一种防控蔬菜真菌病害的深绿木霉制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种防控蔬菜真菌病害的深绿木霉菌剂及其制备方法。该木霉菌菌株Tr1208为深绿木霉（Trichodermaatroviride），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6828。深绿木霉菌剂是以深绿木霉Tr1208菌体为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体及保护剂制成；其中效活性成分含菌量为1.0~30.0×108个孢子/克；菌体保护剂含量为0.05~1.8%。菌剂可有效防治韭菜灰霉病、黄瓜褐斑病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果类立枯病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病，并对植物有促进生长作用，具有高效、抑菌谱广、使用简单、成本低、无环境污染、改善植株微生态环境的特点。
【专利说明】一种防控蔬菜真菌病害的深绿木霉制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物农药【技术领域】，具体涉及一种拮抗蔬菜病原真菌的深绿木霉制剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]随着我国农业结构调整步伐的加快和人民生活水平的提高，蔬菜品种的多样化及周年均衡供应的需求日益增强，我国蔬菜生产的规模不断扩大，产量稳步上升，已成为我国种植业中仅次于粮食的第二大农作物。据农业部农情统计，2009年我国蔬菜种植面积占全球的43%，总产量占世界的49.6%。总产量及出口量均居世界第一，堪称世界第一蔬菜大国。
[0003]但是随着我国蔬菜生产的发展，栽培模式的多样性，蔬菜栽培种类和品种的丰富性，尤其是栽培环境的多样化，导致某些次要病害上升，病原菌寄主范围扩大，产生了许多亟待研究的新病害，一些新老病害交替为害，这些都严重制约着我国蔬菜产业的发展。其中韭菜灰霉病、黄瓜褐斑病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果类立枯病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病等真菌性病害，均发生较为严重，造成严重减产、甚至绝收，已成为蔬菜生产的限制性障碍。目前防治该类病害仍主要采用化学药剂，常常刚用完药就采收销售，不仅造成蔬菜污染，同时还极易造成抗药性问题。因此研发安全与环境相和谐的微生物农药成为必然，其中木霉这类有益微生物，由于其具有广谱的抗病能力和调节微生态、诱导抗性作用，而被研究用于植物病害生物防治和改善作物生长。
[0004]木霉是自然界中普遍存在的一类真菌，在土壤、植物根围、叶围及种子、球茎表面经常可以分离到。近些年人们发现某些木霉是植物病原真菌的寄生菌或拮抗菌，如哈茨木霉(J.Aarzia/?a?)、钩状木霉(71.a?)、绿色木霉(71.n'riofe)可以防治真菌病害。迄今为止有关木霉在生防方面的研究已开展近70年，在国外已经出现了商品化的木霉制剂。如以防治李属果树银叶病(CXofl i/riasierew? /w/r/w/rew?)的木霉制剂在西欧已商品化生产；以色列的Makhteshim Agan公司开发的以哈茨木霉T39菌株为发酵液的生防制剂,商品名Trichodex,剂型为25%可湿粉,它可以用于防治灰霉病菌iBotrytis ciflerea)、菌核病菌{Scleratina sclerotiorum^V^^^iCladosporium fulvum)等病害，在国内也有研究利用木霉菌控制植物病害。21世纪被称为环保世纪，化学药剂的应用逐步受到限制，因此对蔬菜病害的生物防治研究自然称为热点问题。
[0005]本发明正是基于以上原因，以目前蔬菜为害较为严重，又缺乏生物防治手段的的韭菜灰霉病、黄瓜褐斑病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果类立枯病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病为靶标，从微生物资源中寻找具有高效拮抗活性的微生物，拟为研究开发新型生物菌剂寻找新的资源。
【发明内容】
[0006]本发明旨在提供一种防治蔬菜病害的深绿木霉制剂及其制备方法，可以用于防治蔬菜真菌病害，解决化学农药防治带来的农药残留、抗药性和环境污染问题。本发明可用于防治韭菜灰霉病、黄瓜褐斑病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果类立枯病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病等，具有高效、光谱、性能稳定、可规模化生产的蔬菜微生物菌剂。为实现此目的，本发明公开了如下的技术内容:
一株具有拮抗蔬菜病原真菌活性的深绿木霉菌株，其特征在于该菌株为深绿木霉Trl208 (Trichoderma atroviride),已于2012年11月15日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0.6828。保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所。
[0007]本发明保藏的深绿木霉菌株Trl208 {Trichoderma atrwiriofe)的生理、生化特性如下:
木霉菌株Trl208在PDA平板上生长迅速，菌落在3天内覆盖直径90mm的平板，呈辐射状，表面疏松平坦；在培养的第3天明显可见有孢子产生，最初为淡绿色，以后逐渐增多，呈现深绿色，产孢丛束排列成同心的轮纹。显微观察培养的菌丝体无色、分枝繁复，由具有横隔的分枝菌丝构成；产生的分生孢子无隔膜，呈球形，聚成头状排列，单生，细胞壁存在明显而微小的粗糙突起。余下量为碳酸钙和硅藻土载体，其中碳酸钙:硅藻土的重量份数比为1:2~5。
[0008] 本发明进一步公开了一种深绿木霉菌剂，其特征在于它是由保藏号为CGMCCN0.6828的深绿木霉Tr 1208 (Trichoderma a troviride )菌体和它的次生代谢物为有效活性成分，配以农业上可以接受的载体以及菌体保护剂组成；其中有效活性成分为
1.0^30.0XlO8个孢子/克，菌体保护剂含量为0.05~1.8% (w/w)。
[0009]本发明优选的深绿木霉菌剂，其特征在于它是由保藏号为CGMCCN0.6828的深绿木霉Trl208 {Trichoderma airoririofe)菌体为有效活性成分,配以农业上可以接受的载体以及菌体保护剂组成；其中有效活性成分为1.0-30.0X IO8个孢子/克，菌体保护剂含量为 0.05~1.8% (w/w)。
[0010]本发明所述的深绿木霉菌剂，其菌体为深绿木霉分生孢子、菌丝和厚垣孢子的混合物；农业上可接受的载体为:硅藻土、碳酸钙、水、小麦粉、木屑、高岭土、不饱和烃类一种或几种的混合物；所述的菌体保护剂为黄原胶、蔗糖、腐植酸钠、黄腐酸钾一种或几种的混合物。
[0011]本发明更加优选的深绿木霉菌剂，其特征在于它是由下述成分组成:
深绿木霉Trl208含菌量为1.0^30.0XlO8个孢子/克，
黄原胶 0.05~0.1% (w/w),
鹿糖 I~1.5% (w/w),
腐植酸钠或黄腐酸钾0.05、.2% (w/w)
本发明更进一步公开了深绿木霉菌剂的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行:
1)菌种活化:保藏号为CGMCCN0.6828 的深绿木霉 Trl208 (.Trichoderma atroviride')的菌株在在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中活化72h，备用；
所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称PDA培养基)组成为:马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15~20克、自来水1000毫升，自然pH ；
2)种子液制备:活化后的深绿木霉Trl208菌株，在23~28°C下，小麦粉培养液或理查培养液震荡培养72、6h，培养后得到深绿木霉Trl208种子液；所述的小麦粉培养液组成为:全麦粉20g、葡萄糖20g、酵母膏2g，水lOOOmL，pH6.8~
7.2 ；
理查培养液指的是:硝酸钾1(^，磷酸二氢钾58，硫酸镁2.5 g，氯化铁0.02 g，蔗糖50g,水 1000 mL, pH6.8 ~7.2 ;
3)固体发酵培养:在固体发酵培养基料中加入水2(T45%(w/w),初始pH为6.5^7.5之间，高温灭菌，然后待温度降到30°C以下，接入步骤2)的种子液，再在温度为2(T30°C，间隔24~30h，定期搅拌的条件下发酵培养96~148h ；
所述的固体发酵培养基料(w/w)的组成为:麦粉2~4%，麦麸12~18%，食用菌废料渣或/和木屑77.f 84%，过磷酸钙0.5~1%，尿素0.2~0.5%，蔗糖0.2~0.5%，润水后灭菌备用；
4)测定发酵培养基料中菌体的数量，待发酵基料中孢子量达到IO9cfu/g以上后停止发酵培养，培养物料经常温干燥，采用万能粉碎机粉碎后成深绿木霉母粉；
5)制备深绿木霉菌剂:以含菌量为2.0^60.0XlO8个孢子/克深绿木霉Tr 1208母粉，黄原胶0.05、.1%，蔗糖f 1.5%，腐植酸钠或黄腐酸钾0.05、.2%，余下量为碳酸钙和硅藻土载体，其中碳酸钙:硅藻土的重量份数比=1:2~5，混合制备深绿木霉菌剂。
[0012]本发明同时也公开了深绿木霉Trl208 {Trichoderma airoririofe)菌株在制备作为防控蔬菜真菌病害菌剂中的应用。优选在作为防治韭菜灰霉病、黄瓜褐斑病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果类立枯病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病菌剂中的应用以及作为促进植物生长制剂中的应用。
[0013]本发明可以制成各种剂型，如可湿性粉剂、粉尘剂、颗粒剂和悬浮剂等，还可以加入其它有效活性成分进行复配以及增效剂、稳定剂，以提高制剂的药效和农业上的实用性。
[0014]本发明选用碳酸钙为载体，碳酸钙颗粒的直径为0.074mm。
[0015]本发明选用娃藻土为载体，娃藻土颗粒的直径为0.074mm。
[0016]所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称PDA培养基)组成为:马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15~20克、自来水1000毫升，自然pH ；
小麦粉培养液组成为:全麦粉20g、葡萄糖20g、酵母膏2g，加水lOOOmL，pH6.8~7.2。
[0017]本发明提供深绿木霉菌剂防治蔬菜病害的施用方法是:将菌剂兑水500-1000倍液，于蔬菜地上部分均匀喷雾，或是于植株灌根施用，也可采用土壤撒施的方法进行土壤处理，以达到控制蔬菜病害的目的，可有效防治韭菜灰霉病、番茄灰霉病、黄瓜褐斑病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病防效达70%~89%，并且对植物生长有明显的促进生长作用。
[0018]本发明公开的深绿木霉深绿木霉菌剂与现有技术相比所具有的积极效果在于:
(1)本发明公开的深绿木霉菌剂对蔬菜真菌病害有较好效果，与现有技术相比防效明显提闻;
(2)本发明公开的深绿木霉菌剂可有效防治韭菜灰霉病、番爺灰霉病、黄瓜褐斑病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病，防治范围有所增加；
(3)本发明公开的深绿木霉菌剂对植物生长有明显的诱抗和促进生长作用。
【具体实施方式】
[0019]本发明实质性特点可以从下述实施例中得以体现，但是这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定，下面通过实例来进一步阐明本发明深绿木霉菌株的制备方法及应用。下述实施例中的实验方法和试剂，如无特别说明，均为常规方法并均有市售。
[0020]实施例1:
深绿木霉的筛选分离与鉴定。
[0021]通过平皿对峙培养进行拮抗木霉菌筛选，发现深绿木霉Trl208对韭菜灰霉病、番茄灰霉病、黄瓜褐斑病、番茄早疫病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病等病原真菌有较强的拮抗作用，经检测其对蔬菜多种病原菌有较强的抑制作用。
[0022]表1、深绿木霉Trl208对韭菜灰霉病菌、黄瓜褐斑病菌、番茄早疫病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病的抑菌效果
【权利要求】
1.一株具有拮抗蔬菜病原真菌活性的深绿木霉菌株，其特征在于该菌株为深绿木霉Trl208 {Trichoderma atroviride),已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0.6828。
2.—种深绿木霉菌剂，其特征在于它是由保藏号为CGMCCN0.6828的深绿木霉Trl208iTrichoderma atroviride)菌体和它的次生代谢物为有效活性成分,配以农业上可以接受的载体以及菌体保护剂组成；其中有效活性成分为1.0-30.0X IO8个孢子/克，菌体保护剂含量为 0.05~1.8% (w/w)。
3.权利要求2所述的深绿木霉菌剂，其特征在于它是由保藏号为CGMCCN0.6828的深绿木霉Trl208 {Trichoderma airoririofe)菌体为有效活性成分,配以农业上可以接受的载体以及菌体保护剂组成；其中有效活性成分为1.0-30.0X IO8个孢子/克，菌体保护剂含量为 0.05~1.8% (w/w)。
4.权利要求2所述的深绿木霉菌剂，其中所述的菌体为深绿木霉分生孢子、菌丝和厚垣孢子的混合；农业上可接受的载体为:硅藻土、碳酸钙、水、小麦粉、木屑、高岭土、不饱和烃类一种或几种的混合物；所述的菌体保护剂为黄原胶、蔗糖、腐植酸钠、黄腐酸钾一种或几种的混合物。
5.权利要求2-4任一项所述的深绿木霉菌剂，其特征在于它是由下述成分组成:
深绿木霉Trl208含菌量为1.0^30.0XlO8个孢子/克，
黄原胶 0.05~0.1% (w/w),
鹿糖 I~1.5% (w/w), 腐植酸钠或黄腐酸钾0.05、.2% (w/w) 余下量为碳酸钙和硅藻土载体，其中碳酸钙:硅藻土的重量份数比为1:2~5。
6.权利要求2-4任一项所述深绿木霉菌剂的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行: 1)菌种活化:保藏号为CGMCCN0.6828 的深绿木霉 Trl208 (.Trichoderma atroviride^)的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中活化72h，备用； 所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称PDA培养基)组成为:马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15~20克、自来水1000毫升，自然pH ； .2)种子液制备:活化后的深绿木霉Trl208菌株，在23~28°C下，小麦粉培养液或理查培养液震荡培养72、6h，培养后得到深绿木霉Trl208种子液； 所述的小麦粉培养液组成为:全麦粉20g、葡萄糖20g、酵母膏2g，水lOOOmL，pH6.8~.7.2 ； 理查培养液组成为:硝酸钾10g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁2.5 g，氯化铁0.02 g，蔗糖50g,水 1000 mL, pH6.8 ~7.2 ; 3)固体发酵培养:在固体发酵培养基料中加入水2(T45%(w/w),初始pH为6.5^7.5之间，高温灭菌，然后待温度降到30°C以下，接入步骤2)的种子液，再在温度为2(T30°C，间隔.24~30h，定期搅拌的条件下发酵培养96~148h ； 所述的固体发酵培养基料(w/w)的组成为:麦粉2~4%，麦麸12~18%，食用菌废料渣或/和木屑77.f 84%，过磷酸钙0.5~1%，尿素0.2~0.5%，蔗糖0.2~0.5%，润水后灭菌备用； .4)测定发酵培养基料中菌体的数量，待发酵基料中孢子量达到IO9cfu/g以上后停止发酵培养，培养物料经常温干燥，采用万能粉碎机粉碎、过筛后成深绿木霉母粉； 5)制备深绿木霉菌剂:以含菌量为2.0^60.0XlO8个孢子/克深绿木霉Tr 1208母粉，黄原胶0.05、.1%，蔗糖f 1.5%，腐植酸钠或黄腐酸钾0.05、.2%，余下量为碳酸钙和硅藻土载体，其中碳酸钙:硅藻土的重量份数比=1:2~5，混合制备深绿木霉菌剂。
7.权利要求1所述深绿木霉Trl208(.Trichoderma airoririofe)菌株在制备作为防控蔬菜真菌病害菌剂中的应用。
8.权利要求1所述深绿木霉Trl208(.Trichoderma airoririofe)菌株在制备作为防治韭菜灰霉病、黄瓜褐斑病、黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、番茄早疫病、瓜果类立枯病、瓜果类枯萎病、瓜果类根腐病菌剂中的应用。
9.权利要求1所述深绿木霉Trl208(.Trichoderma airoririofe)菌株在制备作为促进植物生长菌剂中的 应用。
【文档编号】A01P3/00GK103484384SQ201310462539
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】王勇, 高苇, 王万立, 张春祥, 郝永娟, 刘春艳, 霍建飞 申请人:天津市植物保护研究所