冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基及其发酵生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基及其发酵生产方法，以从青藏高原采收的冬虫夏草制作母种，将母种植入三角瓶中进行摇床培养，制备液体菌种，然后接入各级种子罐中进行发酵培养，逐级放大，最后在发酵罐中实现冬虫夏草的大规模液体深层发酵，最终发酵罐体积达到5吨或更多，菌丝体干重达5-15%。本发明采用优质的冬虫夏草菌种、专用培养基和专用发酵工艺，实现了促进冬虫夏草菌体生长、缩短工期、减少污染机会、节约能源、降低成本的目的。
【专利说明】冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基及其发酵生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食药用真菌发酵生产【技术领域】，尤其涉及一种冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基及其发酵生产方法。
【背景技术】
[0002]冬虫夏草属于麦角菌科的真菌种类(拉丁学名是Cordyceps sinensis,也写作Ophiocordyceps sinensis),又叫中国被毛孢或者中华被毛孢。冬虫夏草在中国民间具有长期的应用历史，是高级、名贵的中草药滋补品，它的保健和医疗作用在《本草从新》和《中华人民共和国药典》中都有记录。冬虫夏草分布在青海、西藏等青藏高原高海拔的寒冷地区，主产于金沙江、澜沧江、怒江三江流域的上游。由于过量采挖和环境破坏，野生的冬虫夏草资源锐减，满足不了市场需要。
[0003]通过液体深层发酵可以大量生产冬虫夏草菌丝，科学家研究发现冬虫夏草发酵菌丝的化学成分和药理作用与野生冬虫夏草类似，因此发酵生产的冬虫夏草菌丝成为了野生冬虫夏草的重要替代品。目前国内一些科研工作者发表了一些相关专利和论文，公开了一些冬虫夏草液体发酵的培养基和培养工艺，但是普遍存在发酵周期长、容易污染、步骤繁琐、能源消耗大、菌丝体产率不高的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基及其发酵生产方法，发酵周期短、不易污染、步骤简单、能源消耗少、菌丝体产率高。
[0005]本发明提供的冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基，其各成分重量比例为:` 1.50-4.00%碳源，碳源为葡萄糖或蔗糖或麦芽糖，0.50-2.00%氮源，氮源为酵母膏或牛肉膏或蛋白胨，0.05-0.15%硫酸镁，0.10%-0.20磷酸二氢钾，0.05-0.10%复合维生素，
1.00-2.00%琼脂粉，其余为水分；
将上述物料加热至100°C，使物料溶解、混匀，121°C下0.15MPa压力下灭菌30-50分钟，冷却降至室温凝固后即可使用。
[0006]用于摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养的液体培养基成分一致，培养基配方如下:各成分重量比例为2.00-6.00%碳源，碳源为葡萄糖或蔗糖或麦芽糖，1.00-3.00%氮源，氮源为酵母膏或牛肉膏或蛋白胨，0.08-0.20%复合维生素，其余为水分；
将上述物料加热至100°C，使物料溶解、混匀，121°C下0.15MPa压力下灭菌30-50分钟，冷却降至室温即可使用。
[0007]上述的复合维生素由维生素B1、维生素B2、核黄素组成，重量比例为1:1:1或2:2:1。
[0008]本发明提供的利用冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基的发酵生产方法，其特征在于:
(I)母种制作:从冬虫夏草产区采收新鲜冬虫夏草，从虫子致密组织上取直径0.5-lcm的组织分离新菌种到固体培养基中，培养25-30天得母种；
(2)摇瓶培养:用接种针将母种接种到摇瓶中的液体培养基中，摇床转速100-200rpm，培养8-10天，菌丝体浓度为30%，准备上种子罐；
(3)种子罐培养:按照2-5%的接种量将摇瓶培养的液体菌种接种到种子罐中的液体培养基中，种子罐搅拌速度100-180rpm，罐压0.05-0.1OMpa,空气流量0.60-1.80L/min,培养6-8天得种子罐液体菌种，准备上发酵罐；
(4)发酵罐培养:按照4-10%的接种量把摇瓶培养的液体菌种接种到发酵罐中的液体培养基中，搅拌速度100-250rpm，罐压0.05-0.20Mpa,空气流量0.80-2.0OL/min,培养8-10天得发酵产物。
[0009]本发明提供的虫夏草规模化液体深层发酵发酵用培养基的发酵生产方法，在摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养的菌种接入培养基中，PH值为5.0-8.0，温度为10-20°C。
[0010]根据本发明对冬虫夏草发酵过程中对营养物质和氧气要求变化的研究，在种子罐培养和发酵罐培养过程中，发酵前期、中期、后期采用不同的搅拌速度、罐压和空气流量，一般前期和后期参数较低，中期参数较高，从而达到了增加菌丝体产量、缩短发酵时间、减少污染机会、降低能耗的目的。
[0011]本发明的积极效果:发酵周期短、不易污染、步骤简单、能源消耗少、菌丝体产率闻。 【具体实施方式】
[0012]下面结合实例，对 本发明所涉及的方法作进一步说明。
[0013]实施例1 (I)母种制备
母种制备的固体培养基各成分重量比例为:3%碳源(按分子量计算获得碳元素含量)，碳源为葡萄糖或蔗糖或麦芽糖，2%氮源(测定获得氮元素含量)，氮源为酵母膏或牛肉膏或蛋白胨；0.1%硫酸镁，0.15%磷酸二氢钾，0.08%复合维生素，1.00%琼脂粉，其余为水分。复合维生素由维生素B1、维生素B2、核黄素组成，重量比例为1:1:1或2:2:1 ；
将上述物料混合，加热至100°C，使物料溶解、混匀，121°C下0.15MPa压力下灭菌40分钟，冷却至室温凝固。
[0014]在青藏高原冬虫夏草产区采收新鲜的冬虫夏草(拉丁学名Cordyceps sinensis,也写作Ophiocordyceps sinensis),以虫子粗壮、虫草芽较小的早期草为最佳,在试管斜面上进行常规组织分离，从虫子致密组织上取直径0.5-lcm的虫子组织接到斜面上固体培养基中，培养25-30天，获得生长状态旺盛的母种。
[0015](2)摇瓶培养
摇瓶培养用培养基各成分重量比例为:5.00%碳源(碳源为葡萄糖或蔗糖或麦芽糖)，
3.00%氮源(氮源为酵母膏或牛肉膏或蛋白胨)，0.20%复合维生素(其中包含维生素B1、B2和核黄素，重量比例为2:2:1)，其余为水分。将上述物料混合，加热至100°C，使物料溶解、混匀，121°C下0.15MPa压力下灭菌40分钟，冷却至室温凝固。
[0016]用1000ml大三角瓶培养，培养基装液量200-300ml，接入直径Icm的母种菌块，用NaOH和HCl调节pH至5.0-8.0，在10_20°C、摇床转速100-200rpm条件下，培养8_10天，菌丝体浓度为30%，准备上种子罐。
[0017](3)种子罐培养
各级种子罐培养基成分、配比及配置方法，同摇瓶培养。
[0018]一级种子罐容量50L，培养基装液量30-40L，按照2%的接种量比例接入，控制pH值5.0-8.0,在10-20 °C下培养10天。其中第1-3天搅拌速度100_150rpm，罐压 0.05-0.08Mpa,空气流量 0.60-1.0OL/min ;第 4-8 天搅拌速度 120_180rpm，罐压 0.06-0.1OMpa,空气流量 0.80-1.80L/min ；第 9-10 天搅拌速度 100_150rpm，罐压
0.05-0.08Mpa,空气流量 0.60-1.0OL/min。
[0019]二级种子罐容量500L，装液量300-400L，接种量比例及发酵参数与一级种子罐相同。
[0020](4)发酵罐培养
发酵罐培养基成分、配比及配置方法，同摇瓶培养。
[0021]发酵罐容量5吨，培养基装液量3-4吨，按照5%接种量比例接入，控制pH值
5.0-8.0，在10-20°C下培养8天。其中第1-2天搅拌速度100_150rpm，罐压0.05-0.1OMpa,空气流量0.80-1.20L/min ;第3-6天搅拌速度150-200rpm,罐压0.08-0.20Mpa,空气流量1.00-2.0OL/min ;第7-8天搅拌速度100-150rpm,罐压0.05-0.1OMpa,空气流量
0.80-1.20L/min。
[0022](5 )菌丝体产品获得
过滤发酵产物获得菌丝体，真空干燥后用粉碎机粉碎至100-500目细粉，获得纯的冬虫夏草发酵菌粉，本实施例的干菌粉，得率为6.8%。
[0023]实施例2
在实施例1中，增加5L的一级种子罐，50L和500L作为二级和三级种子罐，其余工艺流程、培养条件均与实施例1完全一样，获得纯的冬虫夏草干燥菌粉，得率为9.2%。
[0024]实施例3
与实施例1相比，种子罐培养接种量比例增加至5%，发酵罐培养接种量比例增加至10%，其余工艺流程、培养条件均与实施例2完全一样，获得纯的冬虫夏草干燥菌粉，得率为11%。
【权利要求】
1.一种冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基，其特征在于用于母种制备的固体培养基配方如下:各成分重量比例为1.50-4.00%碳源，碳源为葡萄糖或蔗糖或麦芽糖，0.50-2.00%氮源，氮源为酵母膏或牛肉膏或蛋白胨，0.05-0.15%硫酸镁，0.10-0.20%磷酸二氢钾，0.05-0.10%复合维生素，1.00-2.00%琼脂粉，其余为水分； 将上述物料加热至100°C，使物料溶解、混匀，121°C下0.15MPa压力下灭菌30-50分钟，冷却降至室温凝固后即可使用。 用于摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养的液体培养基成分一致，培养基配方如下:各成分重量比例为2.00-6.00%碳源，碳源为葡萄糖或蔗糖或麦芽糖，1.00-3.00%氮源，氮源为酵母膏或牛肉膏或蛋白胨，0.08-0.20%复合维生素，其余为水分； 将上述物料加热至100°C，使物料溶解、混匀，121°C下0.15MPa压力下灭菌30-50分钟，冷却降至室温即可使用。
2.根据权利要求1所述的冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基，其特征在于复合维生素由维生素B1、维生素B2、核黄素组成，重量比例为1:1:1或2:2:1。
3.一种利用权利要求1所述冬虫夏草规模化液体深层发酵用培养基的发酵生产方法，其特征在于: Cl)母种制作:从冬虫夏草产区采收新鲜冬虫夏草，从虫子致密组织上取直径0.5-lcm的组织分离新菌种到固体培养基中，培养25-30天得母种； (2)摇瓶培养:用接种针将母种接种到摇瓶中的液体培养基中，摇床转速100-200rpm，培养8-10天，菌丝体浓度为30%，准备上种子罐； (3)种子罐培养:按照2-5%的接种量将摇瓶培养的液体菌种接种到种子罐中的液体培养基中，种子罐搅拌速度100-180rpm，罐压0.05-0.1OMpa,空气流量0.60-1.80L/min,培养6-8天得种子罐液体菌种，准备上发酵罐； (4)发酵罐培养:按照4-10%的接种量把摇瓶培养的液体菌种接种到发酵罐中的液体培养基中，搅拌速度100-250rpm，罐压0.05-0.20Mpa,空气流量0.80-2.0OL/min,培养8-10天得发酵产物。
4.根据权利要求3所述的虫夏草规模化液体深层发酵发酵用培养基的发酵生产方法，其特征在于:在摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养的菌种接入培养基中，PH值为5.0-8.0,温度为10-20°C。
5.根据权利要求3所述的虫夏草规模化液体深层发酵发酵用培养基的发酵生产方法，其特征在于:其应用于种子罐培养和发酵罐培养过程中，根据不同阶段冬虫夏草生长要求的差别，前期、中期、后期采用不同的搅拌速度、罐压和空气流量。
【文档编号】A01G1/04GK103483040SQ201310400133
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】李文新, 陈春森, 廖金永 申请人:东方中科生命科学有限责任公司