专利名称：韭菜组织培养快繁的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及利用根外植体进行韭菜组织培养高效快繁的方法。
背景技术：
韭菜C477i應tuberosum Rottl. Ex Spreng)别名草钟乳、起阳草,属百合科葱属，是一种多年生的宿根草本植物，主要以叶片、假茎供食，具有一种特殊而且强烈的韭香气味，为我国特有的蔬菜品种。韭菜含丰富的维生素C、碳水化合物及硫、磷、铁等矿物质。 韭菜不仅营养丰富，而且具有多方面的保健功能，其独特的挥发性芳香物，可促进食欲；所含蒜素、硫化物对人体有兴奋作用，在肠道中具杀菌效果；富含的胡萝卜素，对夜盲症和皮肤粗裂有疗效；而膳食纤维能明显促进消化、预防癌症。韭菜的叶、根、种子均可入药，祖国医学认为韭菜性温、昧辛、入肝；可温中、下气、补虚、调和脾胃、益阳、散瘀、解毒。
韭菜种质资源丰富，栽培面积大，年产量高，在蔬菜生产和供应中占有很重要的位置，尤其是反季节韭菜，栽培面积逐年上升。随着栽培技术和人们生活水平的提高，韭菜的标准化生产及品质优化将越来越重要。现在韭菜的繁殖方法主要有两种一种是种子繁殖法，播种当年植株进行营养生长，第二年秋季才抽薹、开花、收获种子，但植株积累养分较少，种植时间短、分蘖少，收获种子量较少，3 4年进入植株旺盛生长期，采种量有所提高， 而五年后植株逐渐进入衰老期，抽薹减少、花序变小、产种量降低。第二种是分根繁殖法，即用韭菜的分蘖苗进行扩繁，韭菜单株平均年分蘖4 5个。一个新品种选育成功后，需要繁殖大量种子进行大面积生产，而上述两种方法的繁殖速度均比较缓慢，这就影响到新品种培育的速度和生产。因此，利用现代生物技术手段，在较短时间内繁殖大量材料，缩短优良品种的扩繁时间，获得优质高产的韭菜新品种，是育种的主要目标。
随着转基因育种技术的逐步发展和完善，葱蒜类植物的大蒜和洋葱等植物的遗传转化系统已经建立，而且还获得了抗虫的转基因植物。在韭菜方面，虽然有成功建立转化系统的报道，但是还没有成功转化的实例。而前述的葱蒜类植物的遗传转化均是采用农杆菌介导的方式取得成功，而该方法的建立需要高效的 再生系统作为前提，因此也需要进行韭菜的再生研究。目前在韭菜的组织培养研究中，通过茎尖、未成熟胚和未受精的子房均可进行韭菜的离体繁殖，但是效率不是很高。在根外植体研究方面，Shuto和张松等均通过根尖诱导愈伤组织，进而分化为植株，其后也有一些相关的报道，但是在激素配方的使用方面相差很大，研究结果不系统，可以看到丛生芽的照片，但是没有带有假茎的单个植株的照片。 因此进行再生体系的完善还需要进一步进行。
植物组织培养具有繁殖能力强、繁育速度快、生产周期短，重复性强，且周年循环生产，不受季节限制，节约繁殖材料、利于工厂化生产和自动化控制等特点。因此，研究韭菜的组织培养再生技术也非常必要。发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，完善组织培养相关因素，提供一种韭菜组织培养快繁的方法，采用该方法缩短韭菜优良品种的扩繁时间，加速了优良品种的推广，还可以得到无菌优质的韭菜幼苗，为丰产丰收和通过遗传转化进行品种改良奠定了基础。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明的韭菜组织培养高效快繁的方法，步骤如下(1)将韭菜种子冲洗干净，在75%乙醇中消毒30S，用无菌水冲洗3-5次，再在含O.1 %升萊和O.1 % Tween-20的混合溶液中消毒10 min,用无菌水冲洗3_5次,备用；(2)将消毒后种子接种在1/2MS固体培养基中培养，在24-26°C黑暗培养2天后，转移到24-26°C、光照度为1500-25001x、光照时间及周期为光照培养16h、黑暗培养8h的环境中培养5-7天，获得无菌胚根，经过7-10天培养，无菌胚根达到10_左右长；(3)在无菌条件下将(2)培养的无菌胚根切取1-2mm的胚根尖，接种到MS+ 2 mg/L 6-BA + I mg/L NAA的培养基上,诱导形成愈伤组织,培养温度、光照强度和光周期与(2)相同，培养13-15天，在相同培养基上转接一次，在相同条件下继续培养14-16天，愈·伤组织的直径达到5mm左右；(4)将(3)形成的愈伤组织转接到MS+1 mg/L 6-BA + O. 5 mg/L NAA + O. 5 mg/L KT 的培养基上，促进不定芽分化，在与(2)相同的培养条件下培养9-11天时可见明显的不定芽，28-30天不定芽生长至3cm左右高度；(5)将(4)培养的含不定芽的愈伤组织切成尽可能含较少芽体的小块，接种于MS+1 mg/L GA + O. 5 mg/L KT的培养基中，使不定芽伸长，培养温度、光照强度和光周期与(2)相同，培养20天后韭菜的芽体基部形成鳞茎，成为易于从愈伤组织分离的独立的韭菜苗；(6)将(5)培养的独立韭菜苗转移到1/2MS +0.2 mg/L IAA的生根培养基中培养生根，在24-26°C、光照度为1500-25001x、光照时间及周期为光照培养16h、黑暗培养8h的条件下，培养15-20天韭菜苗生根数达到5-7条，根长达到2cm左右；(7)将(6)培养的生根组培苗在20-25°C的组培环境中敞开瓶口炼苗2天后，移植到带盖的穴盘中，等植株完全成活后逐渐地移除穴盘的盖子，6-7天后可完全移除穴盘的盖子， 生长到IOcm左右高度可移栽到土壤中进行栽培。
所述的MS固体培养基配方包括MS基础配方的无机与有机营养成分、MS基础配方质量3%的蔗糖和O. 65%-0. 75%的琼脂粉。
所述的1/2 MS培养基即将MS基础配方的大量无机营养成分减半。
所述的各种激素的名称6_BA是6-节氨基嘌呤(6-benzylaminopurine), KT是激动素(Kinetin),NAA 是萘乙酸(Naplylene acetic acid),GA 是赤霉素(gibberellin), IAA 是口引哚乙酸(Indole-3-acetic acid)。
培养基配制后加入不同种类及比例的植物激素，用1.0 M NaOH调节pH到5.8， 121°C高压灭菌20 min，凝固后备用。
本发明的有益效果(I)本发明应用韭菜胚根作为外植体，不仅节约外植体得到的时间，而且形态一致，更重要的是愈伤组织诱导率得到很大提高。试验证明，从韭菜种子得到的胚根，胚根尖饱满、可以明显区分其分生组织，愈伤组织的诱导率达到80%以上，比现有技术采用根系根尖愈伤组织的诱导率提高了 20%以上；芽诱导率达到73%，比根系根尖提闻了 30%左右。
(2)本发明经过韭菜不定芽伸长这一过程，不定芽形成鳞茎的速度加快，进而形成独立植株，可以很明显与愈伤组织分离，取下独立的韭菜苗进行生根；而现有技术只进行到不定芽分化后，没有形成带有假茎的单独的不定芽，难以生根，只能将含有多个不定芽的愈伤组织块一起生根，这样不易获得独立的植株，因此，繁殖系数较低、成活率也低。本发明方法较现有技术的繁殖系数和成活率分别提高了 15%和10%以上。
(3)本发明将组培生根苗移栽到栽培基质时，先在组培环境中敞开瓶口炼苗两天， 再将其移植到可保持小环境湿度的带盖穴盘中，用6-7天的时间逐渐地移除穴盘的盖子， 使组培生根苗往大棚移栽的成活率较现有技术又提高了 12%以上。
(4)本发明也为韭菜进行遗传转化提供了更加完善的方法，通过一系列的分化过程，从愈伤组织分化出不定芽，经过伸长生长形成独立的植株，进而进行生根。前人所做的遗传转化研究存在这样的问题，转化后的愈伤组织形成丛生芽，但并不是所有的芽体都为转基因植株，生根过程可以进一步的筛选转化植株，丛生芽生根不能确定是否为真正的转化体，可能增加假阳性的比例，也可能遗失真正的转基因植株，通过形成单独植株进行生根就大大减少了这些现象。
具体实施方式
一种韭菜组织培养高效快繁的方法，首先按1/2 MS固体培养基配方称取各种试剂，制备成培养基母液，用1.OM NaOH溶液调节培养基母液的pH到5. 8，然后在121°C高压灭菌20 min，冷却凝固。取韭菜种子冲洗干净，在75%乙醇中消毒30 S，用无菌水冲洗3 次，再在O.1 %升萊和O.1 % Tween-20混合溶液中消毒10 min,用无菌水冲洗5次,然后将消毒后种子接种在上述培养基中培养，在24-26°C黑暗培养2天后，转移到24-26°C、光照度为1500-25001x、光照时间及周期为光照培养16h、黑暗培养8h的环境中培养5_7天，获得无菌胚根，继续培养7-10天、无菌胚根达到IOmm左右长。
按MS+ 2 mg/L 6-BA + I mg/L NAA的培养基配方称取各种试剂,制备成培养基母液，用1. OM NaOH溶液调节培养基母液的pH到5. 8，然后在121°C高压灭菌20 min，冷却凝固。在无菌条件下将无菌胚根切取1-2 mm的胚根尖，接种到按MS+ 2 mg/L 6-BA + I mg/L NAA的培养基 上，诱导形成愈伤组织，培养温度、光照强度和光周期同上，培养13-15天，在相同培养基上转接一次，在相同条件下继续培养14-16天，愈伤组织的直径达到5_左右。
按MS+1 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NM + O. 5 mg/L KT的培养基配方称取各种试剂， 制备成培养基母液，用1. OM NaOH溶液调节培养基母液的pH到5. 8，然后在121°C高压灭菌 20 min,冷却凝固。将愈伤组织转接到该培养基上，促进不定芽分化，培养条件同上，9-11天时可见明显的不定芽，28-30天不定芽可长至3 cm左右高。
按MS+1 mg/L GA + O. 5 mg/L KT的培养基配方称取各种试剂，制备成培养基母液，用1. OM NaOH溶液调节培养基母液的pH到5. 8，然后在121°C高压灭菌20 min，冷却凝固。将不定芽愈伤组织切成尽可能含较少芽体的小块，接种于该培养基上，使不定芽伸长， 培养条件同上，20天后成为独立的韭菜苗。
按1/2 MS +0.2 mg/L IAA的生根培养基配方称取各种试剂，制备成培养基母液， 用1. OM NaOH溶液调节培养基母液的pH到5. 8，然后在121°C高压灭菌20 min，冷却凝固。 将独立韭菜苗转接到该培养基上培养生根，培养条件同上，15-20天韭菜苗生根数达到5-7条,根长达到2cm左右。
将生根组培苗在20_25°C的组培环境中敞开瓶口炼苗2天后，移植到带盖的穴盘中，等植株完全成活后逐渐地移除穴盘的盖子，6-7天后可完全移除穴盘的盖子，生长到 IOcm左右可移栽到土壤中进行栽培。
按照本发明的韭菜组织培养快繁的方法，愈伤组织诱导率达到81. 4%，芽诱导率达到73. 3%。繁殖系数达到20以上，单株移栽的成活率 达到98%以上。
权利要求
1.韭菜组织培养高效快繁的方法，步骤如下 (1)将韭菜种子冲洗干净，在75%乙醇中消毒30S，用无菌水冲洗3-5次，再在含O.1%升萊和O.1 % Tween-20的混合溶液中消毒10 min,用无菌水冲洗3_5次,备用； (2)将消毒后种子接种在1/2MS固体培养基中培养，在24-26°C黑暗培养2天后，转移到24-26°C、光照度为1500-25001x、光照时间及周期为光照培养16h、黑暗培养8h的环境中培养5-7天，获得无菌胚根，经过7-10天培养，无菌胚根达到IOmm左右长； (3)在无菌条件下将(2)培养的无菌胚根切取1-2mm的胚根尖，接种到MS+ 2 mg/L6-BA + I mg/L NAA的培养基上,诱导形成愈伤组织,培养温度、光照强度和光周期与(2)相同，培养13-15天，在相同培养基上转接一次，在相同条件下继续培养14-16天，愈伤组织的直径达到5mm左右； (4)将(3)形成的愈伤组织转接到MS+1 mg/L 6-BA + O. 5 mg/L NAA + O. 5 mg/L KT的培养基上，促进不定芽分化，在与(2)相同的培养条件下培养9-11天时可见明显的不定芽，28-30天不定芽生长至3cm左右高度； (5)将(4)培养的含不定芽的愈伤组织切成尽可能含较少芽体的小块，接种于MS+1mg/L GA + O. 5 mg/L KT的培养基中，使不定芽伸长，培养温度、光照强度和光周期与(2)相同，培养20天后韭菜的芽体基部形成鳞茎，成为易于从愈伤组织分离的独立的韭菜苗； (6)将(5)培养的独立韭菜苗转移到1/2MS +0.2 mg/L IAA的生根培养基中培养生根，在24-26°C、光照度为1500-25001x、光照时间及周期为光照培养16h、黑暗培养8h的条件下，培养15-20天韭菜苗生根数达到5-7条，根长达到2cm左右； (7)将(6)培养的生根组培苗在20-25°C的组培环境中敞开瓶口炼苗2天后，移植到带盖的穴盘中，等植株完全成活后逐渐地移除穴盘的盖子，6-7天后可完全移除穴盘的盖子，生长到IOcm左右高度可移栽到土壤中进行栽培。
2.根据权利要求1所述的韭菜组织培养高效快繁的方法，其特征在于，所述的MS固体培养基配方包括MS基础配方的无机与有机营养成分、MS基础配方质量3%的蔗糖和O.65%-0. 75%的琼脂粉。
3.根据权利要求1所述的韭菜组织培养高效快繁的方法，其特征在于，所述的1/2MS培养基即将MS基础配方的大量无机营养成分减半。
4.根据权利要求1所述的韭菜组织培养高效快繁的方法，其特征在于，所述的6-BA 是 6-节氨基嘌呤(6-benzylaminopurine), KT 是激动素(Kinetin), NAA 是萘乙酸(Naplylene acetic acid), GA 是赤霉素(gibberellin), IAA 是卩引哚乙酸(Indole-3-acetic acid)。
5.根据权利要求1所述的韭菜组织培养高效快繁的方法，其特征在于，所述的培养基配制后加入不同种类及比例的植物激素，用1.0 M NaOH调节pH到5. 8，121 °C高压灭菌20min,冷却凝固。
全文摘要
本发明公开了韭菜组织培养快繁的方法，首先将消毒后种子接种在1/2MS固体培养基上，在一定条件下培养得无菌胚根，然后切取胚根尖，接种到MS+2mg/L6-BA+1mg/LNAA的培养基，诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织转接到MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.5mg/LKT培养基，促进不定芽分化，将带不定芽的愈伤组织切成尽可能含较少芽体的小块，接种于MS+1mg/LGA+0.5mg/LKT培养基上，使不定芽伸长成为独立的韭菜苗，最后将独立韭菜苗转接到1/2MS+0.2mg/LIAA培养基上培养生根，再经炼苗后移栽到土壤。本发明方法较现有技术愈伤组织的诱导率提高了20%以上，芽诱导率提高了30%以上，繁殖系数和成活率分别提高了15%和10%以上。缩短了品种扩繁时间，并为通过遗传转化进行品种改良奠定了基础。
文档编号A01H4/00GK103039360SQ20121055428
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者李梅兰, 高行英, 侯雷平, 王婷婷, 张学智 申请人:山西农业大学