专利名称：一种富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛹虫草液体发酵的新型培养基配方制作方法，特别是涉及一种富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方的制作方法，属生物制药生产技术领域。
背景技术：
蛹虫草{Cordcepsmi I i t a r i s )属子囊菌亚门(A s c o my c o t i n a )麦角菌科{Clavieipi t a e e u e )虫草属{Cordyce P s )，是与冬虫夏草同属的药用真菌，世界上天然资源分布数量很少。蛹虫草中的虫草素(3 ’ -脱氧腺苷)、虫草酸与虫草多糖具有抗菌消炎、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节和调节血脂血糖等显著作用，是其重要活性成分，目前虫草素、虫草酸与虫草多糖主要从天然或人工培养的虫草子实体中提取，然而虫草子实体产量有限，随着液体发酵技术的发展，通过液体发酵法培养药用真菌的优势逐步体现出来。采用液体培养法生产虫草菌丝体及发酵液，不仅周期短、条件简单、产量高，而且还可以通过优化生产条件提高其生物活性物质的产量， 方便目的组分的提取。因此，国内外一直致力于虫草菌丝体的人工培养，以缩短培养时间， 节约生产成本。目前国内市场上出现了较多的虫草菌丝体产品，多为液体深层发酵培养所得。
硒是人体必需的微量元素，缺硒会导致多种疾病的发生。目前，蛹虫草作为富集硒元素的载体，可通过菌丝细胞内物质代谢的转化将硒结合到大分子活性物质上，形成硒多糖和硒蛋白。硒多糖和硒蛋白既可作为免疫调节剂，又可作为防癌、抗病毒的保健品， 在清除活性氧自由基方面也有独特功能，从而可以使人体避免由氧自由基引起的如炎症、 衰老、肿瘤、免疫性损伤、某些药物毒性等100余种疾病。
在液体培养法生产虫草菌丝体及发酵液工艺中，培养基的配方十分关键。目前的富硒蛹虫草液体发酵配方大多模仿其它常规菌丝体发酵的配方，以牛肉膏、蛋白胨或普通酵母粉为氮源，以蔗糖、葡萄糖或大米为主要碳源，以亚硒酸钠为硒源，秋水仙素或链霉素为菌体生长促进剂，未考虑蛹虫草在液体发酵过程中对培养基的特殊营养要求，配方的组分缺乏针对性，致使菌丝体、发酵液中的胞外多糖及虫草素、虫草酸等有效组分含量不高， 生产成本上升。事实上,在富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵过程中，牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、葡萄糖或大米等氮碳源不仅价格偏高，而且不是最的适氮碳源，亚硒酸钠为无机硒源，不仅不易为菌丝体吸收，也有一定毒性，秋水仙素或链霉素会导致菌体畸形率上升，因此必须设计制作一种有针对性的、价廉效高的富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方。
蚕茧工业中大量的茧衣茧壳作为弃物未能利用，其中丰富的茧丝胶蛋白是蛹虫草生长的良好氮源，其效果远超蛋白胨。蛹虫草的子实体培养也多在家蚕蛹上生长，来源于蚕茧的茧丝胶蛋白对蛹虫草的菌丝体生长也特别有适应性。同时从天然有色茧中获得的茧丝胶蛋白富含黄酮类和胡萝卜素类微量因子，来源于桑叶或蚕体内自身合成，无毒无害，具有良好的抗菌性、抗氧化活性。
富硒酵母，它在起到传统氮源的作用同时，还作为硒源进入培养基。在传统的富硒蛹虫草菌丝体的培养过程中，一般是在培养基中加入无机硒亚硒酸钠，经菌丝体吸收后转化为有机硒，这种方式不仅不易为菌丝体吸收，亚硒酸钠对菌丝体还有一定毒性，有很大缺陷。而富硒酵母携带的硒元素是有机硒的形态，更容易为菌丝体吸收，又避免了亚硒酸钠产生的毒性，有良好的优势。
蛹虫草菌丝体发酵过程中在细胞内外同时产生虫草多糖，而少量的香菇多糖在培养基中作为一种真菌多糖，会诱发促进虫草多糖和虫草酸形成，同时也可促使菌丝体生物量的提高。同时培养基中如添加了少量腺苷，因为腺苷为虫草素合成的前体，在培养基中会有明显促进虫草素产生的作用。发明内容
本发明的目的，就是设计出一种以天然彩色蚕茧丝胶蛋白和富硒酵母为主要氮源，以大米、山药、马铃薯、小麦、小米、玉米混合粗粮为主要碳源，富硒酵母中的有机硒为硒源，以香菇多糖和腺苷为激发因子，并辅以其它微量因子制作而成富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方。
现介绍一种富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方的制作方法如下1.天然彩色蚕茧丝胶蛋白的制取将烘干的天然彩色茧的茧衣、茧壳粉碎为1-3_大小的碎片，然后量取原料质量20-50倍的蒸馏水，加入Na2CO3 ’配成浓度为O. 1-0. 6%的 Na2CO3溶液，将茧衣、茧壳原料碎片浸溃于溶液中，在常压下煮沸后维持20-60min，使茧衣茧壳中的丝胶蛋白洗脱到溶液中，停止加热，溶液冷却至常温；用稀盐酸把丝胶溶液的P H 值调到中性后，渐渐加入10-20%的Ca (OH)2溶液，直至丝胶蛋白沉淀出现；将丝胶蛋白沉淀分离后置于-20 °C冰箱中，待冷冻后直接进行真空干燥，获得干燥的丝胶蛋白，粉碎至 100-200目，即得到富含黄酮类及胡萝卜素类成分的彩色茧丝胶蛋白；2.富硒酵母的选用选择市场供应的富硒酵母，硒含量在1000-2500mg/kg之间；3.碳源组分原料的制备将大米、小米、小麦、玉米、马铃薯、山药6种粗粮以相同的质量比混合，粉碎至50-100目，备用；4.香菇多糖的提取制备先将干燥香菇去柄，子实体磨成50-100目的粉末，加入香菇粉质量10-40倍的蒸馏水，在80-90°C水浴中加热2-5h，冷却至常温后过滤，收集滤液，将其蒸发浓缩到原来体积的1/20 - 1/5， 加入浓缩液体积2-4倍的95%乙醇， 沉淀多糖，离·心去除上清液，将沉淀真空干燥至恒重，即得香菇水溶性粗多糖；5.富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方为(各组分均为质量百分比):彩色茧丝胶蛋白1. 0-2. 5%，富硒酵母O. 8-1. 5%，复合粗粮碳源组分原料2. 5-5. 0%，香菇水溶性粗多糖 O. 5-1. 8%, KH2PO4 O. 1-0. 3%,MgSO4 O. 02-0. 06%,腺苷O. 01-0. 05%，维生素B1O. 01-0. 03%,最后加蒸馏水补充到 100%，调P H 6. 2-7. 1，121°C灭菌10_15min冷却后即可接入蛹虫草种子液进行发酵。
本发明的主要优点为1.利用蛹虫草对蚕蛋白特有的适应性，以天然彩色蚕茧衣壳中提取的茧丝胶蛋白替代了传统的牛肉膏及蛋白胨等原料，既有效地回收利用了废弃茧衣茧壳，使氮源成本大幅度下降，又使培养基中的氮源组分更为合理。同时，天然彩色蚕茧丝胶蛋白中的黄酮类和胡萝卜素类等微量因子，使氮源具备了良好的抗杂菌性、抗氧化活性，使发酵过程不易被杂菌污染。
2.培养基中的富硒酵母在起到补充氮源的作用同时，还是硒的来源。传统的富硒蛹虫草菌丝体在形成过程中，硒的来源是无机态的亚硒酸钠，发酵时要将培养基中的无机硒吸收后转化为有机硒，这个过程中硒不仅不易为菌丝体所吸收，而且亚硒酸钠在培养基中也有一定毒性。而富硒酵母携带的硒元素是有机硒的形态，不含任何毒性，又更容易为菌丝体吸收，通过蛹虫草菌丝细胞内物质的代谢，将底物中的硒结合到大分子上转化为有机硒多糖和硒蛋白，从而发挥硒和蛹虫草固有的协同生理作用。
3.本发明中的碳源材料为大米、小米、小麦、玉米、马铃薯、山药等粗粮混合物。因为粗粮中丰富的维生素及其它微量因子促进了代谢的良好进行，将这些粗粮复配后使用， 既保证了主要碳源淀粉的提供，又使多种微量因子互为补充，充分满足了发酵的需要，而且成本远低于葡萄糖和蔗糖等常规碳源。
4.两种外源添加物香菇多糖和腺苷的加入可显著促进富硒蛹虫草菌丝体的代谢生长，并大大提高虫草多糖、虫草酸、虫草素等活性物质的产出量。少量的香菇多糖在培养基中作为一种真菌多糖，会诱发促进虫草多糖和虫草酸形成，同时也可促使菌丝体生物量的提高。因为腺苷为虫草素合成的前体，在培养基中有明显促进虫草素产生的作用，添加了少量腺苷，对虫草素的合成有关键促进作用。
具体实施方式
将烘干的天然彩色茧的茧衣、茧壳粉碎为l_3mm大小的碎片，然后量取原料质量 30倍的蒸馏水，加入Na2CO3配成浓度为O. 3%的Na2CO3溶液，将茧衣、茧壳原料碎片浸溃于溶液中，在常压下煮沸后维持40min，停止加热，使溶液冷却至常温。用稀盐酸把丝胶溶液的P H值调到中性后，渐渐加入15%的Ca (OH)2溶液直至丝胶蛋白沉淀出现。将丝胶蛋白沉淀分离后置于-20 °C冰箱中，待冷冻后直接进行真空干燥，获得干燥的丝胶蛋白，粉碎至200目，得到富含黄酮类及胡萝卜素类成分的彩色茧丝胶蛋白。
选择硒含量为2000mg/kg的市售富硒酵母作为辅助氮源和有机硒源，备用。
将大米、小米、小麦、玉米、马铃薯、山药6种粗粮以相同的质量比混合，粉碎至50 目，备用。
将干燥香菇去柄后子实体磨成50目的粉末，加入香菇粉质量20倍的蒸馏水，在 90°C水浴中加热3h，冷却至常温后过滤，收集滤液，将其蒸发浓缩到原来体积的1/10， 加入浓缩液体积3倍的95%乙醇，沉淀多糖，离心去除上清液，将沉淀真空干燥至恒重，即得香菇水溶性粗多糖。
富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方为(各组分均为质量百分比)彩色茧丝胶蛋白1. 5%，富硒酵母1. 0%，复合粗粮碳源组分原料3. 0%，香菇水溶性粗 多糖1. 2%，KH2PO4 O. 2%, MgSO4 O. 03%，腺苷O. 02%，维生素B1O. 01%，最后加蒸馏水补充到100%，调p H 6.6， 121°C灭菌IOmin冷却后即可接入蛹虫草种子液进行发酵。
权利要求
1.一种富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方的制作方法，其特征是 1)天然彩色蚕茧丝胶蛋白的制取将烘干的天然彩色茧的茧衣、茧壳粉碎为1-3_大小的碎片，然后量取原料质量20-50倍的蒸馏水，加入Na2CO3 ’配成浓度为O. 1-0. 6%的Na2CO3溶液，将茧衣、茧壳原料碎片浸溃于溶液中，在常压下煮沸后维持20-60min，使茧衣茧壳中的丝胶蛋白洗脱到溶液中，停止加热，溶液冷却至常温；用稀盐酸把丝胶溶液的P H值调到中性后，渐渐加入10-20%的Ca (OH)2溶液，直至丝胶蛋白沉淀出现；将丝胶蛋白沉淀分离后置于-20 °C冰箱中，待冷冻后直接进行真空干燥，获得干燥的丝胶蛋白，粉碎至100-200目，即得到富含黄酮类及胡萝卜素类成分的彩色茧丝胶蛋白； 2)富硒酵母的选用选择市场供应的富硒酵母，硒含量在1000-2500mg/kg之间； 3)碳源组分原料的制备将大米、小米、小麦、玉米、马铃薯、山药6种粗粮以相同的质量比混合，粉碎至50-100目，备用； 4)香菇多糖的提取制备先将干燥香菇去柄，子实体磨成50-100目的粉末，加入香菇粉质量10-40倍的蒸馏水，在80-90°C水浴中加热2-5h，冷却至常温后过滤，收集滤液，将其蒸发浓缩到原来体积的1/20 - 1/5，加入浓缩液体积2-4倍的95%乙醇，沉淀多糖，离心去除上清液，将沉淀真空干燥至恒重，即得香菇水溶性粗多糖； 5)富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方为(各组分均为质量百分比):彩色茧丝胶蛋白1. 0-2. 5%，富硒酵母O. 8-1. 5%，复合粗粮碳源组分原料2. 5-5. 0%，香菇水溶性粗多O.5-1. 8%, KH2PO4 O. 1-0. 3%, MgSO4 O. 02-0. 06%,腺苷O. 01-0. 05%，维生素B1O. 01-0. 03%,最后加蒸馏水补充到100%，调P H 6. 2-7. 1，121°C灭菌10_15min冷却后即可接入蛹虫草种子液进行发酵。
全文摘要
本发明一种富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方的制作方法，设计出一种以天然彩色蚕茧丝胶蛋白和富硒酵母为主要氮源，以大米、山药、马铃薯、小麦、小米、玉米混合粗粮为主要碳源，富硒酵母中的有机硒为硒源，以香菇多糖和腺苷为激发因子，并辅以其它微量因子制作而成富硒蛹虫草的液体菌丝体发酵培养基配方。本发明既有效地回收利用了废弃茧衣茧壳，使氮源成本大幅度下降，又使培养基中的氮源具备了良好的抗杂菌性、抗氧化活性，使发酵过程不易被杂菌污染。培养基中的富硒酵母在起到补充氮源的作用同时，还是硒的来源。香菇多糖和腺苷的加入可显著促进富硒蛹虫草菌丝体的代谢生长，并大大提高虫草多糖、虫草酸、虫草素等活性物质的产出量。
文档编号C05G1/00GK103030452SQ20131001733
公开日2013年4月10日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者李卫旗, 丁农, 袁康 申请人:李卫旗