专利名称：醋糟基质栽培中菌根真菌与拮抗菌联用抗枯萎病的方法
技术领域：
本发 明涉及一种将菌根真菌及拮抗菌联用提高醋糟基质栽培作物抵抗土传病原真菌枯萎病的方法，属于资源利用领域、农业领域和生物农药领域。
背景技术：
设施栽培环境是ー种特殊的生态系统，其低温、高湿、弱光的特点为真菌病害的发生提供了适宜的环境条件。另外，由于受到条件限制，连作会造成土壤营养失衡，使得有益微生物种群下降，为土传病害的发生提供了稳定的栖息场所，有利于病原菌累积。虽然，无土栽培在一定程度上能缓解设施栽培环境下土壌的生态环境恶化问题，但仍然无法完全避免基质中作物根系受到有害微生物的侵染。这是因为一方面，病原微生物侵入基质的来源无法完全杜绝，如生产过程中的灌水、空气等的污染，以及作物轮作少，栽培管理中的人为污染都可能导致病原微生物的入侵。另ー方面，基质微生物区系缺少多祥性，如果ー种病原菌侵入基质，由于没有其它更多的微生物与之竞争和拮抗，病原菌会迅速在基质中稳定生长并引起严重病害。无土栽培分为无基质栽培和基质栽培两类。茄果类蔬菜采用基质栽培，常用的基质有草炭、锯末、稻壳、砂、陶粒、岩棉、珍珠岩和蛭石等。草炭和蛭石混合的基质栽培番茄和黄瓜类蔬菜效果很好
因此无土基质栽培虽然能在一定程度上缓解设施栽培环境下土壌的生态环境恶化问题，但其同样也存在着严重的连作障碍。目前对基质栽培连作障碍的根除，采取的常用办法是更换新的基质，这无疑会加重生产成本和工作量。虽然醋糟基质已经作为ー种优良的物质栽培基质而被广泛使用，但是已有的研究结果表明，醋糟基质连作2到3年虽然能仍保持较好的肥力，但连作2到3年的醋糟基质也开始出现真菌病害，使得其不得不更换，造成了很大的浪费。因此，如何抑制连作中醋糟基质的真菌病原病害，提高基质的利用率，已经成为目前亟待改进的ー个实际问题。菌根真菌是植物根围微生物区系最重要的成员之一，分布十分广泛，与农业生产关系密切。菌根真菌与植物根系建立最密切的互惠共生体的同时，能与其他根际微生物如细菌、放线菌、其他真菌、线虫等相互作用，从而影响土壤和植物的健康状況。越来越多的试验表明，菌根真菌真菌能够促进植物生长，改善植物健康状况，增强植物对生物和非生物胁迫的抗性。芽孢杆菌spp. JSB-I是ー株植物真菌病害拮抗菌。该菌对多种植物病原菌都具有明显的拮抗作用。因此，本发明针对醋糟基质连作中黄瓜枯萎病的发生，将菌根真菌和芽孢杆菌生防菌株联用同时接种于栽培作物的醋糟基质，提高作物对真菌病原枯萎病的抵抗能力，延长醋糟的使用寿命。
发明内容
本发明的目的在于针对醋糟基质连作栽培经常出现的真菌病原枯萎病的问题，通过在醋糟中添加菌根真菌和芽孢杆菌spp. JSB-1，从而提高作物对枯萎病的抵抗能力，抑制枯萎病的发生，延长醋糟的使用寿命。本发明的技术方案如下
菌根真菌及拮抗菌联用提高醋糟基质栽培抗黄瓜枯萎病的方法，按照下述步骤进行 一、抗性菌剂芽孢杆菌的制备
(1)配置固体平板酵母膏蛋白胨培养基，于30°C下培养对芽孢杆菌生防菌株进行活
化；
(2)将活化的菌体接种于含有2/5酵母膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，30°C、200rpm摇至对数期，取对数期菌液，7000 rpm离心lOmin，取沉淀，加水将细菌重悬浮液调成I X IO8CFU/ ml。ニ、菌根真菌菌剂的制备
(I)将菌根真菌67 OfiMZ1S i/7■无菌体系,用10 mM朽1檬酸钠溶液以I: 10 (v:
v)的体积混合溶解其中的植物凝胶，然后将提取其中的菌根真菌孢子。(2)将上步获得的真菌孢子，接种到泥沙为I :3 (v v)混合的灭菌的土壌中，浇水后播种玉米作为共生作物，覆土 100g，常规培养3个月后，获得大量的菌根真菌菌剂。三、菌根真菌及拮抗菌联用双接种连作的醋糟基质
(I)用质量比为2 1 1的新鲜醋糟蛭石草炭混合配置的育苗基质，进行常规穴盘育苗。(2)将上述步骤ー和ニ中分别制取得到的抗性菌剂芽孢杆菌和菌根真菌，分别按不同的比例添加到连作3年的醋糟基质中，其中菌根真菌按醋糟基质的质量比为3%添加，拮抗菌按保证醋糟中含有I X IO5CFU/ g的菌体密度添加，将添加的菌根真菌和拮抗菌与醋糟基质充分混匀。(3)待穴盘出苗长至4片真叶时，将小苗移栽至上述添加有菌根真菌和拮抗菌的醋糟基质中。其中步骤一中的(I)酵母膏蛋白胨培养基组成为酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/
I、NaCl 10 g/1，其余为水。其中步骤一中的(I)芽孢杆菌生防菌株为枯草芽孢杆菌汉subtilis JSBl0
本项目通过在连作出现枯萎病病菌的醋糟基质中添加菌根真菌和针对枯萎病的芽孢杆菌生防菌株，从而提高作物对枯萎病的抵抗能力，减少醋糟基质枯萎病孢子的数量，减轻作物枯萎病害的发生，延长醋糟的使用寿命，具有很强的实际应用价值。
具体实施例方式本发明所述产抗菌肽的枯草芽孢杆菌汉subtilis JSBl由江苏大学宁德刚老师赠送。菌根真菌Glomus in traradi ces购于比利时菌根真菌体外菌种保藏中心(Glomeromycota In vitro Collection, GINC0),并通过玉米盆栽进行扩增。(I)将保存在甘油中的芽抱杆菌菌种汉subtilis JSBl转接至酵母膏蛋白胨培养基(酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/1、NaCl 10 g/1)平板上，37°C培养24h。
(2)用牙签挑取活化好的单菌落，接种于含有IOOml酵母膏蛋白胨液体培养基(酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/l、NaCl 10 g/1)的250ml三角瓶中，30°C、200r/min摇至对数期，取对数期菌液，7000r/min离心lOmin，取沉淀，加无菌水将菌体重悬，用分光光度计将细菌悬浮液调成I X IO8CFU/ ml，待用。(3)将上述步骤制取得到的拮抗菌和菌根真菌，分别按不同的比例添加到连作3年的含有枯萎病病原菌的 醋糟中。这些醋糟由于连作障碍，已经使得作物显现出枯萎病病症,并通过微生物鉴定,证实含有枯萎病病原真菌。其中每1000 g醋糟基质添加30 g菌根真菌菌剂添加，拮抗菌按保证每g醋糟中含有I X IO5CFU拮抗微生物添加，将添加的菌根真菌和拮抗菌与醋糟基质充分混匀。 栽培数据证明，双接种菌根真菌Glomus in traradi ces和拮抗菌Baci Ilussubtilis JSBl于连作的醋糟后，黄瓜发病率显著降低，发病指数明显较小。与对照未接种的连作醋糟相比，黄瓜发病率分别下降了 70% ;植株的株高、叶面积、茎粗、茎节数都显著提高，与对照未接种菌株相比，株高增加了 4. 00%,叶面积增加了 8. 02%，茎粗增加4. 50%，茎节数增加了 5. 50%，同时黄瓜产量也増加了 10. 55%，醋糟中黄瓜枯萎病孢子数量减少了40%。
权利要求
1.菌根真菌及拮抗菌联用提高醋糟基质栽培抗黄瓜枯萎病的方法，其特征在于按照下述步骤进行 一、抗性菌剂芽孢杆菌的制备 (1)配置固体平板酵母膏蛋白胨培养基，于30°C下培养对芽孢杆菌生防菌株进行活化； (2)将活化的菌体接种于含有2/5酵母膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，30°C、200rpm摇至对数期，取对数期菌液，7000 rpm离心lOmin，取沉淀，加水将细菌重悬浮液调成IX IO8CFU/ ml ； 其中所述的酵母膏蛋白胨液体培养基组成如下酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/1、NaCl 10 g/1 ； ニ、菌根真菌菌剂的制备 (1)将菌根真菌67OfiMZ1S i/7■无菌体系,用10 mM朽1檬酸钠溶液以I: 10的体积混合溶解其中的植物凝胶，然后提取其中的菌根真菌孢子； (2)将上步获得的菌根真菌孢子，接种到按泥沙体积比为I:3混合的灭菌土壌中，浇水后播种玉米作为共生作物，覆土 100g，常规培养3个月后，获得大量的菌根真菌菌剂； 三、菌根真菌及拮抗菌联用双接种连作的醋糟基质 (1)用质量比为21 1的新鲜醋糟蛭石草炭混合配置的育苗基质，进行常规穴盘育苗； (2)将上述步骤ー和ニ中分别制取得到的抗性菌剂芽孢杆菌和菌根真菌，分别按不同的比例添加到连作3年的醋糟基质中，其中菌根真菌菌剂按醋糟基质的质量比为3%添加，拮抗菌按保证醋糟中含有I X IO5CFU/ g的菌体密度添加，将添加的菌根真菌和拮抗菌与醋糟基质充分混匀； (3)待穴盘出苗长至4片真叶时，将小苗移栽至上述添加有菌根真菌和拮抗菌的醋糟基质中。
2.根据权利要求I所述的菌根真菌及拮抗菌联用提高醋糟基质栽培抗黄瓜枯萎病的方法，其特征在于其中步骤一中的(I)酵母膏蛋白胨培养基组成为酵母提取物5 g/1、蛋白胨 10 g/l、NaCl 10 g/1，其余为水。
3.根据权利要求I所述的菌根真菌及拮抗菌联用提高醋糟基质栽培抗黄瓜枯萎病的方法，其特征在于其中步骤一中的(I)芽孢杆菌生防菌株为枯草芽孢杆菌ガ.SUbtilisJSBl。
全文摘要
本发明醋糟基质栽培中菌根真菌与拮抗菌联用抗枯萎病的方法，属于资源利用、农业领域和生物农药领域。将菌根真菌和发酵好的拮抗菌的菌液直接添加到无土栽培基质醋糟中，抑制了醋糟基质中病原菌的生长，降低了作物枯萎病的发生，能在一定程度上克服无土栽培基质连作障碍的发生，延长醋糟的使用寿命。此发明为无土栽培基质连作障碍的发生提供了解决方案，为延长固体废弃物资源的使用寿命提供了新的思路，具有重要的实际应用价值，符合国家可持续发展战略的要求。
文档编号A01G1/04GK102652487SQ20121014441
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者司春灿, 戴志聪, 曹丹鸣, 杜道林, 林英, 王明娜, 王莉莉, 肖翔 申请人:江苏大学