专利名称：一种黄曲霉毒素吸附剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品生物技术领域，涉及一种黄曲霉毒素吸附剂及其应用，具体的说，该黄曲霉毒素吸附剂是一种含有中药渣和灭活乳酸菌的动物保健品。
背景技术：
黄曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)是由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)等真菌产生的一组结构极其相似的、具有强致癌性的有毒次生代谢物，常见的有81、82、61、62』1、112六种。其中以黄曲霉毒素BI毒性最强，M1、G1次之，B2、G2较弱。黄曲霉对生存环境要求不高，是一种非常粗生的霉菌，在自然环境中极易生长、繁殖和产毒。特别容易在玉米、花生、棉子及其饼柏等动物性饲料中生长。同时，AFT毒性极强、不易破坏，并且对畜禽造成严重的免疫抑制。AFT主要的靶器官是肝脏，对肺、心肌层和肾也有损害，而且能在大脑中积累，高浓度黄曲霉毒素对一些物种有致畸作用。目前，对饲料中AFT去除的方法主要有物理法、化学法和生物法三大类。如采用活性炭、硅铝酸盐类和葡甘聚糖等吸附饲料中的AFT后一并排除体外，其中以硅铝酸盐类吸附剂应用最为广泛。诺维信公司公开了采用漆酶、角质酶和羧肽酶降解AFT方法(发明专利，CN 101959425 A)，沈阳科丰牧业科技有限公司公开了采用产脘假丝酵母、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌的混合制剂降解AFT的方法(发明专利，CN 101812406 A)。中草药是祖国传统医学的重要组成部分，中草药正逐步走向世界。近年来，国内外市场对中药需求的快速增长，中药材提取加工后产生的中药渣也越来越多。目前，全国中成药厂每年产生的药渣可达1000万吨以上，其中90%以上的药渣作为废料垃圾掩埋或焚烧，这样处理，对地下水和大气环境带来相当大的污染，同时也是一种严重的资源浪费。中草药是纯天然物质，无毒无害、无残留、无耐药性，安全可靠，而且兼有营养和药效双重功能，因而受到我国畜牧工作者的重视。利用中草药或其药渣，煎汤或研磨成细末，制成单方或复方制剂，在普通饲养条件下，将制剂添加于动物日粮中，以预防动物疾病、促进生长、提高生产性能或改善畜禽产品质量，这种制剂称为中草药饲料添加剂。但是，由于许多中草药资源有限，价格不菲，在动物生产中应用成本较高，所以很推广使用。经过提取后的中药渣中除含有大量的纤维素、木质素外，仍残留有相当多的有效成分。作为饲料添加剂具有一定的防病促长功能。将中药渣作为饲料添加剂对动物生长具有良好的促进作用，同时节约资源和成本，在替代中药材用作饲料添加剂方面有很大的潜力。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黄曲霉毒素吸附剂，该吸附剂是一种由中药渣粉和乳酸菌组成的，能够抑制饲料贮藏过程中黄曲霉毒素产生菌合成黄曲霉毒素(AFT)的饲料添加剂。本发明提供的由中药渣粉和乳酸菌组成的饲料添加齐U，可吸附饲料中的黄曲霉毒素并随粪便排出体外，对动物内脏起到保护作用。本发明的另一目的在于 提供上述黄曲霉毒素吸附剂的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现:一种黄曲霉毒素吸附剂，该吸附剂是由中药渣粉和乳酸菌混合制成。每IOOkg上述吸附剂中，中药渣粉的含量为50 90kg，乳酸菌的含量为IO14 IO16个细胞。所述中药渣粉是细度为60目 200目的中药渣粉，含水量为6% 12%。所述中药渣粉为板蓝根、鸡骨草和金银花水浸提取后的药渣混合物，为广东凉茶生产后的废料，对其混合比例不作限定。所述乳酸菌是乳酸菌和灭活乳酸菌制剂中的一种或两者的混合物。所述乳酸菌可采用灭活乳酸菌制剂，根据其所含菌数调节添加剂量。所述乳酸菌是嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、短双歧杆菌和唾液乳杆菌中的一种以上。所述灭活乳酸菌制剂是将所述乳酸菌经70 100°C高温处理10 20min，得到灭活乳Ife囷制剂。所述黄曲霉毒素吸附剂为粉剂、颗粒剂或片剂。所述黄曲霉毒素吸附剂可用作饲料添加剂，应用于饲料贮藏阶段，也可在养殖场使用。本发明的原理是:平板抑菌实验考察中药渣粉的水提取物对黄曲霉生长的抑制效果结果表明中药渣中含有可以有效抑制黄曲霉生长的物质，从而使以其为原料制备的黄曲霉素吸附剂也具有抑制黄曲霉生长的效果。本发明利用板蓝根、鸡骨草和金银花水提取后的药渣作为乳酸菌吸附剂，开发可吸附饲料中黄曲霉毒素的饲用复合微生态制剂，黄曲霉毒素吸附剂中是将中药渣粉作为乳酸菌及其代谢产物的吸附剂，将菌体和乳酸菌代谢产物吸附在中药渣颗粒表面。该饲用微生态制剂具有促进动物消化吸收、调节动物肠道微生态平衡，同时由于利用了三种中药残留药效成分，使其具有清热祛湿之功效，尤其适合在南方养殖区域使用，可促进动物生长、保证动物健康及提高畜产品品质。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明的黄曲霉毒素吸附剂通过多组分间的相互配合和作用，防治饲料中的黄曲霉毒素影响动物健康，提高动物健康水平，其优点如下:(I)中药渣中残余的黄酮类物质可抑制黄曲霉毒素产生菌合成毒素；(2)中药渣中粗纤维及其木质素具有较大的表面积，对黄曲霉毒素具有吸附作用；(3)本发明的黄曲霉毒素吸附剂中乳酸菌对黄曲霉毒素具有吸附作用，可与中药渣中难降解组分一起吸附饲料中的黄曲霉毒素并随动物粪便排出体外，灭活乳酸菌细胞的使用使产品效果更稳定；(4)本发明使用的灭活乳酸菌制剂中的灭活乳酸菌细胞可吸附到小肠上皮粘膜细胞，起到防止动物肠道病原菌侵染的效果；(5)中药渣和灭活乳酸菌制剂中的灭活乳酸菌细胞对于保护动物健康具有协同增效的作用，且该吸附剂对于幼龄动物具有较好的保健效果；(6)通过本发明，中药渣得到资源化利用，从而实现中草药全药利用。
同时，本发明不仅减少了中药渣对环境的污染，并且使药渣中残留的药效成分被再次利用，使日益紧缺的中药材资源得到了更充分合理有效的利用，提高了产品的附加值，对于环境保护和废物资源化利用均具有重要意义。
图1为实施例1中中药渣粉的水提取物对黄曲霉As3.4408的生长及其合成黄曲
霉毒素的影响。图2实施例4的黄曲霉毒素吸附剂对黄曲霉毒素的体外吸附实验结果。图3实施例5中黄曲霉毒素吸附剂对饲料中黄曲霉As3.4408合成黄曲霉毒素的影响。图4实施例6中黄曲霉毒素吸附剂的饲养效果实验结果。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1通过平板抑菌实验考察中药渣粉的水提取物对黄曲霉As3.4408(现保藏在中国微生物菌种保藏中心，现用编号为CGMCC3.4408)生长的抑制效果，该实验研究过程的实验方法如下:(I)中药渣水提取物的制备:将板蓝根、鸡骨草和金银花水提取后的混合药渣Ikg(广药集团提供)于5L沸水中煮沸10分钟后，过滤，滤液经浓缩除去2/3的水分，再通过冷冻干燥升华剩余水分，获得中药渣水提取物。(2)制作含中药渣水提取物的PDA培养基:称取中药渣水提取物溶解于蒸馏水配制成溶液，然后用此溶液按常规方法配制含中药渣提取物的PDA固体培养基，灭菌后倒入灭菌平皿(直径9cm)，制成含中药渣提取物的PDA平板，用0.1g中药渣水提取物溶于IOOml蒸馏水得到的溶液制得的PDA平板标记为B，用Ig中药渣水提取物溶于IOOml蒸馏水得到的溶液制得的PDA平板标记为C。用蒸馏水按常规方法配制PDA固体培养基，灭菌后倒入灭菌平皿(直径9cm)，制成用于对比的PDA平板，标记为A。(3)接种培养:将黄曲霉As3.4408菌株转接于PDA斜面培养基，28°C恒温培养5d，用接种针无菌点接于含中药渣提取物的PDA平板及用于对比的PDA平板中央，28°C恒温培养4d，采用365nm紫外光照射下拍照观察，黄曲霉毒素在365nm紫外光下激发荧光，菌落周围荧光强弱(对应图片中菌落周围的白色光圈的亮度)反应出黄曲霉毒素浓度的高低。实验结果见图1，图中，与对比的PDA平板比较，含中药渣提取物的PDA平板接种培养后的菌落直径显著减小，而且，随着中药渣提取物浓度的提高，菌落直径及周围光圈亮度随之减小，表明中药渣粉的水提取物对黄曲霉As3.4408生长的抑制效果显著，即中药渣中含有可以有效抑制黄曲霉As3.4408生长的物质，从而使以其为原料制备的黄曲霉素吸附剂也具有抑制黄曲霉As3.4408生长的效果。实施例2黄曲霉毒素吸附剂的制备方法如下:
1.灭活乳酸菌制剂的制备方法如下:(I)菌种活化:将所需乳酸菌菌株嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌株分别接种IOOuL到IOmL MRS液体培养基(是一种常用的乳杆菌培养基，配方略)，37°C静置培养24h，得到活化后的乳酸菌菌株嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌株。(2)种子液制备:将活化后的乳酸菌菌株嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌株分别接种IOmL到IOOOmL MRS液体培养基，37°C静置培养16h，制备得到种子液。(3)发酵:分别转接用各种菌株制备的种子液500mL至装有IOL发酵培养基的14L发酵罐中，200转/分钟搅拌，37 0C，自动反馈控制添加10% NaOH调节pH为6.2，发酵24h，然后升温至80°C，保温15分钟，杀死乳酸菌活细胞，得到发酵液。发酵培养基的配方如下:
蛋白胨50g牛肉膏50g
酵母提取物50gK2HPO420g
乳清粉50gMgSO4 H2O2g
吐温80IOmL水IOL
pH6.8115°C灭菌，20min(4)发酵液的浓缩与干燥:采用旋转蒸发仪在70°C下将发酵液浓缩除去1/2的水分，用喷雾干燥机进行喷雾干燥，进风温度设定为170°C、物料温度60°C、压力l.0MPa，得到灭活乳酸菌制剂。2.将板蓝根、鸡骨草和金银花经过水提取后的混合药渣(来源于广药集团)干燥后粉碎，过80目筛得到中药渣粉(含水量12% )，称取8kg中药渣粉，加入嗜酸乳杆菌和灭活干酪乳杆菌制剂共2kg (质量比例为1:1)，混合均勻，使乳酸菌的含量为I X IOltl个细胞/g，混合均匀后得黄曲霉毒素吸附剂，记为吸附剂A。实施例3将板蓝根、鸡骨草和金银花水提取后的混合药渣(广药集团提供)干燥后粉碎，过60目筛后得到中药渣粉(含水量10% )，称取9kg中药渣粉，加入植物乳杆菌和灭活唾液乳杆菌菌粉Ikg (质量比例为1:1)，混合均勻，使乳酸菌的含量为I X IOltl个细胞/g，灭活唾液乳杆菌制剂按实施例2的制备方法制备，同时步骤(3)中升温至100°C，保温处理lOmin，其他制备条件不变；混合均匀后得黄曲霉毒素吸附剂，记为吸附剂B。实施例4对实施例2 3制备的黄曲霉毒素吸附剂对黄曲霉毒素的体外吸附效果进行实验分析。取两只IOml离心管,分别加入磷酸盐缓冲溶液(pH = 7.4) 5ml,再分别加入20mg实施例I制备的吸附剂A和20mg实施例2制备的吸附剂B，得到混合溶液，然后分别在混合溶液中加入黄曲霉毒素BI (FERMENTEK公司)使其终浓度为50ppb，制得黄曲霉毒素磷酸盐缓冲溶液，分别标记为A和B。采用不添加中药渣时的乳酸菌进行对照实验，即向5mL黄曲霉毒素磷酸盐缓冲溶液中添加嗜酸乳杆菌和灭活干酪乳杆菌菌粉Ig(质量比例为1: 1)，使其中的乳酸菌含量为2X IO9个细胞/mL，然后加入黄曲霉毒素BI (FERMENTEK公司)使其终浓度为50ppb，标记为AO ;再另取5mL黄曲霉毒素磷酸盐缓冲溶液，添加植物乳杆菌和灭活唾液乳杆菌菌粉Ig(质量比例为1: 1)，使其中的乳酸菌含量为2X109个细胞/mL，然后加入黄曲霉毒素BI (FERMENTEK公司)使其终浓度为50ppb，标记为BO ;每个样品设3个重复。将离心管在恒温振荡器上160rpm，37°C振荡60min，然后将离心管置高速离心机上于8000rpm，4°C离心lOmin，分别取上清液，采用国标法(GB/T18980-2003，免疫亲和层析高效液相色谱法)测定黄曲霉毒素BI含量。黄曲霉毒素吸附剂的吸附效能⑶计算方法如下:
D= (50X5-MXV) X 1000/20 (ng/g)注:M-上清液中黄曲霉毒素BI的浓度，ng/mlV-上清液总体积D-每g吸附剂干粉所吸附的黄曲霉毒素BI的量(ng)实验结果见图2，AO、B0、Al、BI 的 D 值分别为 38.4±7.3、33±3、39.2±6.2、
37.1±5.1，与用鸡日粮(D = 10.2±4.4)(即向含有黄曲霉毒素的磷酸盐缓冲溶液中添加日粮)进行的吸附试验相比较，AO、BO、A、B四种黄曲霉毒素吸附剂的对黄曲霉毒素的清除效果达到极显著水平(P < 0.001)。可见，添加本实验制备的黄曲霉毒素吸附剂，通过对黄曲霉毒素进行吸附，可以有效清除黄曲霉毒素。实施例5黄曲霉毒素吸附剂对饲料中黄曲霉As3.4408合成黄曲霉毒素的影响研究，方法如下:取5份鸡日粮，每一份lkg，其中I份不添加任何物质，作为对比，记为CK，取两份分别添加实施例1所得的吸附剂A，添加量为每kg饲料添加Ig和2g，混合均匀，得到Al (黄曲霉毒素吸附剂的添加量为0.1% )和A2(黄曲霉毒素吸附剂的添加量为0.2% );剩下两份每一份添加实施例2所得的吸附剂B，添加量分别为每kg饲料添加Ig和2g，混合均匀，得到BI (黄曲霉毒素吸附剂的添加量为0.1% )和B2(黄曲霉毒素吸附剂的添加量为0.2% );向以上5份鸡日粮中分别加水至含水量50 %，接种黄曲霉As3.4408，28°C恒温培养4d，采用国标法(GB/T18980-2003，免疫亲和层析高效液相色谱法)测定饲料中的黄曲霉毒素BI的含量。实验结果见图3。对照组CK，即空白日粮中黄曲霉毒素含量为4340.34± 1009.92 μ g/kg，A2试验组黄曲霉毒素含量为3400.9 ±490.29 μ g/kg，显著低于对照组(P < 0.001) ；B1和B2试验组黄曲霉毒素含量分别为3980.23±200.32 μ g/kg和3600.36±863.23μ g/kg，也显著低于对照组黄曲霉毒素含量水平(p < 0.05)。可见，黄曲霉毒素吸附剂对饲料中黄曲霉毒素BI生物合成的抑制效果是显著的，并且吸附剂用量越大，对黄曲霉毒素BI生物合成的抑制效果越显著。实施例6对黄曲霉毒素吸附剂的饲养效果进行实验研究，在受到黄曲霉毒素轻度污染的肉鸡日粮中添加实施例1制备的黄曲霉毒素吸附剂，添加量为0.2% (每kg日粮中添加2g黄曲霉毒素吸附剂)，得到添加吸附剂的饲料，用于对照的肉鸡日粮中不添加，为空白饲料。选用300只健康I日龄肉仔鸡(雌雄各半)，随机分为6个组，每组50只鸡。参考肉鸡营养需要进行常规饲养，3组喂养添加吸附剂的饲料，另外3组喂养空白饲料。试验周期21d，自由采食与饮水，常规免疫。第21d，每组随机挑选3只鸡，心脏采血后颈动脉放血处死，收集血清和肝脏，于-20°C保存备用。采用相关试剂盒(上海科兴商贸有限公司)测定肝脏有关酶活性指标，包括琥珀酸脱氢酶(SDH)和超氧化物歧化酶(SOD)。试验结束后，统计平均日增重、采食量、料重比和死亡率(方法见文献:按张辉华等，热灭活乳酸杆菌制剂对竹丝肉鸡生长性能的影响.黑龙江畜牧兽医，2005 (8):36-37)。实验结果见图4，其中，A图为黄曲霉毒素吸附剂对料重比和死亡率的影响，B为黄曲霉毒素吸附剂对SDH和SOD酶活力的影响。可知，投喂添加黄曲霉毒素吸附剂的饲料后，与投喂空白饲料的实验组比较，鸡肝脏SDH和SOD酶活力水平分别为9.11±1.lU/mg和399.98±87U/mg，酶活力水平均显著增加(p < 0.01);料重比为1.52±0.21，显著降低(投喂空白饲料的实验组为1.59±0.32) (p < 0.05)，死亡率3.23±0.37，显著降低(投喂空白饲料的实验组为4.56±0.4) (P < 0.01)。可见，在鸡日粮中添加黄曲霉毒素吸附剂，有利于提高饲料转化率，并能有效防止动物死亡。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种黄曲霉毒素吸附剂，其特征在于:这种吸附剂是由中药渣粉和乳酸菌混合制成。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素吸附剂，其特征在于:每IOOkg所述吸附剂中，中药渣粉的含量为50 90kg，乳酸菌的含量为IO14 IO16个细胞。
3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素吸附剂，其特征在于:所述中药渣粉的细度为60 200目，含水量6% 12%。
4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素吸附剂，其特征在于:所述中药渣粉为板蓝根、鸡骨草和金银花水浸提取后的药渣混合物。
5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素吸附剂，其特征在于:所述乳酸菌是乳酸菌和灭活乳酸菌制剂中的一种或两者的混合物。
6.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素吸附剂，其特征在于:所述乳酸菌是嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、短双歧杆菌和唾液乳杆菌中的一种以上。
7.根据权利要求5所述的黄曲霉毒素吸附剂，其特征在于:所述灭活乳酸菌制剂是将所述乳酸菌经70 100°C高温处理10 20min，得到灭活乳酸菌制剂。
8.根据权利要求1 7所述的黄曲霉毒素吸附剂的应用，其特征在于:所述黄曲霉毒素吸附剂用作饲料添加剂，应用于饲料贮藏阶段或养殖场。
全文摘要
本发明属于食品生物技术领域，公开一种黄曲霉毒素吸附剂及其应用，是一种能够在饲料贮藏过程中抑制黄曲霉毒素产生菌生长和黄曲霉毒素生物合成的饲料添加剂，为中药渣粉和乳酸菌的组合物。本发明提供的中药渣和乳酸菌的组合物，其中中药渣可有效抑制黄曲霉毒素生物合成，并可吸附饲料中的黄曲霉毒素随粪便排出体外，对动物内脏起到保护作用。同时由于利用了板蓝根、鸡骨草和金银花三种中药残留药效成分，使其具有清热祛湿之功效，尤其适合在南方养殖区域使用，可动物生长过程中起到抗应激、促进动物生长、保证动物健康及提高畜产品品质的功效。
文档编号A23K1/16GK103211098SQ20121001916
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者方祥, 李敏 申请人:广州翰海生物科技有限公司, 华南农业大学