酵母cup1基因在动物饲养领域的用途
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】，特别是涉及酵母CUP1基因在动物饲养领域的用途，并进一步提供相关CUP1基因的表达载体及其制备方法。本发明提供酵母CUP1基因在动物饲养领域的用途，所述动物饲养领域具体指促进动物对于饲料中铜的吸收率，促进动物的体重增加，并减少动物的铜排放，由此降低铜排放对土壤、水体等生态环境的污染。本发明发明人对酵母中的CUP1基因进行载体的构建，在建立的转CUP1基因的小鼠模型中，发明人发现转CUP1基因促进了小鼠的体重增加，并在促进了小鼠对饲料中铜的吸收率的同时，也减少了铜的排放，减少了铜排放对土壤、水体等生态环境的污染。
【专利说明】酵母CUP1基因在动物饲养领域的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，特别是涉及酵母CUPl基因在动物饲养领域的用途，并进一步提供相关CUPl基因的表达载体及其制备方法。
【背景技术】
[0002]规模化、集约化的养猪产业对生态环境的污染越来越严重，而在猪排泄中的铜是重要的因素之一。铜作为一种高效、廉价、方便的促生长添加剂在养猪业中被广泛应用。畜禽的日粮中铜的添加量大大超出其适宜需要量时，被吸收利用的铜很少，绝大多数铜会随粪便排出体外。土壤中高浓度的铜对微生物产生毒害作用，使得微生物的种类和数量大大降低，土壤出现了结板盐碱化，对土壤的呼吸有很大的抑制作用。高铜会造成动物中毒，在动物的内脏和肌肉中的残留量增加，铜可以通过食物链进行富集，对整个生态链的安全带来潜在的危害，甚至会危及到人类的健康。
[0003]课题组已经通过文献挖掘和生物信息学方法确定了酵母CUPl作为我们研究的基因。通过生物信息学的预测，发现酵母CUPl与哺乳动物的MT基因是同源基因，基因的序列及表达的蛋白氨基酸上相差很远，只是含有相同的结合金属离子的保守氨基酸序列，所以该基因的转入不会对转基因动物自身的代谢造成影响。而随着转基因技术的发展，培育有效利用饲料中的添加铜、减少铜排放的转基因猪成为可能，这可以从根本上缓解养猪业对环境的污染问题。而酵母CUPl基因编码的蛋白属于金属硫蛋白，酵母对铜的鳌合是由CUPl蛋白来控制的。
【发明内容】
[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供酵母CUPl基因(登录号:NM_001179185或NM_001179183)在哺乳动物饲养领域的用途，用于解决现有技术中的问题。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供酵母CUPl基因在动物饲养领域的用途。
[0006]所述动物饲养领域具体指促进动物对于饲料中铜的吸收率，促进动物的体重增加，并减少动物的铜排放，由此降低铜排放对土壤、水体等生态环境的污染。
[0007]所述动物优选为哺乳动物。
[0008]本发明第二方面提供一种酵母CUPl基因的构建体，所述表达载体由酵母CUPl基因的编码序列插入到表达载体的多克隆位点构建而成。
[0009]所述构建体能够表达酵母CUPl基因。
[0010]优选的，所述的表达载体为真核的表达载体pEGFP-Nl。
[0011]本发明第三方面提供所述酵母CUPl基因的构建体所表述的CUPl基因在制备转基因动物领域的用途。
[0012]所述动物优选为哺乳动物。[0013]本发明第四方面提供一种酵母CUPl基因的表达系统，由所述酵母CUPl基因的构建体转染到宿主细胞构建而成。
[0014]本发明发明人对酵母中的CUPl基因进行载体的构建，在建立的转CUPl基因的小鼠模型中，发明人发现转CUPl基因促进了小鼠的体重增加，并在促进了小鼠对饲料中铜的吸收率的同时，也减少了铜的排放，减少了铜排放对土壤、水体等生态环境的污染。以培育环境友好型动物新品种的角度为出发点，为转基因猪的制备奠定基础，以期从转基因全新的角度降低在畜牧养殖业中的微量元素铜的排放，从根本上解决了养猪业中的环境污染问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1.酵母CUPl基因PCR扩增的结果，其中1、2 =CUPl基因；M:DNA分子量Marker, DL2000。
[0016]图2.重组质粒 pEGFP-CUPl 的菌液鉴定，M:DNA 分子量 Marker, DL2000 ；1-10:PCR扩增重组质粒PEGFP-CUP1的菌液；11:用水做模板进行扩增的结果(空白对照)。
[0017]图3.重组质粒 pEGFP-CUPl 的酶切及 PCR 验证，M =DNA 分子量 Marker, DL2000 ；1:质粒酶切图，2:没有酶切的质粒；3:PCR扩增质粒。
[0018]图4.流式细胞仪分选的阳性克隆细胞，图为在蓝色光的激发下的绿色荧光，a:携带空载体的细胞(对照组细胞)，b:携带CUPl基因的细胞(实验组细胞)。
[0019]图5.阳性克隆细胞CUPl的PCR扩增，M:DNA分子量Marker, DL2000 ；1:空白对照，
2:阴性对照，3:以实验组细胞的DNA为模板进行的扩增。
[0020]图6.阳性克隆细胞CUPl的PCR扩增，M:DNA分子量Marker, DL2000 ；1:空白对照，
2:阴性对照，3:以实验组细胞的cDNA为模板进行的扩增。
[0021]图7.CUPl真核表达产物的Western blot验证,HeLa:为空白对照，control:对照组细胞的Western blot结果，test:实验组细胞的Western blot结果。
[0022]图8.对照组及实验组细胞经铜(100 μ M)孵育不同的时间(6，24，48，96h)后，酵母CUPl (yeast CUPl)及细胞本底MT基因(human MT) mRNA表达量的检测。
[0023]图9.对照组及实验组细胞经不同浓度的铜(200，400，600，800，1000 μ M)孵育不同时间(6，24，48，72，96h )后，用MTT法检测细胞的增殖速率的结果。Contro1:对照组细胞，Test实验组细胞。
[0024]图10.对照组及实验组细胞经铜(100 μ M)诱导不同的时间(4，8，16，24h)后，细胞周期的Gl期、S期随时间变化的检测。Control:对照组细胞，Test实验组细胞。
[0025]图1L 重组质粒 pPSP-CUPl 的菌液鉴定，M:DNA 分子量 Marker, DL2000 ；1-10:PCR扩增重组质粒pPSP-CUPl的菌液；11:空白对照。CUPl:鉴定CUPl在菌液中表达，neo:鉴定neo基因在菌液中的表达。
[0026]图12.重组质粒 pPSP-CUPl 的 PCR 鉴定，M =DNA 分子量 Marker, DL2000 ；1:空质粒的凝胶电泳，2:CUP1特异扩增的结果，3，neo特异扩增的结果。
[0027]图13.重组质粒pPSP-CUPl双酶切(Xho I和Not I)的结果，M =DNA分子量Marker, DL10000 ；1:没有酶切的空质粒，2_7:质粒经双酶切的结果。
[0028]图14.重组质粒 pPSP-CUPl 酶切(Bgl II)的结果，M:DNA分子量Marker, DL10000 ；1:质粒经酶切的结果。
[0029]图 15.Southern blot 探针特异性的 PCR检测，M:DNA 分子量Marker, DL2000 ；1~2:扩增的特异探针。
[0030]图 16.Southern blot 中 DNA 的凝胶电泳检测，M:DNA 分子量 Marker, DL10000 ；1-6:DNA的凝胶电泳结果。
[0031]图17.DNA 酶切(Bgl II)后的凝胶电泳检测，M:DNA 分子量 Marker, DL10000 ；1~7:DNA酶切后的凝胶电泳结果。
[0032]图18.转CUPl基因小鼠的Southern blot的结果，1:以质粒pPSP-CUPl杂交的阳性对照，2:阴性对照；3-4:阳性小鼠杂交的结果，3为两个拷贝，4为一个拷贝。
[0033]图19.CUPl基因在转基因小鼠不同组织中的表达检测，1-9分别为心、肝、脾、胃、肾、肠、脑、腮腺、颌下腺；10:阳性对照；11:空白对照。
[0034]图20.CUPl基因在野生型小鼠不同组织中的表达检测，1-9分别为心、肝、脾、胃、肾、肠、脑、腮腺、颌下腺；10:阳性对照；11:空白对照。
[0035]图21.CUPl基因在转基因小鼠腮腺及颌下腺中表达的Western blot检测，PG1-4:转基因阳性小鼠的腮腺组织；SGl-4:转基因阳性小鼠的颌下腺组织。
[0036]图22.小鼠第一周和前两周的体重增加的检测，control为对照组小鼠的体重增加；test为转基因的阳性小鼠体重的增加。
[0037]图23.小鼠第一周和第二周粪便中铜含量的检测，control为对照组小鼠的粪便中铜的含量；test为转基因的`阳性小鼠的粪便中铜的含量。
【具体实施方式】
[0038]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的【具体实施方式】加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0039]在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0040]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0041]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本【技术领域】常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition, 2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons, New York,1987and periodic updates ；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego ;WoIffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119，Chromatin Protocols (P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0042]本发明实施例中所用生物材料来源如下:
[0043]pMD18-T vector、DH5a感受态细胞、Xho I等限制性内切酶均购自Takara公司。
[0044]真核表达载体pEGFP-Nl购自广州英伟创津公司。
[0045]实验所用的FVB和ICR品种的小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
[0046]实施例1
[0047]1.载体的构建:
[0048]含有酵母CUPl序列由Invitrogen合成,并克隆到pMD18_T上,合成的序列如下:
[0049]TTGGCGCGCCATGTTTCAACTTTGGAAACTTGTTTTCTTGTGCGGTCTGCTCATTGGGACCTCAGCGTCTTTCAGCGAATTAATTAACTTCCAAAATGAAGGTCATGAGTGCCAATGCCAATGTGGTAGCTGCAAAAATAATGAACAATGCCAAAAATCATGTAGCTGCCCAACGGGGTGTAACAGCGACGACAAATGCCCCTGCGGTAACAAGTCTGAAGAAACCAAGAAGTCATGCTGCTCTGGGAAATGAGGCGCGCCGA (Seq ID N0.1 ；Asc I,划线部分；大小263bp)设计含有Hind III和Sac II粘性末端序列的引物P1，序列如下:`[0050]CUP-CFl: 5，CCCAAGCTTATGTTCAGCGAATTAATTAACTTCC3，
[0051](Seq ID N0.2 ；Hind III,划线部分)
[0052]CUP-CRl: 5，TCCCCGCGGTTTCCCAGAGCAGCATGACTTCTTG3，
[0053](Seq ID N0.3 ；Sac II ,划线部分)
[0054]用引物Pl扩增的PCR产物(见图1)纯化后，连接到pMD18-T的载体上(酶切位点Hind III和Sac II)。再经转化(DH5a感受态细胞)、菌落的筛选、PCR的鉴定后，经酶切和测序的鉴定等获得阳性的克隆菌液，再抽质粒。经Hind III和Sac II双酶切后回收纯化。把携带空载体PEGFP-Nl和基因CUPl的纯化产物用T4DNase进行连接。按照上面的步骤获得阳性克隆的菌液，经阳性克隆菌液的鉴定(见图2)，再进行菌液的扩大培养，经无内毒素抽提后，获得高质量的转染质粒。质粒经双酶切(Hind III和Sac II )、测序及PCR的验证(见图3)，在相应的位置出现正确的条带，测序及PCR验证正确，证明构建的表达载体是正确的。
[0055]2.阳性细胞系的筛选及CUPl表达的验证
[0056]阳性细胞的筛选采用分级分选的方法，首先用300 μ g/mL G418进行初步的筛选，获得一定纯度的阳性克隆细胞，再基于细胞所携带的绿色荧光蛋白用MoFlo XDP流式细胞仪(Beckman Coulter公司，美国)的分选系统对细胞进行分选，获得纯的阳性克隆细胞系(见图4，a:携带空载体的细胞(对照组细胞)，b:携带CUPl基因的细胞(实验组细胞))。
[0057]酵母CUPl表达的验证:抽提HeLa细胞(空白对照)、对照组细胞及实验组细胞的DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA。分别以DNA及cDNA作为模板，用P2引物在60°C时进行扩增。P2引物为:
[0058]F:5/ TAACTTCCAAAATGAAGGTCATGAG3' (Seq ID N0.4),[0059]R:5/ TTCCCAGAGCAGCATGACTT3' (Seq ID N0.5)。
[0060]在实验组细胞中，以DNA及cDNA做模板都能扩增出单一的条带，而在空白对照、对照组的细胞中都没有扩增出条带(见图5、6)。对空白对照、对照组及实验组细胞进行蛋白的抽提，以小鼠的β-actin蛋白作为内参，通过CUPl特异性的抗体(Santa CruzBiotechnology,美国)检测CUPl在细胞中的表达情况。Western blot结果表明，在实验组细胞中有CUPl的表达，而在空白对照、对照组的细胞中都没有检测到CUPl的表达(见图7)。综上结果表明，CUPl在实验组细胞中在mRNA、蛋白水平上成功表达。
[0061]3.细胞铜吸收的ICP-MS检测
[0062]把对照组和实验组细胞以2 X IO5个/瓶接种T25细胞培养瓶中，培养24h后，用含有终浓度为10μ mol/L和100 μ mol/L的His-Cu细胞培养液分别对对两种细胞进行孵育培养48h。每个实验做3个重复，孵育培养完后立即去除细胞培养液，并用PBS洗去残留的培养液。再做检测前的预处理，定容到5mL，用ICP-MS进行细胞中铜含量的检测。结果表明(见表1)，实验组细胞铜的吸收显著的高于对照组细胞铜的吸收，铜浓度提高的情况下，这种差异增大。铜浓度为lOOumol/L的时候，细胞的铜吸收实验组是对照组的2倍以上。
【权利要求】
1.酵母CUPl基因在动物饲养领域的用途。
2.—种酵母CUPl基因的构建体，所述构建体由酵母CUPl基因的编码序列插入到表达载体的多克隆位点构建而成。
3.如权利要求2所述的一种酵母CUPl基因的构建体，所述的表达载体为真核的表达载体 pEGFP-Nl。
4.如权利要求2-3任一权利要求所述的酵母CUPl基因的构建体所表述的CUPl基因在制备转基因动物领域的用途。
5.一种酵母CUPl基因的表达系统，由权利要求2-3任一权利要求所述的酵母CUPl基因的构建体转染到宿主细胞 构建而成。
【文档编号】A01K67/027GK103525865SQ201310462147
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】潘玉春, 颉孝贤, 马育芳, 王起山, 张向喆, 杨玉梅, 陈强, 廖荣荣, 陈振亮, 王振, 贺鹏飞, 张哲 , 涂盈盈 申请人:上海交通大学