专利名称：甜叶菊同源四倍体植株的培育方法
技术领域：
本发明涉及一种植物新品种的培育方法，具体来说是涉及一种糖料作物甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，属于生物技术育种领域。
背景技术：
甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)为双子叶植物纲菊科斯台维亚属多年生草本植物，原产南美巴拉圭阿曼拜山脉，当地居民把它作为甜茶饮用已经有一百年的历史，是一种新型的糖料作物。甜叶菊叶片中含有甜味成分甜菊糖苷，其甜度为蔗糖的250 300 倍，且无毒、高甜度、低热量、无副作用。甜叶菊具有较高的经济价值，于1976年在我国引种成功，近年来常规育种为甜叶菊品种改良做了较多试验，随着生物技术的发展，为品种改良和种质创新又增加了新的可行方法。如果能在离体快繁条件下利用诱变剂秋水仙素对甜叶菊进行同源四倍体诱导，不仅可提高产量和质 量，同时还创新了种质资源。植物染色体组多倍化是植物进化的一个重要标志。由二倍体诱导形成的同源四倍体具有器官巨大性、活性成分含量提高、抗逆性增强、育性降低等显著特征。自上世纪30 年代开始，我国在多倍体育种方面获得较大成功，如粮食作物小麦、黑麦、水稻；蔬菜作物萝卜、番茄、不结球白菜、茄子等；果树中的葡萄、猕猴桃、香蕉；药用植物中的百合、黄芩、枸
杞、桔梗、铁皮石斛等；经济作物亚麻、甜菜、烟草、牧草等，多倍体的应用非常广泛。关于甜叶菊多倍体诱导方面的研究仅1995年陈绍潘利用实生苗点滴法获得同源四倍体，易受外界影响。
发明内容
本发明的目的在于针对现有甜叶菊中甜菊糖苷含量低的问题，根据植物细胞染色体加倍后，其基因剂量倍增使植物的新陈代谢增强，染色体上基因调控的有效化学成分含量往往较二倍体高，同时多倍体植物具有器官巨大性的特征而提供一种甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，可短期内培育出有效成分(甜菊糖苷)含量较高的甜叶菊同源四倍体植株，以满足人们在食品和医药工业中对甜菊糖苷类甜味成分的需求。本发明以甜叶菊不定芽作为诱变材料，采用秋水仙素溶液与组织培养技术相结合的方法，进行多倍体诱导培养， 获得较高的诱导率并在短期内得到大量的四倍体组培苗。本发明甜叶菊同源四倍体植株的培育方法通过以下技术方案来实现甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，该方法利用浓度为0. 5g/L 2. Og/L的秋水仙素溶液浸泡甜叶菊不定芽12 48h，用无菌水清洗后接种在MS培养基中，培养20 30 天获得变异幼苗，再将幼苗接种到生根培养基中，待根长至2 3cm。上述方法具体包括以下步骤将不定芽浸泡在加入2% 二甲基亚砜的浓度为
0.5g/L 2. Og/L秋水仙素溶液中，处理12 48h，浸泡后的不定芽用无菌水冲洗3 4次， 吸干水接种到MS培养基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度23 25 °C的环境条件下培养20 30天，得到长3 4cm变异幼苗，将幼苗接种到生根培养基中进行生根培养，待根长至2 3cm。该方法所述的生根培养基的组成为1/2MS 培养基
萘乙酸(NAA)0 .05 0.10mg/L
吲哚乙酸(IBA)0.05 0.10mg/L
琼脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.5-5.8不定芽的获得包括以下步骤选取甜叶菊植株的嫩芽，灭菌后接种到诱导培养基中，培养温度23 25°C，每日光照12h，光照度1500 2000Lx，培养15 20天，诱导出不定芽。所述的灭菌方法是将甜叶菊植株的嫩芽先用洗衣粉洗净，再用流动的清水冲洗I 2h，用75%酒精浸泡30S，无菌水冲洗2 3次之后放入O. 10%的升汞溶液中浸泡5 8min，用无菌水冲洗3 4次。所述的诱导培养基的组成为MS培养基
6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.20 0.30mg/L
激动素(KT)0.10 0.20mg/L
萘乙酸(NAA)0.01 0.05mg/L
琼脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.5-5.8本发明甜叶菊同源四倍体植株的培育方法具体包括以下步骤A、不定芽的获得取甜叶菊植株的嫩芽，先用洗衣粉洗净再用流动的清水冲洗I 2h。用75%酒精浸泡30S，无菌水冲洗2 3次之后放入O. 10%的升汞溶液中浸泡5 8min，用无菌水冲洗3 4次，将灭菌后的嫩芽接种到下列诱导培养基中MS培养基
6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.20 0.30mg/L
激动素(KT)0.10 0.20mg/L
萘乙酸(NAA)0.01 0.05mg/L
琼脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.5-5.8
以日光灯为光源，光照度1500 2000LX，每天光照12h，温度(24±1) °〇的环境条件下培养15 20天，诱导出不定芽。B、甜叶菊同源四倍体诱导将不定芽浸泡在浓度为0. 5 2. Og/L秋水仙素溶液 (加入2%二甲基亚砜)中，处理12 48h，浸泡后的不定芽用无菌水冲洗3 4次，吸干水接种到MS培养基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度23 25°C的环境条件下培养20 30天，得到长3 4cm变异幼苗，将幼苗接种到以下生根培养基中进行生根培养1/2MS 培养基
萘乙酸(NAA)0.05 0.10mg/L
吲哚乙酸(IBA)0.05 0.10mg/L
琼脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.5-5.8培养室以日光灯为光源，光照度1500 2000LX，每天光照12h，温度23 25°C的环境条件下培养20 30天，待根长至2 3cm。将确定为四倍体的植株还可以扩繁移栽，具体包括以下步骤将确定为四倍体的植株切成茎段接种到上述诱导培养基内，待不定芽长至2 3cm，将其转入上述生根培养基中生根培养，苗高3 4cm，根长约2 3cm时进行炼苗移栽。所述的炼苗为打开瓶盖先在培养室炼苗2 3d，使嫩苗逐渐与外界接触，提高适应能力，再在温室中炼苗2 3d后洗净根部的培养基，栽到由泥炭蛭石珍珠岩=2 I I的基质中。甜叶菊同源四倍体植株炼苗移栽成活率达75%以上。本发明鉴定染色体数目为四倍体植株的方法如下根尖染色体计数待根长至2cm左右，切取约Icm的根尖用水洗净。按照以下步骤进行染色体鉴定。预处理0. 002mol/L8-羟基喹啉溶液10 20°C处理4 6h ;固定卡诺氏固定液(无水乙醇冰醋酸=3 1)4°C固定24h;前低渗0.075mol/LKCL浸泡20 30min ;解离lmol/LHCL60°C水浴中解离10 12min ;后低渗蒸馏水浸泡30min ;染色制片切取Imm根尖置于载玻片中央加卡宝品红I滴染色，IOmin后盖上盖玻片，压片镜检并拍照。统计甜叶菊染色体条数，染色体数目2n = 2X2x = 2X22 = 44为四倍体植株。流式细胞术鉴定法采集经根尖染色体技术确定为四倍体植株叶片3 4片叶片， 用滤纸吸干水，置于干净的玻璃培养皿中。加入0. 5mL预冷的组织解离液用锋利的刀片迅速将叶片切碎，200目尼龙网过滤，1000r/min离心5m in，漂洗3次。加入DAPI染液2. OmL， 室温下静置反应3min。用移液器吸出组织解离混合液，通过PARTEC流式细胞仪专用的过滤漏斗滤至上样管中。以二倍体植株为对照，调整GAIN值使峰值位于100处后，检测其他变异植株，峰值位于200处即为四倍体。图形中的横坐标表示NDA含量多少；纵坐标表示细胞数量。流式细胞术鉴定法中解离液和染液组 成如下(I)组织解离液Tris15mmol/LNa2EDTA 20 mmol/LKCl 80 mmol/LNaCl 20 mmol/L
TritonX-1000.1% (v/v)
β巯基乙醇 0.117% (v/v)pH 7. 5，_20°C保存 ，用时解冻并于4°C下临时保存⑵DAPI 染液1)PBS缓冲液的配制
NaCl 137mmol/L KCl 2.7mmol/L Na2HP04 4.3mmol/L
KH2PO4 IAmmolfLpH7. 2 74，0. 22 μ m滤膜过滤除菌后4°C保存2) DAPI染液的配制用70%乙醇配制DAPI贮存液，浓度为10 μ g/mL。用锡箔纸包好，于_20°C冻存。使用时用PBS缓冲液以I : 1000体积比稀释，最终浓度100ng/ml。注意DAPI有强烈致癌作用，操作时应戴上手套。与现有技术比较本发明的有益效果与常规诱变方法相比，离体条件下诱导多倍体不受季节等环境条件的影响，诱导条件容易控制；可反复大量地处理不定芽；所选材料幼嫩容易被秋水仙素影响，诱导率较高；用试管苗进行根尖染色体鉴定比大田中更方便，提高了工作效率。本发明在离体条件下以甜叶菊不定芽作为诱变材料，采用秋水仙素溶液与组织培养技术相结合的方法，进行多倍体诱导培养，结果表明，通过该方法获得较高的诱导率并在短期内得到大量的四倍体组培苗，获得的甜叶菊同源四倍体组培苗节间较二倍体短，叶色深，叶片大而厚，已初步体现了多倍体在形态学上得优势。而且，随着秋水仙素浓度升高和处理时间延长，死亡率(培养20 30d后不定芽变褐色即为死亡)和诱导率均增力口。经实验筛选用O. 5g/L 2. Og/L秋水仙素溶液浸泡不定芽12 48h,死亡率为10% 30%，多倍体诱导率为12% 32. 14%，为合适范围。而2. Og/L秋水仙素溶液处理12h的效果最好，诱导率为32. 14%，死亡率为30%。
图I为甜叶菊二倍体及同源四倍体植株根尖染色体数目镜检结果图。其中a为甜叶菊二倍体植株根尖染色体数目(2n = 2x = 22)b为甜叶菊同源四倍体植株根尖染色体数目(2n = 4x = 44)图中，显示甜叶菊二倍体及同源四倍体植株根尖染色体数目，采用根尖染色体计数，统计根尖细胞有丝分裂中期染色体数目。由图I可知甜叶菊二倍体植株(对照)根尖染色体数目2n = 2x = 22(a);甜叶菊同源四倍体植株根尖染色体数目为对照的2倍，即染色体数目2n = 2 X 2x = 2 X 22 = 44为四倍体植株(b)。图2为甜叶菊二倍体及同源四倍体植株叶片DNA含量图。其中，a为二倍体植株叶片DNA含量b为四倍体植株叶片DNA含量使用流式细胞仪采用流式细胞术鉴定法测变异植株倍性，以二倍体植株为对照，图形中的横坐标表示突光强度即DNA相对含量；纵坐标表示细胞数量。二倍体DNA相对含量在100处有一个单峰，变异植株DNA相对含量在200处有一个单峰，是对照的2倍，说明是四倍体。
具体实施例方式为了更好地说明本发明的实质内容，下面列出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于此。实施例I(I)不定芽的获得选取甜叶菊植株的健壮嫩芽，先用洗衣粉洗净再用流动的清水冲洗2h，用75%酒精浸泡30S，无菌水冲洗2 3次之后放入O. 10%的升汞溶液中浸泡5min，用无菌水冲洗3 4次，将灭菌后的嫩芽接种到下列诱导培养基中MS培养基
6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0.30mg/L 激动素(KT)0.20mg/L
萘乙酸(NAA)0.05mg/L
琼脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.8培养室以日光灯为光源，光照度1500LX，每天光照12h，温度(24±1)°C的环境条件下培养20天，诱导出大量不定芽。(2)甜叶菊同源四倍体诱导将不定芽浸泡在浓度为O. 5g/L秋水仙素溶液(加入2%二甲基亚砜)中，处理12 48h，每个处理浸泡30个不定芽。浸泡后的不定芽用无菌水冲洗3 4，滤纸吸干水接种到MS培养基中，在光照度1500LX，每天光照12h，温度(24 ± I) °C的环境条件下培养20天，得到长至3 4cm变异幼苗，将长至3 4cm的幼苗接种到以下生根培养基中进行生根培养1/2MS 培养基萘乙酸(NAA)0.10mg/L
吲哚乙酸(IBA)O.lOmg/L
琼脂6500mg/L
蔗糖30000mg/L
PH5.8 生根培养培养室以日光灯为光源，光照度1500LX，每天光照12h，温度23 25°C的环境条件下培养20天，待根长至2 3cm ;(3)根尖染色体计数切取约Icm的根尖用水洗净，按照以下步骤进行染色体鉴定。预处理0. 002mol/L8-羟基喹啉溶液15°C处理4h ;固定卡诺氏固定液(无水乙醇 冰醋酸=3 1)4°C 固定 12h ;前低渗:0. 075mol/LKCL 浸泡 20min ;解离lmol/LHCL60°C水浴中解离IOmin ;后低渗蒸馏水浸泡20min ;染色制片切取Imm根尖置于载玻片中央加卡宝品红I滴染色，IOmin后盖上盖玻片，压片镜检并拍照。统计甜叶菊染色体条数，染色体数目2n = 2X2x = 2X22 = 44为四倍体植株。(4)流式细胞术鉴定法采集经根尖染色体技术确定为四倍体植株叶片3-4片叶片，用滤纸吸干水，置于干净的玻璃培养皿中。加入0. 5mL预冷的组织解离液用锋利的刀片迅速将叶片切碎，200目尼龙网过滤，1000r/min离心5min，漂洗3次。加入DAPI染液2. OmL, 室温下静置反应3min。用移液器吸出组织解离混合液，通过PARTEC流式细胞仪专用的过滤漏斗滤至上样管中。图形中的横坐标表示NDA含量多少；纵坐标表示细胞数量。以二倍体植株为对照，调整GAIN值使峰值位于100处后，检测其他变异植株，峰值位于200处即为四倍体。(5)扩繁移栽将确定为四倍体的植株切成茎段接种到I步骤中的诱导不定芽培养基内。待不定芽长至2 3cm左右，将其转入生根培养基中生根培养，苗高3 4cm，根长约2 3cm时即可进行炼苗移栽。炼苗时打开瓶盖先在培养室炼苗2d，使嫩苗逐渐与外界接触，提高适应能力。然后在温室中炼苗3d后洗净根部的培养基栽到基质(泥炭蛭石 珍珠岩=2 : I : I)中。甜叶菊同源四倍体植株炼苗移栽成活率达85%。在此实例中处理不定芽120个，不定芽死亡率为10%，多倍体诱导率为12.00%， 共获得甜叶菊同源四倍体植株7株组培苗。实施例2(I)不定芽的获得选取甜叶菊植株的健壮嫩芽，先用洗衣粉洗净再用流动的清水冲洗I. 5h。用75%酒精浸泡30S，无菌水冲洗2 3次之后放入0. 10%的升汞溶液中浸泡6min，用无菌水冲洗3 4次。将灭菌后的茎段接种到诱导培养基:MS培养基+0. 2mg/ L6-BA+0. lmg/L KT+0. 01mg/LNAA+6500mg/L 琼脂+30000mg/L 蔗糖中，PH 5.6。培养室以日光灯为光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度(24±1) °C的环境条件下培养15 天，诱导出大量不定芽。(2)甜叶菊同源四倍体诱导将不定芽浸泡在浓度为I. Og/L秋水仙素溶液(力口入2%二甲基亚砜)中，处理12 48h，每个处理浸泡30个不定芽。浸泡后的不定芽用无菌水冲洗3 4次，滤纸吸干水接种到MS基本培养基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度(24 ± I) °C的环境条件下培养30天，得到变异幼苗。将长至3 4cm的幼苗接种到培养基 1/2MS 培养基 +0. 05mg/LNAA+0. 05mg/L IBA+6500mg/L 琼脂 +30000mg/L 蔗糖，PH5. 6中进行生根培养，生根培养培养室以日光灯为光源，光照度1500Lx，每天光照12h，温度23 25°C的环境条件下培养15天，待根长至2 3cm。
(3)根尖染色体计数切取约Icm的根尖用水洗净，按照以下步骤进行染色体鉴定。预处理0.002mol/L8-羟基喹啉溶液15°C处理5h ;固定卡诺氏固定液(无水乙醇冰醋酸=3 1)4°C 固定 24h ;前低渗0. 075mol/LKCL 浸泡 30min ;解离lmol/LHCL60°C水浴中解离12min ;后低渗蒸馏水浸泡30min ;染色制片切取Imm根尖置于载玻片中央加卡宝品红I滴染色，IOmin后盖上盖玻片，压片镜检并拍照。统计甜叶菊染色体条数，染色体数目2n = 2X2x = 2X22 = 44为四倍体植株。(4)流式细胞术鉴定法采集经根尖染色体技术确定为四倍体植株叶片3-4片叶片，用滤纸吸干水，置于干净的玻璃培养皿中。加入O. 5mL预冷的组织解离液用锋利的刀片迅速将叶片切碎，200目尼龙网过滤，1000r/min离心5min，漂洗3次。加入DAPI染液2. OmL,室温下静置反应3min。用移液器吸出组织解离混合液，通过PARTEC流式细胞仪专用的过滤漏斗滤至上样管中。图形中的横坐标表示NDA含量多少；纵坐标表示细胞数量。以二倍体植株为对照，调整GAIN值使峰值位于100处后，检测其他变异植株，峰值位于200处即为四倍体。(5)扩繁移栽将确定为四倍体的植株切成茎段接种到I步骤中的诱导不定芽培养基内。待不定芽长至2 3cm左右，将其转入生根培养基中生根培养，苗高3 4cm，根长约2 3cm时即可进行炼苗移栽。炼苗时打开瓶盖先在培养室炼苗3d，使嫩苗逐渐与外界接触，提高适应能力。然后在温室中炼苗3d后洗净根部的培养基栽到基质(泥炭蛭石珍珠岩=2 : I : I)中。甜叶菊同源四倍体植株炼苗移栽成活率达82%。在此实例中处理不定芽120个，不定芽死亡率为15%，多倍体诱导率为20. 00%，共获得甜叶菊同源四倍体植株15株组培苗。实施例3(I)不定芽的获得选取甜叶菊植株的健壮嫩芽，先用洗衣粉洗净再用流动的清水冲洗I 2h。用75%酒精浸泡30S，无菌水冲洗2 3次之后放入O. 10%的升汞溶液中浸泡5min，用无菌水冲洗3 4次。将灭菌后的茎段接种到下列诱导培养基MS培养基+0. 3mg/L6-BA+0. 2mg/L KT+0. 05mg/LNAA+6500mg/L 琼脂 +30000mg/L 蔗糖，PH 5. 8 诱导不定芽。培养室以日光灯为光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度(24±1)°C的环境条件下培养20天，诱导出大量不定芽。(2)甜叶菊同源四倍体诱导将不定芽浸泡在浓度为2. Og/L秋水仙素溶液(加入2%二甲基亚砜)中，处理12 48h，每个处理浸泡30个不定芽。浸泡后的不定芽用无菌水冲洗3 4，滤纸吸干水接种到MS基本培养基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度(24±1) °C的环境条件下培养30天，得到变异幼苗。将长至3 4cm的幼苗接种到培养基 1/2MS 培养基 +0. 10mg/LNAA+0. 10mg/LIBA+6500mg/L 琼脂 +30000mg/L 蔗糖，ΡΗ5· 8 中进行生根培养，生根培养培养室以日光灯为光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度23 25°C的环境条件下培养20天，待根长至2 3cm。(3)根尖染色体计数切取约Icm的根尖用水洗净，按照以下步骤进行染色体鉴定。预处理用对二氯苯饱和水溶液15°C处理6h ;固定卡诺氏固定液(无水乙醇冰醋酸=3 1)4°C 固定 18h ;前低渗:0. 075mol/L KCL 浸泡 30min ;解离lmol/L HCL60°C水浴中解离Ilmin ;后低渗蒸馏水浸泡30min ;染色制片切取Imm根尖置于载玻片中央加卡宝品红I滴染色，IOmin后盖上盖玻片，压片镜检并拍照。统计甜叶菊染色体条数，染色体数目 2n = 2X2x = 2X22 = 44为四倍体植株。(4)流式细胞术鉴定法采集经根尖染色体技术确定为四倍体植株叶片3-4片叶片，用滤纸吸干水，置于干净的玻璃培养皿中。加入0. 5mL预冷的组织解离液用锋利的刀片迅速将叶片切碎，200目尼龙网过滤，1000r/min离心5min，漂洗3次。加入DAPI染液2. OmL, 室温下静置反应3min。用移液器吸出组织解离混合液，通过PARTEC流式细胞仪专用的过滤漏斗滤至上样管中。图形中的横坐标表示NDA含量多少；纵坐标表示细胞数量。以二倍体植株为对照，调整GAIN值使峰值位于100处后，检测其他变异植株，峰值位于200处即为四倍体。(5)扩繁移栽将确定为四倍体的植株切成茎段接种到I步骤中的诱导不定芽培养基内。待不定芽长至2 3cm左右，将其转入生根培养基中生根培养，苗高3 4cm，根长约2 3cm时即可进行炼苗移栽。炼苗时打开瓶盖先在培养室炼苗3d，使嫩苗逐渐与外界接触，提高适应能力。然后在温室中炼苗3d后洗净根部的培养基栽到基质(泥炭蛭石 珍珠岩=2 I I)中，甜叶菊同源四倍体植株炼苗移栽成活率达80%。 在此实例中处理不定芽120个，不定芽死亡率为30%，多倍体的诱导率为 32. 14%，共获得甜叶菊同源四倍体植株26株组培苗。
权利要求
1.甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，其特征在于该方法利用浓度为0.5g/L 2. Og/ L的秋水仙素溶液浸泡甜叶菊不定芽12 48h，用无菌水清洗后接种在MS培养基中，培养 20 30天获得变异幼苗，再将幼苗接种到生根培养基中，待根长至2 3cm。
2.根据权利要求I所述的甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤将不定芽浸泡在含2%二甲基亚砜的浓度为0. 5g/L 2. Og/L秋水仙素溶液中，处理12 48h，浸泡后的不定芽用无菌水冲洗3 4次，吸干水接种到MS培养基中， 在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度23 25°C的环境条件下培养20 30天，得到长3 4cm变异幼苗，将幼苗接种到生根培养基中进行生根培养，待根长至2 3cm。
3.根据权利要求I或2所述的甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，其特征在于该方法所述的生根培养基的组成为1/2MS培养基 萘乙酸0.05 0.10mg/L吲哚乙酸0.05 0.10mg/L琼脂6500mg/L 。蔗糖30000mg/LPH5.5-5.8
4.根据权利要求I或2所述的甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，其特征在于不定芽的获得包括以下步骤取甜叶菊植株的嫩芽，灭菌后接种到诱导培养基中，培养温度23 25°C，每日光照12h，光照度1500 2000Lx，培养15 20天，诱导出不定芽。
5.根据权利要求4所述的甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，其特征在于所述的灭菌方法是将甜叶菊植株的嫩芽先用洗衣粉洗净，再用流动的清水冲洗I 2h，用75%酒精浸泡30S，无菌水冲洗2 3次之后放入0. 10%的升汞溶液中浸泡5 8min，用无菌水冲洗 3 4次。
6.根据权利要求4所述的甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，其特征在于所述的诱导培养基的组成为MS培养基6-苄基腺嘌呤0.20 0.30mg/L激动素0.10 0.20mg/L萘乙酸0.01 0.05mg/L琼脂6500mg/L 。蔗糖30000mg/LPH5.5-5.8
7.根据权利要求I所述的甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤A、不定芽的获得取甜叶菊植株的嫩芽，先用洗衣粉洗净再用流动的清水冲洗I 2h， 用75%酒精浸泡30S，无菌水冲洗2 3次之后放入0. 10%的升汞溶液中浸泡5 8min，用无菌水冲洗3 4次。将灭菌后的嫩芽接种到诱导培养基中，诱导培养基组分为 MS培养基6-苄基腺嘌呤0.20 0.30mg/L激动素0.10 0.20mg/L萘乙酸0.01 0.05mg/L 琼脂6500mg/L 蔗糖30000mg/L PH5.5-5.8 以日光灯为光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度23 25°C的环境条件下培养15 20天，诱导不定芽； B、甜叶菊同源四倍体诱导将不定芽浸泡在加入2%二甲基亚砜的浓度为O. 5 2. Og/L秋水仙素溶液中，处理12 48h,浸泡后的不定芽用无菌水冲洗3 4次,吸干水接种到MS培养基中，在光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度23 25 °C的环境条件下培养20 30天，得到长3 4cm变异幼苗，将幼苗接种到生根培养基中进行生根培养，生根培养基组分为 1/2MS培养基萘乙酸0.05 0.10mg/L吲哚乙酸0.05 0.10mg/L 琼脂6500mg/L 蔗糖30000mg/L PH5.5-5.8 生根培养以日光灯为光源，光照度1500 2000Lx，每天光照12h，温度23 25°C的环境条件下培养20 30天，待根长至2 3cm。
8.根据权利要求I所述的甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，其特征在于将确定为四倍体的植株扩繁移栽，具体包括以下步骤将确定为四倍体的植株切成茎段接种到权利要求6所述的诱导培养基内，待不定芽长至2 3cm，将其转入权利要求3所述的生根培养基中生根培养，苗高3 4cm，根长约2 3cm时进行炼苗移栽。
9.根据权利要求8所述的甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，其特征在于所述的炼苗为先在培养室炼苗2 3d，再在温室中炼苗2 3d后洗净根部的培养基，栽到由泥炭蛭石珍珠岩=2:1:1的基质中。
全文摘要
本发明公开了一种甜叶菊同源四倍体植株的培育方法，本发明方法在离体条件下以甜叶菊不定芽作为诱变材料，采用秋水仙素溶液与组织培养技术相结合的方法，进行四倍体诱导培养，通过该方法获得较高的诱导率并在短期内得到大量的四倍体组培苗，获得的甜叶菊同源四倍体组培苗节间较二倍体短，叶色深，叶片大而厚，已初步体现了多倍体在形态学上得优势。
文档编号A01H4/00GK102613085SQ20121010103
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者向增旭, 李红 申请人:南京农业大学