一种用于畜禽粪便堆肥处理的生物菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于畜禽粪便堆肥处理的生物菌剂，其含有嗜热一氧化碳链霉菌（Streptomyces?thermocarboxydus），短短芽孢杆菌（Brevibacillus?brevis），钋青霉菌（Penicillium?polonicum）和地衣芽孢杆菌（Bacillus?licheniformis）。在堆体中接种本发明的生物菌剂畜禽粪便可以在秋冬低温季节快速升温并维持较长时间，快速达到腐熟，并转化为优质有机肥。该生物菌剂还以用于环境温度较低条件下畜禽粪便与城乡农林废弃物混合堆肥处理。
【专利说明】一种用于畜禽粪便堆肥处理的生物菌剂
【技术领域】
[0001]本发明属于资源利用领域，具体涉及一种用于畜禽粪便堆肥处理的生物菌剂。
【背景技术】
[0002]对于畜牧业造成的严重污染，国外发达国家认识较早，对养殖业畜禽粪便及污水排放量都有严格规定，例如日本在20世纪60年代提出了 “畜产公害”问题，1999年又在以往的相关法律基础上制订了《家畜排泄物的正确管理及促进利用的相关法律》。美国“联邦水污染法”侧重于畜禽场的建设管理并规定禽畜粪便污水不经处理不允许排入自备贮粪池；德国法令规定禽畜粪尿不经处理不得排出，并规定单位的载畜量，保证土地安全消纳经过处理的禽畜粪便[I]。我国在畜禽粪污处理和利用方面仍然处于起步阶段，与发达国家差距较大，环境污染问题的解决刻不容缓。2003年I月I日国家环境保护总局与国家质量监督检验检疫局联合颁布了《畜禽养殖业污染物排放标准》，一些大中型养殖场排泄物的排放受到了严格的监督和控制。
[0003]目前，我国城市落叶、乡村秸杆和畜禽粪便的处置方式大多采用就地焚烧、随意堆放等不科学的方式，这在造成极大的环境污染的同时也形成了资源的浪费。因此，如能将这些城市落叶、种养殖业废弃物进行无害处处理并资源化利用，就可以在避免产生环境污染的同时极大地提高资源的利用效率，在实现其经济价值的同时也取得新兴产业发展、增加就业、改善环境等社会效益和生态效益。
[0004]堆肥化是解决畜禽粪便污染问题的便捷途径之一。利用畜禽粪便生产有机肥还能在治理污染的同时，变废为宝，最大限度的实现废物资源化利用。堆肥过程产生的高温能够杀死大量病原微生物、杂草种子和害虫，使有机物达到无害化和资源化的利用，除此之外，堆肥结束后生产的有机肥还 能够为大量的农作物提供必需的N、P、K等营养成分和有机质，成为农业发展的宝贵资源。
【发明内容】
[0005]本发明首先提供一种用于畜禽粪便堆肥处理的生物菌剂。
[0006]本发明提供的用于畜禽粪便堆肥处理的生物菌剂，其含有嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus), 芽?包杆菌(Brevibacillus brevis),韦卜青霉菌(Penicillium polonicum)和地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)。
[0007]其中，所述的嗜热一氧化碳链霉菌的保藏号为CGMCC N0.6873。
[0008]其中，所述的短短芽孢杆菌的保藏号为CGMCC N0.6875。
[0009]本发明不限定钋青霉菌和地衣芽孢杆菌的具体菌株，现有的菌株均可以用于本发明，如市售获得的，如可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0010]其中，所述短短芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上，所述的钋青霉菌活菌数为20亿/克以上，所述地衣芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上，所述的嗜热一氧化碳链霉菌的活菌数为20亿/克以上。[0011]在本发明一个实施方案，所述的生物菌剂可以为液体菌剂。
[0012]本发明还提供一种畜禽粪便堆肥处理方法，将畜禽粪便与粉碎的城乡农林废弃物按一定比例混合，调整物料的C/N比为28-32，按5-8%。的比例接入所述的生物菌剂，拌匀后定期翻堆通气，经过20-30天好氧堆肥完成畜禽粪便的堆肥化处理。
[0013]本发明的嗜热一氧化碳链霉菌和短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)菌株分离与筛选过程如下:
[0014]①采用平板稀释法分别从新鲜牛粪、高温发酵阶段牛粪以及腐熟后的牛粪中进行微生物分离。称取各样品各IOg分别放入装有90mL无菌水的三角瓶中，在摇床上振荡30min，使样品充分分散，静置20min后即为KT1稀释液，然后连续稀释制成10_2_10_8浓度的稀释液备用。取100 μ L各浓度的稀释液，采用常规涂抹法用涂布器在高氏I号固体培养基和牛肉膏蛋白胨培养基上涂布，每个浓度梯度三个重复，分别置于25 V、30°C、50 V恒温培养箱中培养。3d后挑取平板上长出的单菌落，进一步纯化培养，并于4°C保存。
[0015]高氏I 号培养基为可溶性淀粉 20.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml, pH7.2-7.4、琼月旨 1.5%-2.0%。
[0016]牛肉膏蛋白胨培养基为牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaC15.0g/L、水1000ml、ρΗ7.2-7.4、琼脂 1.5%-2.0%。
[0017]②根据菌株在纤维素一刚果红平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈与菌落直径比值(D/d)的大小，筛选出了 I株高温菌，该菌株在培养的第2天即出现清晰的透明圈，在培养第5天D/d达到11.3。该菌株菌落近圆形，表面绒毛状、松散、边缘菌丝较紧密，呈灰色；基部颜色浅褐色。
[0018]③利用16SrDNA-PCR技术对该菌株进行分子生物学鉴定，测定了 16SrDNA的序列，序列如SEQ ID N0.1所示，与其它公布的嗜热一氧化碳链霉菌的16SrDNA的序列同源性为99%,鉴定为嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus),命名为CFl,并于2012年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.6873。
[0019]④根据菌株在纤维素一刚果红平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈与菌落直径比值(D/d)的大小，筛选出了 I株高温菌，该菌株在培养的第2天即出现清晰的透明圈，在培养第6天D/d达到9.3。该菌株形成的菌落为透明的乳白色，圆形，边缘光滑、整齐。
[0020]⑤利用16SrDNA-PCR技术对该菌株进行分子生物学鉴定，测定了 16SrDNA的序列，序列如SEQ ID N0.2所示,与其它公布的短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)的16SrDNA的序列同源性为99%,鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis),命名为CXl,并于2012年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.6875。
[0021]在以畜禽粪便和城乡农林废弃物为主要原料的堆肥中接种本发明的复合生物菌剂，能在20-30天时间内实现上述废弃物的无害化处理，并转化为高品质有机肥。该生物菌剂尤其适于在秋冬低温季节用于畜禽粪便的堆肥处理，具有起爆速度快，高温持续期长，堆料养分损失少的优点。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0023]若无特别说明，本发明中所述的“份”是指“重量份”。
[0024]实施例1嗜热一氧化碳链霉菌菌剂的制备
[0025]将嗜热一氧化碳链霉菌CFl接种至高氏I号固体培养基斜面，于50°C恒温条件培养72h得到斜面种子；
[0026]将斜面种子接种至高氏I号液体培养基，于50°C恒温条件，180r/min转速振荡培养72h得到液体种子；
[0027]将液体种子以5% (V/V，即每100ml液体培养基接种5ml液体种子)接种量，接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，50°C恒温培养4天。培养后的发酵液即可作为菌剂使用。
[0028]所述的高氏I号固体培养基成分为:每1000ml蒸馏水中加入可溶性淀粉20.0g,KNO3L 0g, K2HPO40.5g, MgSO4.7Η200.5g, NaCl0.5g, FeSO40.01g,琼脂 20.0g,调节 pH 为
7.2-7.4。分装入试管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高温高压灭菌20min，之后摆成斜面。
[0029]所述的高氏I号液体培养基成分为:每1000ml蒸馏水中加入可溶性淀粉20.0g,KNO3L 0g, K2HPO40.5g, MgSO4.7Η200.5g, NaCl0.5g, FeSO40.01g,调节 pH 为 7.0。分装入500ml三角瓶中，每瓶150ml,塞上棉塞,高温高压灭菌20min。
[0030]实施例2短短芽孢杆菌菌剂制备方法
[0031]将短短芽孢杆菌CXl和地衣芽孢杆菌(CICC N0.20085，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)分别接种至牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面，于50°C恒温条件培养72h得到短短芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面种子；
[0032]将斜面种子接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，于50°C恒温条件，180r/min转速振荡培养72h得到液体种子；
[0033]将液体种子以5% (V/V,即每100ml液体培养基接种5ml液体种子)接种量,接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，50°C恒温培养4天。培养后的发酵液即可作为菌剂使用。
[0034]所述的牛肉膏蛋白胨固体培养基成分为:牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaC15.0g/L、水 1000ml、ρΗ7.2-7.4、琼脂 1.5%-2.0%。分装入试管中，每管 5-lOml，塞上棉塞，高温高压灭菌20min，之后摆成斜面。
[0035]所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基成分为--每1000rnl蒸馏水中加入牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaC15.0g,调节pH为7.2-7.4。分装入500ml三角瓶中，每瓶150ml，塞上棉塞，高温高压灭菌20min。
[0036]实施例3钋青霉菌菌剂制备方法
[0037]将钋青霉菌(王亮，2012)接种至改良高氏I号固体培养基斜面，于35°C恒温条件培养72h得到斜面种子；
[0038]将斜面种子接种至改良高氏I号液体培养基，于35°C恒温条件，180r/min转速振荡培养72h得到液体种子；[0039]将液体种子以5% (V/V,即每100ml液体培养基接种5ml液体种子)接种量，接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，35°C恒温培养4天。培养后的发酵液即可作为菌剂使用。
[0040]所述的改良高氏I号固体培养基成分为:其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、琼脂2.0%，分装入试管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高温高压灭菌20min，之后摆成斜面。 [0041]所述的改良高氏I号液体培养基成分同前，无琼脂。
[0042]实施例4畜禽粪便堆肥处理的生物菌剂
[0043]将制备的短短芽孢杆菌发酵液、针青霉菌发酵液、地衣芽孢杆菌发酵液和嗜热一氧化碳链霉菌CFl发酵液按重量比，1:2:1:2进行混合，即得本发明的畜禽粪便堆肥处理的生物菌剂，其中所述短短芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上，所述的钋青霉菌活菌数为20亿/克以上，所述地衣芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上，所述的嗜热一氧化碳链霉菌的活菌数为20亿/克以上。
[0044]实施例5畜禽粪便堆肥处理
[0045]处理原料:猪粪、牛粪、玉米秸杆来源于北京郊区，杨树树叶、杂草来源于北京农学院校内，用植物粉碎机将玉米秸杆、杨树树叶、杂草粉碎成2-3cm长，然后与猪粪和牛粪混合均匀，堆料的具体配为比玉米桔:杨树树叶:杂草:猪粪:牛粪=1:1:2:5:5 (质量比)，用大豆饼来调节最终发酵材料的C/N为30左右，按合理比例加入水，使含水率控制在60%左右。
[0046]将实施例4制备的生物菌剂按接种量8%。接种到混合堆料中，定期翻堆通气，同时以不接入任何菌剂的堆体为对照。
[0047]测定指标:监测堆置过程中堆料的温度变化，并于发酵结束后，测定堆肥产物的养分含量、种子发芽指数(GI)和木质纤维素类物质的含量。
[0048]测定方法:于堆肥当天物料混匀完毕和堆肥结束后，用小土钻钻取堆体表层向下
10-20cm、30-40cm、50-60cm不同堆体深度处的样品，混匀后分为两份,一份在采样当天用于测定种子发芽指数(GI)，另一份及时铺开风干，用于测定养分含量和木质纤维素类物质的含量。
[0049]将混合均匀的新鲜堆料样品500g，采用四分法取样200g。称取50g加250ml蒸馏水混合搅拌30min后，经3000r/min离心lOmin，上清液即为堆肥浸提液。在直径9cm铺有滤纸的无菌培养皿中，均匀放入20粒白菜(Brassica campestris L.)种子,吸取5ml堆肥浸提液润湿滤纸，以蒸馏水作对照，每个处理3次重复，在25°C恒温培养箱中培养24h，测定种子发芽率和根长，并计算种子发芽指数。
[0050]GI(%)=处理平均发芽率X处理平均根长/(对照平均发芽率X对照平均根长)X 100。
[0051]将风干样品粉碎，测定其全碳、全氮、全磷和全钾含量，测定方法参见NY525-2012 ；腐殖酸含量测定采用重铬酸钾氧化法；半纤维素、纤维素和木质素含量，利用纤维素半纤维素测定仪(FIBERTEC SYSTEM M6, FOSS ANALYTICAL AB)测定。
[0052]试验结果:[0055]温度是影响微生物活性和有机物料转化最显著的因子，是判断堆肥产品是否达到无害化要求的最重要参数之一，同样也是表观上直接判断堆肥腐熟度的指标。堆肥就是为了使堆肥材料的温度快速上升并能在较高的温度下维持一段时间，达到有机物降解、杀死病原菌的目的。在本实施例中，接种本发明所述生物菌剂的处理其高于50°C的时间均达到了 14天，达到了消灭堆肥原料中病原菌的要求，符合我国粪便无害化卫生标准(GB795-87)所要求的堆肥温度在50~55°C以上维持5~7d。而对照处理其堆料的温度始终未上升至50°C以上，显然堆肥的腐熟程度较差。在环境温度较低的情况下(< 10°C)，接种本发明生物菌剂的处理在发酵的前几天温度上升较快，是由于添加的微生物较快的利用了原料中的有机物质，如蛋白质、脂肪以及一些可溶性单糖类物质等，产生CO2和H20。随着发酵过程的进行，微生物新陈代谢旺盛、菌体大量产生，继而引爆堆料中其他微生物的激烈代谢，产生了大量的热量，使堆肥温度上升，由于这些热量不能被及时释放到环境中去(构成堆肥材料的大部分物质均是热的不良导体，如纤维素、木质素等)，导致堆肥初期温度迅速上升达500C以上并维持这个温度一周以上。
[0056]表2堆肥样品的养分含量
[0057]
U1 # Λ 腐植醆
处理有机碳_ 全氮_ 全磷_ 全卿g*gGK % )
接种
_485.67±0,61 27.46丄 0.02 18,?3±0J2 23.4W0J7 69,68 30,62±0,09 95.3
菌剤
CK466.13±0,43 20.57±0.05 12.04±0.01 15.24±0,01 47.85 18.54±0.12 45.6
[0058]种子发芽指数是反映堆肥腐熟程度的重要参数。由于细菌、真菌、放线菌等微生物的生命活动持续降解有机物质，堆肥中会产生乙酸等有机酸及酚类化合物，对植物产生毒性作用，抑制植物种子的正常发芽、生长。但是随着堆肥过程的持续进行，这些毒性物质会被微生物逐渐降解、转化或挥发，它们对植物种子的毒害作用则越来越小，腐熟的堆肥甚至可以促进植株生长。因此种子发芽指数(GI)是最直接反映堆肥生物毒性的参数，它不仅考虑了种子的发芽率，还考虑了植物毒性物质对种子生根的影响。种子发芽指数(GI) ^ 80%,说明有机肥料对植物无毒性并已达到腐熟。由表2可知，接种本发明生物菌剂的处理其种子发芽指数为95.3%，说明堆料已完全腐熟。而对照堆肥的种子发芽指数为45.6%，说明该处理发酵不彻底。
[0059]测定发酵20天时堆料的养分含量(见表2)可以看出，接种本发明复合菌剂的堆料其全效氮磷钾含量、有机质和腐植酸的含量均显著高于未接菌的对照(CK)，达到并高于NY-525-2012中有机肥质量的标准。而未接菌(CK)堆料，养分含量未达到NY-525-2012中有机肥质量的标准。
[0060]在畜禽粪便和农林废弃物堆肥处理过程中，其中所含的纤维素、半纤维素和木质素由于结构复杂、降解困难，已成为缩短堆肥周期、提高堆肥效率的限制性因素。由表3可知，在堆肥初始物料成分一致的条件下，在堆肥结束后，接种本发明所述生物菌剂的堆肥样品中，纤维素、半纤维素和木质素相对含量均比未接菌的堆肥处理低，其中半纤维素含量是CK的70.8%，纤维素含量是CK的71.4%，木质素含量是CK的74.3%。这说明在畜禽粪便和城乡农林废弃物混合堆料中接种本发明所述生物菌剂有利于物料中半纤维素、纤维素和木质素的分解与转化，从而促进了堆肥腐熟。
[0061]表3堆肥样品的木质纤维素类物质含量
【权利要求】
1.一种用于畜禽粪便堆肥处理的生物菌剂，其含有嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus), 芽?包杆菌(Brevibacillus brevis),韦卜青霉菌(Penicillium polonicum)和地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)。
2.如权利要求1所述的生物菌剂，其特征在于，所述的嗜热一氧化碳链霉菌的保藏号为 CGMCC N0.6873。
3.如权利要求1所述的生物菌剂，其特征在于，所述的短短芽孢杆菌的保藏号为CGMCCN0.6875。
4.如权利要求1~3任一项所述的生物菌剂，其特征在于，所述短短芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上，所述的钋青霉菌活菌数为20亿/克以上，所述地衣芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上，所述的嗜热一氧化碳链霉菌的活菌数为20亿/克以上。
5.如权利要求1~4任一项所述的生物菌剂，其特征在于，其为液体菌剂。
6.一种畜禽粪便堆肥处理方法，其特征在于，将畜禽粪便与粉碎的城乡农林废弃物按一定比例混合，调整物料的C/N比为28-32，按5-8%。的比例接入权利要求1~5任一项所述的生物菌剂，拌匀后定期翻`堆通气，经过20-30天好氧堆肥完成畜禽粪便的堆肥化处理。
【文档编号】C05F17/00GK103484410SQ201310454893
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】刘克锋, 王顺利, 王红利, 高程达, 石爱平 申请人:北京农学院