专利名称：一种砂梨多倍体的诱导方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种砂梨多倍体的诱导方法。
背景技术：
梨是我国传统的大众喜爱的水果，营养丰富，并且口感甚佳，性寒清热润肺，具有较高的食用价值和医疗价值。梨作为重要的木本经济果树，对气候和土壤的适应性广，抗逆性很强，在我国各个省区(海南省除外)都有种植。在植物分类学上，梨是蔷薇科(Rosaeeae)梨亚科(Maloldeae)梨属(Pyrus)植物,为乔本落叶果树。按照目前的分类，现在世界梨属植物有60个种，原产中国的有16种。在生产栽培上，梨可分为东方梨和西洋梨两大类。我国、日本及韩国等国家栽培的梨多属于东方梨，本发明中所选用的砂梨品种‘翠 冠’为东方梨的I个品种。由于梨童期长，自交不亲和，杂合程度高，进行常规杂交育种改良比较困难。但随着生物技术的飞速发展，通过组织培养可以筛选抗逆(抗寒、抗病、抗盐碱)的细胞突变体或者结合其他手段诱导多倍体，获得具有优良性状的品种或种质；对于梨育种工作来说，这项技术的发展和成熟能起到巨大的推动作用。多倍体培养成功的决定性因素之一是选择适宜的诱导方法。不同的物种、不同的材料诱导方法不一样，效果差异较大，因为不同的材料对处理方式的敏感性不一样，每一物种都有其最适染色体数目范围。目前梨得到多倍体植株的方法是在组织培养过程中，通过对梨叶片、茎段、种胚等组织培养材料通过化学诱变剂处理来获得多倍体，其中多用秋水仙素处理。但是外植体不同，适用的秋水仙素浓度也不同。多倍体培养成功的另一个重要因素是选择适宜的外植体。由于秋水仙素对正在分裂的细胞才发生作用，因此处理材料应为分裂旺盛的幼嫩组织，果树上多选用叶片，茎段等外植体，但因叶片对秋水仙素的毒害作用比较敏感，很难成活。理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，因此植物体的各个器官、组织、细胞及原生质体都可以作为外植体。但在实际组织培养过程中，需要对外植体进行选择，因为不同来源的外植体，在离体条件下对灭菌剂的敏感性不同；生长潜力不一样；细胞恢复分裂(即脱分化)的能力或愈伤组织再次分化(即再分化)的能力也有差异。如果选择不好，就很难获得培养的成功。因此，在进行植物组织培养时，必须选择合适的外植体，以确保组织培养工作的顺利进行。
发明内容
本发明的目的是提供一种砂梨多倍体诱导的方法，直接用组培苗单芽茎段作为外植体，取材简单方便。砂梨多倍体诱导的方法，通过如下步骤实现( I)在超净工作台上，将砂梨无菌试管苗剪去顶端，促进腋芽萌发，4-6d后将试管苗剪成带叶的单芽茎段；
(2)在遮光的情况下，将单芽茎段浸溃在经高压灭菌的0. 05% 0. 2%秋水仙素溶液中，然后在摇床上以120 140r/min震荡，处理40 50h，处理完毕后无菌水冲洗3次；(3)将浸溃处理后的单芽茎段转接到含有0. 002% 0. 003%秋水仙素的增殖培养基中，单芽茎段的腋芽要埋入含有0. 002% 0. 003%秋水仙素的增殖培养基中，使生长点与药液充分接触，叶片露出培养基，暗培养6-10d后转到光下培养，待处理的腋芽萌动抽茎长至I 2cm后继代到新鲜的培养基中；所述的增殖培养基l/2MS+6-BA2. 00 I. 50mg/L+IBA 0. 2 0. 4mg/L+GA3
I.0 3. Omg/L+蔗糖25 35g/L+琼脂5 7g/L，PH5. 8 ;增殖培养基中加入0. 002wt%
0.003wt%秋水仙素用于单芽茎段外植体的增殖培养；培养条件培养室温度25±1°C，光周期15 20h光照/6 IOh黑暗，相对湿度 40% 80% ；(4)在新鲜培养基上继代培养3 4次后，从中选择形态变异明显的植株进行鉴定，然后对鉴定为多倍体的植株进行扩繁；继代培养基l/2MS+6-BA2. 00 I. 50mg/L+IBA 0. 2 0. 4mg/L+GA3 I. 0
3.Omg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 5 7g/L，PH5. 8 ；培养条件培养室温度25±1°C,光周期为15 20h h光照/6 IOh黑暗,相对湿度40% 80%。所述的砂梨多倍体诱导的方法，优选通过如下步骤实现(I)在超净工作台上，将生长健壮的砂梨无菌试管苗剪去顶端，促进腋芽萌发，4-6d后将试管苗剪成带叶的单芽茎段；(2)在遮光的情况下，将单芽茎段浸溃在经高压灭菌的0. 1% 0. 2%秋水仙素溶液中，然后在摇床上以130 140r/min震荡，处理45 50h，处理完毕后无菌水冲洗3次；(3)将浸溃处理后的单芽茎段转接到含有0. 002% 0. 003%秋水仙素的增殖培养基中，单芽茎段的腋芽要埋入培养基中，使生长点与药液充分接触，叶片露出培养基，暗培养8d后转到光下培养，待处理的腋芽萌动抽茎长至I 2cm后继代到新鲜的继代培养基中；增殖培养基l/2MS+6-BAI. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂6g/L，PH5. 8 ;增殖培养基中加入0. 002wt% 0. 003wt%秋水仙素用于单芽茎段外植体的
增殖培养；培养条件培养室温度25± 1°C，光周期(光照/黑暗)为16h/8h，相对湿度40% 80%。(4)在新鲜继代培养基上继代培养3 4次后，从中选择形态变异明显的植株进行鉴定，然后对鉴定为多倍体的植株进行扩繁。继代培养基l/2MS+6-BAI. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L，PH5. 8 ；增殖培养条件培养室温度25± I °C,光周期(光照/黑暗)为16h/8h,相对湿度40% 80%。所述的砂梨优选‘翠冠’，‘翠冠’是我国南方重要早熟优质高产梨品种。该品种果形圆正，果皮细薄，色泽漂亮，果肉白色，细嫩松脆，无渣，汁多味甜；果心较小，其风味独特；且耐贮运，是符合出口标准深受海内外消费者喜爱的优良品种。本发明的有益效果是本发明针对砂梨的具体遗传学特征，采用特定浓度的化学诱变剂秋水仙素对其茎段进行处理，将保持遗传稳定性的组培苗单芽茎段诱导变异获得稳定的多倍体植株；本发明方法操作简单、成本低、诱导定向性好，诱导成功率高，为砂梨多倍体育种提供一种可行的新方法。
图I为二倍体与四倍体形态特征比较A为二倍体植株；B为四倍体植株；C为二倍体叶片山为四倍体叶片。图2为Flow cytometry分析不同倍性DNA的相对含量A. 二倍体；B.四倍体；C.混倍体图中，横坐标均表示相对荧光强度，纵坐标均表示细胞核数量。
具体实施例方式实施例I(I)取南京农业大学梨工程技术研究中心组培实验室培育出的砂梨品种‘翠冠’组培苗在超净工作台上，剪去其顶端茎尖，促进腋芽萌发，5d后剪成带叶的单芽茎段；(2)在遮光的情况下，将‘翠冠’单芽茎段浸溃在经高压灭菌的0. 1%秋水仙素溶液中，然后在摇床上以130r/min震荡，处理48h，处理完毕后无菌水冲洗3次；(3)将浸溃处理后的单芽茎段转接到含有0. 003wt%秋水仙素的增殖培养基中，单芽茎段的腋芽要埋入增殖培养基中，使生长点与药液充分接触，叶片露出培养基，暗培养6d后转到光下培养，待处理的腋芽萌动抽茎长至I 2cm后继代到新鲜的培养基中；增殖培养基l/2MS+6-BAI. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L，PH5. 8 ；培养条件培养室温度25 ± I °C，光周期(光照/黑暗)为16h/8h，相对湿度60 %。(4)在继代培养基上继代培养4次后，所得‘翠冠’变异组培苗与未处理的‘翠冠’组培苗发现其的外观形态有明显差异(图I )，变异植株相对粗壮，叶片较大，叶片颜色较深；然后对这些变异组培苗进行Flow cytometry倍性鉴定，结果显示，以二倍体为对照(图2，A)，变异苗中一些为四倍体(图2，B)，另一些为混倍体(图2，C)。继代培养基l/2MS+6-BAI. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. 0mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L，PH5. 8 ；培养条件培养室温度25 ± I °C，光周期(光照/黑暗)为16h/8h，相对湿度80 %。
权利要求
1.一种砂梨多倍体的诱导方法，其特征在于通过如下步骤实现 (1)在超净工作台上，将砂梨无菌试管苗剪去顶端，促进腋芽萌发，4-6d后将试管苗剪成带叶的单芽茎段； (2)在遮光的情况下，将单芽茎段浸溃在经高压灭菌的0.05% 0. 2%秋水仙素溶液中，然后在摇床上以120 140r/min震荡，处理40 50h，处理完毕后无菌水冲洗3次； (3)将浸溃处理后的单芽茎段转接到含有0.002% 0. 003%秋水仙素的增殖培养基中，单芽茎段的腋芽要埋入增殖培养基中，使生长点与药液充分接触，叶片露出培养基，暗培养6-10d后转到光下培养，待处理的腋芽萌动抽茎长至I 2cm后继代到新鮮的培养基中； 所述的增殖培养基l/2MS+6-BA 2. 00 I. 50mg/L+IBA 0. 2 0. 4mg/L+GA3 I. 0 3. Omg/L+ 蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 5 7g/L，PH5. 8 ； 培养条件培养室温度25±1°C，光周期15 20h光照/6 IOh黑暗，相対湿度40% 80% ； (4)在新鲜培养基上继代培养3 4次后，从中选择形态变异明显的植株进行鉴定，然后对鉴定为多倍体的植株进行扩繁； 继代培养基l/2MS+6-BA 2. 00 I. 50mg/L+IBA 0. 2 0. 4mg/L+GA3 I. 0 3. Omg/L+蔗糖 25 35g/L+ 琼脂 5 7g/L，PH5. 8 ； 培养条件培养室温度25±1°C，光周期为15 20h h光照/6 IOh黑暗，相対湿度40% 80%。
2.根据权利要求I所述的砂梨多倍体的诱导方法，其特征在于通过如下步骤实现 (1)在超净工作台上，将砂梨无菌试管苗剪去顶端，促进腋芽萌发，4-6d后将试管苗剪成带叶的单芽茎段； (2)在遮光的情况下，将单芽茎段浸溃在经高压灭菌的0.1% 0. 2%秋水仙素溶液中，然后在摇床上以130 140r/min震荡，处理45 50h，处理完毕后无菌水冲洗3次； (3)将浸溃处理后的单芽茎段转接到含有0.002% 0. 003%秋水仙素的增殖培养基中，单芽茎段的腋芽要埋入增殖培养基中，使生长点与药液充分接触，叶片露出培养基，暗培养8d后转到光下培养，待处理的腋芽萌动抽茎长至I 2cm后继代到新鮮的培养基中； 所述的增殖培养基l/2MS+6-BA I. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+琼脂 6g/L，PH5. 8 ； 培养条件培养室温度25±1°C，光周期16h光照/8h黑暗，相対湿度40% 80% ; (4)在新鲜培养基上继代培养3 4次后，从中选择形态变异明显的植株进行鉴定，然后对鉴定为多倍体的植株进行扩繁； 继代培养基l/2MS+6-BA I. 50mg/L+IBA 0. 3mg/L+GA3 2. Omg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 6g/L, PH5. 8 ； 培养条件培养室温度25±1°C，光周期为16h光照/8h黑暗，相対湿度40% 80%。
3.根据权利要求2所述的砂梨多倍体的诱导方法，其特征在于所述的砂梨为‘翠冠’。
全文摘要
本发明是一种砂梨多倍体的诱导方法。将砂梨(Pyrus pyrifolia)组培苗的单芽茎段用秋水仙素进行多倍体的诱变，诱变后进行分化培养及生根培养，并进行多倍体鉴定。本发明的方法具有诱导定向性好、成本低、操作简单的特点，为砂梨多倍体育种提供一种可行高效的新方法，对推进我国砂梨人工诱导多倍体技术具有重要的应用价值。
文档编号A01H4/00GK102763595SQ20121027796
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者吴俊 , 张绍铃, 薛亚男, 陶书田, 齐开杰 申请人:南京农业大学