紫外灯杀菌30min以上，用 70%乙醇对基因枪表面及样品室进行消毒(注意一定要仔细擦洗)。同时，将阻挡网和可裂圆片托座，微弹载体及其固定器、固定工具高压灭菌。可裂膜片可用异丙醇浸泡进行表面灭菌。将微粒裁片嵌入固定环中，取DNA及金粉的混合物加于微粒裁片中心，干燥Imin左右。(2)安装可裂膜于其托座上，顺时针拧到气体加速器上。(3)将空间环、阻挡网、阻挡网托座、微粒载片及固定环(带有微粒的一面朝下)安装好，旋紧盖子，插入枪中。(4)把样品放在轰击室中，关好门。(5)打开氦气瓶的总阀，顺时针转氦气调节阀，使氦压表指针指示数高于可裂膜压力 200Psi ( = 1. 379MPa)，即 1300Psi。(6)打开基因枪及变压器开关。(7)按动真空VAC键，待真空至沈-观英寸汞柱(=88. 05-94. 82kPa)时，迅速按下Hold键，接着按任发射FIRE键，并保持不动，直到击发为止。(8)按通气Vent键待真空表回零后，打开真空室小门，取出样品。(9)关机把氦气瓶的总开关旋紧，打一次空枪，到氦压表指针回零后，逆时针旋转氦压表调节阀；关闭基因枪的总开关及变压器开关。4.轰击距离的选择剪切好并经过预培养的外植体放在培养皿中心3cm的直径范围内，轰击距离设置了 6cm和9cm两个射程，以分析射程距离对地被菊转化效率的影响，结果最优选择9cm。5.转化外植体的恢复培养与筛选培养外植体在进行轰击后，对其进行恢复培养3d，恢复培养使用的培养基为 MS+1. 5mg/L 6-BA+l. Omg/L NAA，筛选培养使用的培养基为 MS+1. 5mg/L 6-BA+l. Omg/L NAA+2mg/L Kan+2mg/L草丁膦，以尽可能多的获得抗性生根植株。转化苗的分化过程如图7 所示。实施例3转基因植株的PCR检测(1) CTAB法提取菊花基因组DNAA.提取前将菊花苗暗培养2-3d，降低材料中淀粉等的含量；B.剪取抗性芽和未转基因对照菊花的幼嫩叶片，至于预冷的研钵中，倒入液氮迅速研磨成粉末，取适量粉末用小钥匙装入预冷的2mL离心管中，加入650 μ L预热的2 X CTAB 提取缓冲液(事先加入2%巯基乙醇)，迅速混勻；C. 65 °C水浴保温30-50min。用手轻轻上下颠倒2_4次，使提取液与材料充分混勻；D.待提取液冷却至室温后，加入等体积的M 1的氯仿异戊醇，轻轻混勻。室温下，12000rpm离心lOmin，吸取上层水相；E.加入RNase酶，于恒温培养箱中37°C消化30min ；F.加入等体积的酚氯仿，混勻，12000rpm离心lOmin，取上层水相；G.用M 1的氯仿异戊醇重复抽提一次，12000rpm离心lOmin，取上层水相；H.加入2倍体积的无水乙醇或2/3体积的异丙醇于室温沉淀DNA，并用75%的乙醇洗涤3-4次，最后用无水乙醇再洗涤1次，并于室温晾干，以便乙醇彻底挥发；I.用灭菌的双蒸水或TE溶液溶解沉淀，于_20°C保存，以备后续试验。(2)引物与反应体系反应体系分别以转基因地被菊抗性植株和非转基因菊花组培苗叶片总DNA、阳性对照质粒DNA为模板，以Bar、NP-I和Npt II分别设计一对特异引物进行PCR扩增反应。表IPCR 引物
权利要求
1.Cre/loxP重组酶系统在菊花转基因育种中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将目标基因和Cre/loxP分别构建到不同的植物表达载体中，共转化菊花，并诱导Cre基因表达后删除位于两个同向Ioxp位点之间的选择标记基因，获得无选择标记基因的转基因株系。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将P5CS-F129A、NP-1和Cre/loxP构建到不同的植物表达载体中，共转化菊花，并诱导并诱导Cre基因表达后删除选择标记，获得无选择标记基因的转P5CS-F129A和NP-I基因的菊花转基因株系。
4.如权利要求1 3任一项所述的应用，其特征在于，诱导Cre基因表达的启动子为诱导型启动子。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的诱导型启动子为rc^9A。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将转基因阳性株系进行分化培养，并在分化培养过程中用4°C低温处理12 M小时。
7.如权利要求1 3任一项所述的应用，其特征在于，通过基因枪法或农杆菌介导法将不同植物表达载体共转化菊花。
8.如权利要求1 3任一项所述的应用，其特征在于，所述的菊花为地被菊。
9.一种无选择标记基因的菊花转基因方法，其特征在于，将目标基因和Cre/loxP分别构建到不同的植物表达载体中，共转化菊花，并诱导Cre基因表达后删除位于两个同向 Ioxp位点之间的选择标记基因，获得无选择标记基因的转基因株系。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的目标基因为P5CS-F129A和NP-I。
全文摘要
本发明涉及Cre/loxP重组酶系统在菊花转基因育种中的应用。本发明利用基因枪介导的方法，将分别携带外源P5CS、NP-1基因以及Cre/loxP的植物表达载体共同转化地被菊，通过PCR及Southern杂交检测，确定获得了多基因整合转化的转基因株系；再通过4℃低温处理，使Cre表达，从而删除位于两个同向loxP位点间的选择标记基因，经过分子手段检测，证明所得结果正确，得到了不含有标记基因npt-II的地被菊转基因株系。
文档编号A01H5/00GK102559742SQ20111043995
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年6月17日
发明者张启翔, 张秀海, 程堂仁, 赵伶俐, 高亦珂 申请人:北京林业大学