提高家蚕突变频率的育种方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高家蚕突变频率的育种方法，包括以下步骤：1）、取4龄第3天幼虫～熟蚕时为止的各个发育阶段的家蚕幼虫作为待处理家蚕幼虫；2）、先在1.5～2.5mm厚的遮挡板上制作与待处理家蚕幼虫的生殖巢部位的形状和大小相吻合的照射孔，然后将照射孔对准待处理家蚕幼虫的生殖巢部位；辐照用射线通过照射孔对待处理家蚕幼虫的生殖巢部位进行辐照；3）、将照射后幼虫与未照射的对照幼虫同时按相同的方法进行饲养；熟蚕时使其吐丝、结茧及羽化；4）、将照射后的羽化成虫和未照射的羽化成虫交尾，产卵；对所得的饲养辐照家蚕下一代进行突变个体的选择。
【专利说明】提高家蚕突变频率的育种方法
【技术领域】
[0001]本发明属于诱变育种【技术领域】，涉及一种提高突变频率的家蚕诱变育种方法。
【背景技术】
[0002]诱变是对遗传基因进行调控产生变异的一种基本方法。通过诱变能诱发家蚕基因产生突变，促进遗传基因重组，扩大遗传变异，是创造新种质、选育新品种的有效途径之一。目前常采用的方法是利用物理、化学等诱变因素等来实现。其中物理诱变因素主要是用高能量射线直接辐照家蚕生物体，但这种方法的缺点是辐照引起的致死率太高，突变频率太低，而且因辐照产生生理损伤使得突变体稳定性不好；化学诱变因素主要是用化学诱变剂处理家蚕幼虫或蛹体，使化学诱变剂与家蚕细胞内遗传物质发生作用，但化学诱变的缺点是大部分化学诱变剂都具有强烈的致癌性和挥发性，除对家蚕的生理损伤较大外，对人体的安全性也不容忽视。重离子射线作为一种高能射线，具有照射深度及其照射范围可以控制等特点。但迄今利用重离子射线对家蚕生殖巢存在部位进行局部辐照诱变的方法还没有。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种提高突变频率的家蚕诱变育种方法，以及这种诱变育种方法的应用。本发明可在不影响家蚕生理及生存的条件下，在较短时间内从大量辐照后代的材料中进行筛选，从而提高诱变个体的获得率，明显缩短了育种周期，使选择效率大大提高。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供一种提高家蚕突变频率的育种方法，包括以下步骤:
[0005]I)、待处理家蚕的准·备:
[0006]取孵化的家蚕幼虫进行饲育，取4龄第3天幼虫~熟蚕时为止的各个发育阶段的家蚕幼虫作为待处理家蚕幼虫；
[0007]家蚕例如为pnd ；
[0008]2)、局部照射方法:
[0009]先在1.5~2.5mm (较佳为2.0mm)厚的遮挡板上制作与待处理家蚕幼虫的生殖巢部位(存在于第5腹节背部)的形状和大小相吻合的照射孔，然后将照射孔对准待处理家蚕幼虫的生殖巢部位(即，仅使家蚕幼虫的生殖巢存在部位暴露在重离子射线下)；
[0010]辐照用射线通过照射孔对待处理家蚕幼虫的生殖巢部位进行辐照，辐照剂量为I~30Gy ;所述辐照用射线为重离子射线；得照射后幼虫；
[0011]3)、照射后的处理:
[0012]将照射后幼虫与对照幼虫(未照射)同时按相同的方法(为常规方法)进行饲养；熟蚕时使其吐丝、结茧及羽化；
[0013]分别得照射后的羽化成虫和未照射的羽化成虫；[0014]4)、突变个体的选择:
[0015]将照射后的羽化成虫和未照射的羽化成虫交尾、产卵；对所得的饲养辐照家蚕下一代进行突变个体的选择(即，从下一代中筛选突变的个体，也即为在饲养过程中进行突变率分析及性状调查)。
[0016]作为本发明的提高家蚕突变频率的育种方法的改进:
[0017]步骤2)中的重离子射线为碳(C)离子射线，氖(Ne)离子射线、氦(He)离子射线。
[0018]作为本发明的提高家蚕突变频率的育种方法的进一步改进:
[0019]遮挡板为塑料制品板或金属板。塑料制品板为丙烯酸树脂板。
[0020]作为本发明的提高家蚕突变频率的育种方法的进一步改进:
[0021]当待处理家蚕幼虫为4龄第3天幼虫时，辐照剂量为I~9Gy (较佳为I~5Gy);
[0022]当待处理家蚕幼虫为熟蚕时，辐照剂量为5~29Gy (较佳为5~15Gy)。
[0023]作为本发明的提高家蚕突变频率的育种方法的进一步改进:饲育所用的饲料为桑叶或家蚕人工饲料。
[0024]综上所述，本发明的提高家蚕突变频率的育种方法，是将家蚕(按常规方法)饲养至一定时期，用重离子射线局部照射家蚕幼虫的生殖巢部位，照射后继续饲养至成熟，吐丝、结茧及羽化 后交尾产卵，从下一代中筛选突变的个体。
[0025]本发明具有以下优点:
[0026]本发明能很好地解决现有的家蚕诱变育种方法的各种问题。如:现有的物理诱变因素主要是用高能量射线(如激光，伽马射线、电磁)直接辐照家蚕生物体，但这种方法的缺点是因为家蚕个体全身受辐照，辐照引起的致死率太高，突变频率太低，突变体因辐照个体生理损伤而使得稳定性不好。化学诱变因素主要是用化学诱变剂处理幼虫或蛹体，使化学诱变剂与家蚕细胞内遗传物质发生作用，但化学诱变的缺点是大部分化学诱变剂都具有强烈的致癌性和挥发性，除对家蚕的生理损伤较大外，对人体的安全性也不容忽视。
[0027]本发明公开的家蚕辐照诱变的方法具有下述优点:1)射线的辐照范围(面积)及照射深度可以控制，对家蚕的损伤几乎没有，仅对生殖器细胞产生影响，不会导致家蚕的死亡，对其它生理影响也很小，从而提高了诱变基数；2)利用不同种类的重离子射线能量的不同，对生殖器细胞的刺激效应不同，引起相应DNA的突变或断裂等遗传变异的类型不同，可产生的突变种类增加，提高了选择的范围；3)处理时间短，大大地节约了人力物力；4)不涉及有毒、有害及致癌等化学物质，安全环保。
[0028]综上所述，本发明根据家蚕生殖器内的细胞对射线辐照敏感，通过对其进行辐照可以诱发大量的基因突变和染色体畸形的特点，以及根据利用重离子射线的照射深度及其照射范围可以控制的特点，对家蚕生殖器部位进行重离子射线局部辐照，辐照不会引起家蚕的死亡，仅对生殖器产生影响，诱发生殖细胞内的遗传物质进行基因突变和染色体畸形等遗传学变异，同时利用不同种类的重离子射线能量的不同，对生殖器的刺激效应不同，弓丨起相应DNA的突变或断裂等遗传变异的类型不同，使产生的突变种类增加，从而提高选择的范围，从中筛选或获得新的可利用突变体，培育出家蚕新品种的一种育种方法。在经济上具有重要意义，具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】[0029]以下根据实施例详细介绍本发明，本发明没有限定这些实施例。
[0030]实施例1:12C5+离子射线辐照家蚕4龄第3天幼虫生殖巢产生突变体:
[0031](I)试验家蚕的准备
[0032]家蚕品种(pnd)孵化的幼虫用桑叶饲育，取4龄第3天的幼虫用于辐照(即，作为待处理家蚕幼虫)。
[0033](2)局部辐照方法
[0034]先在2.0mm厚的丙烯酸树脂板上，制作与4龄第3天的幼虫生殖巢存在部位(存在于第5腹节背部)的形状和大小相吻合的8 X 4mm的孔(方形孔)；将生殖巢存在部位对准该孔，并用透明胶带纸将幼虫部分固定在照射用实验台上，用18.3MeV/u的碳离子(12C5+)射线进行辐照，碳离子射线的水中射程约为1.1mm，树脂板的厚度为2.0mm,因此，碳离子射线不能穿过该丙烯酸树脂板。照射剂量I~10Gy。
[0035](3)照射后的处理
[0036]照射后的幼虫与对照幼虫(未照射)同时按常规方法给予桑叶饲养。熟蚕时将其放入事先垫有卫生纸的塑料容器内，使其吐丝、结茧、羽化，按常规方法进行调查。照射后羽化的雌性(或雄性)个体与未照射的正常雄蛾(雌蛾)交尾、产卵；饲养辐照后的下一代，在饲养过程中进行突变率分析及相关性状调查。
[0037](4)辐照效果
[0038]结果表明，IOGy照射时，虽辐照个体没有发生死亡，但生殖巢内的细胞完全死亡，交尾后的个体不能造卵或受精，在I~9Gy剂量范围内，福照个体能够部分造卵或受精,并随辐照剂量的减少，造卵数、产卵数或受精率等增加。
[0039]l、3、5Gy剂量照射雌性个体，均有较高的突变率(表1)，其中3Gy照射个体能够有约85%的造卵量及产卵量，通过与未辐照雄蛾交尾后，饲养孵化后的个体，通过对饲养的1405个个体的形态学观察，发现仅斑纹发生变异的个体有21个，突变发生率达到1.49%;数量性状调查结果显示:辐照后的蚕茧量的变异幅度在1.227-1.373g (对照为
1.212-1.279g)，茧层量为0.174-0.206g(对照为0.167-0.189g)，说明辐照引起家蚕数量性状(蚕茧量及茧层量)的变异幅度明显加大，这为选择高蚕茧量及茧层量的家蚕品种(品系)提供了可能。
[0040]表1
[0041]
照射剂平均^n^饲养斑纹突变蚕m量苗层量 量造卵数产量数个体数个数(％) 变幅(g) 变幅(g)
(Gy) (个) (个) (个)____
I382~ 351 — 1587 20( 1.26%)~ 1.212-1.303 0.163-0.199~
3353329 ~ 1405 21(1.49 %) ' 1.227-1.373 0.174-0.206
5231一 207 — 1267 27(2.13%)~ 1.222-1.448 0.168-0.2 lT
—^照 4164011246-- 1.212-1.279 0.167-0.189
[0042]备注说明:
[0043]上述l、3、5Gy剂量照射下，辐照个体均没有发生死亡现象，羽化率均为100%。
[0044]对比例1、相对于实施例1而言,作如下改动:[0045]取消步骤2)的局部辐照中所用的丙烯酸树脂板；即，将用18.3MeV/u的碳离子(12C5+)射线直接照射4龄第3天的幼虫；
[0046]上述l、3、5Gy剂量照射下，辐照个体的羽化率分别为97.14%,88.89%及69.44%，虽IGy的照射对羽化率几乎没有影响，但存在5龄经过延长等问题。
[0047]实施例2:12C5+离子射线辐照家蚕4龄第3天幼虫生殖巢产生突变体
[0048]( I)试验家蚕的准备
[0049]家蚕品种(pnd)孵化的幼虫用桑叶饲育，取4龄第3天的幼虫用于辐照(即，作为待处理家蚕幼虫)。
[0050](2)局部辐照方法
[0051]先在2.0mm厚的丙烯酸树脂板上，制作与4龄第3天的幼虫生殖巢存在部位(存在于第5腹节背部)的形状和大小相吻合的8 X 4mm的孔；将生殖巢存在部位对准该孔，并用透明胶带纸将幼虫部分固定在照射用实验台上，用18.3MeV/u的碳离子(12C5+)射线进行辐照，碳离子射线的水中射程约为1.1mm，树脂板的厚度为2.0mm，因此，碳离子射线不能穿过该丙烯酸树脂板。照射剂量I~IOGy。
[0052](3)照射后的处理
[0053]照射后的幼虫与对照幼虫(未照射)同时按常规方法给与桑叶饲养。熟蚕时将其放入事先垫有卫生纸的塑料容器内，使其吐丝、结茧、羽化，按常规方法进行调查。照射后羽化的雌性(或雄性)个体与未照射的正常雄蛾(雌蛾)交尾、产卵；饲养辐照后的下一代，在饲养过程中进行突变率分析及相关性状调查。
·[0054](4)辐照效果
[0055]结果表明，IOGy照射时，虽辐照个体没有发生死亡，但生殖巢内的细胞完全死亡，交尾后的个体不能造卵或受精，在I~9Gy照射剂量范围内，辐照个体能够部分造卵或受精，并随辐照剂量的减少，造卵数、产卵数或受精率等增加。
[0056]l、3、5Gy剂量照射雄性个体，均有较高的突变率(表2)，其中3Gy剂量辐照雄性个体，照射个体能正常与雌蛾交尾，受精率在80%以上；饲养孵化后的个体，通过对饲养的1338个个体的形态学观察，发现仅斑纹发生变异的个体有24个，突变发生率达到
1.79% ;数量性状调查结果显示:辐照后的蚕茧量的变异幅度在1.219-1.353g (对照为
1.201-1.253g)，茧层量为0.161-0.203g(对照为0.161-0.182g)，说明辐照引起家蚕数量性状(蚕茧量及茧层量)的变异幅度明显加大，这为选择高蚕茧量及茧层量的家蚕品种(品系)提供了可能。
[0057]表2
【权利要求】
1.提高家蚕突变频率的育种方法，其特征是包括以下步骤: 1)、待处理家蚕的准备: 取孵化的家蚕幼虫进行饲育，取4龄第3天幼虫~熟蚕时为止的各个发育阶段的家蚕幼虫作为待处理家蚕幼虫； 2)、局部照射方法: 先在1.5~2.5mm厚的遮挡板上制作与待处理家蚕幼虫的生殖巢部位的形状和大小相吻合的照射孔，然后将照射孔对准待处理家蚕幼虫的生殖巢部位； 辐照用射线通过照射孔对待处理家蚕幼虫的生殖巢部位进行辐照，辐照剂量为I~30Gy ;所述辐照用射线为重离子射线；得照射后幼虫； 3)、照射后的处理: 将照射后幼虫与未照射的对照幼虫同时按相同的方法进行饲养；熟蚕时使其吐丝、结茧及羽化； 分别得照射后的羽化成虫和未照射的羽化成虫； 4)、突变个体的选择: 将照射后的羽化成虫和未照射的羽化成虫交尾，产卵；对所得的饲养辐照家蚕下一代进行突变个体的选择。
2.根据权利 要求1所述的提高家蚕突变频率的育种方法，其特征是: 步骤2)中的重离子射线为碳离子射线，氖离子射线、氦离子射线。
3.根据权利要求2所述的提高家蚕突变频率的育种方法，其特征是:所述遮挡板为塑料制品板或金属板。
4.根据权利要求3所述的提高家蚕突变频率的育种方法，其特征是:所述塑料制品板为丙烯酸树脂板。
5.根据权利要求1~4任一所述的提高家蚕突变频率的育种方法，其特征是: 当待处理家蚕幼虫为4龄第3天幼虫时，辐照剂量为I~9Gy ; 当待处理家蚕幼虫为熟蚕时，辐照剂量为5~29Gy。
6.根据权利要求5所述的提高家蚕突变频率的育种方法，其特征是:所述饲育所用的饲料为桑叶或家蚕人工饲料。
【文档编号】A01K67/04GK103621475SQ201310547646
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】屠振力 申请人:浙江大学