一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法
【专利摘要】本发明公开了一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其处理方法是将选取的外植体经消毒处理后，将外植体伤口处因消毒变色的部分切下，再切成1-1.5cm长，带一个腋芽的茎段，将茎段接种在含有抗生素的培养基上，每瓶接种1-2个茎段，接种后置于培养室中进行培养。本发明利用氨苄青霉素和硫酸链霉素组合，能够降低茶树组织培养过程中外植体的污染率，提高成活率。
【专利说明】一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于茶树组织培养【技术领域】，具体涉及一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法。
【背景技术】
[0002]茶饿{Camellia sinensis L.Kuntze.)属山茶科，山茶属，是一种多年生的木本、常绿植物。茶树组织培养开始于上个世纪60年代。目前，茶树组织培养已经通过对茶树的种子、茎段、腋芽、花药等进行培养获得了完整的再生植株。茶树是自身携带内生菌较多的一种植物，因此，在进行组织培养过程中外植体污染严重，严重制约着茶树组织培养的发展。因此，研究一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法成为本领域目前迫切需要解决的技术难题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，该方法能够降低茶树组织培养过程中外植体发生的污染，提高成活率。
[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其特征在于:具体步骤如下:
(1)取春季生长健壮的、带饱满腋芽的茶树茎段为外植体；
(2)将外植体剪成小段 ，以质量分数为75%的酒精消毒20-25s，无菌水冲洗2遍；用质量分数为0.1%的升汞消毒4min，无菌水冲洗2遍；再用质量分数为0.1%的升汞消毒5min，无菌水冲洗3-5遍；
(3)将外植体切口处因消毒变色的部分切下，然后切成1-1.5cm长，带一个腋芽的茎
段；
(4)将上述茎段接在含有抗生素的培养基上，每个瓶子接种1-2个茎段，接种后放入培养室中进行培养。
[0005]所述培养基为:MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 琼脂粉 6.5g，pH 值调至5.6-5.8，配制好的培养基分装在500mL的广口三角瓶中，高温灭菌20min。
[0006]培养基中加入抗生素的组成成分及浓度如下:
氨苄青霉素:200mg/L ；
硫酸链霉素:150mg/L。
[0007]所述含抗生素的培养基是将抗生素经微孔过滤器抽滤灭菌后，加入到装有培养基的广口三角瓶中，摇匀后再分装到培养瓶中。
[0008]培养条件为:温度23-25 V，光照强度1500-20001x，光照时间12h/d，培养30d-35d。
[0009]本发明的显著优点在于:
(I)本发明能有效降低茶树组织培养过程中外植体的污染，提高组织培养的成功率。[0010](2)本发明通过在培养基中加入氨苄青霉素和硫酸链霉素，能达到较好的抑菌效果，使外植体的污染率降低35%-37 %，萌芽率达42%-44%。
【具体实施方式】
[0011]实施例1
一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其具体步骤如下:
(1)取春季生长健壮的、带饱满腋芽的茶树茎段为外植体；
(2)将外植体剪成小段，以质量分数为75%的酒精消毒20s，无菌水冲洗2遍，用质量分数为0.1%的升汞消毒4min，无菌水冲洗2遍，再用质量分数为0.1%的升汞消毒5min，无菌水冲洗5遍；
(3)将外植体伤口处因消毒变色的部分切下，然后切成1-1.5cm长，带一个腋芽的茎段，待用;
(4)以MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 琼脂粉 6.5g 配制培养基，将 pH 值调至5.6，配制好的培养基分装在500mL的广口三角瓶中，高温灭菌20min ；
(5)将氨苄青霉素和硫酸链霉素经微孔过滤器抽滤灭菌，按每升培养基加入200mg氨苄青霉素和150mg硫酸链霉素的比例，分别将氨苄青霉素和硫酸链霉素加入到装有培养基的广口三角瓶中，摇匀后再分装到培养瓶中；
(6)将处理后的茎段接在含有抗生素的培养基上，每个瓶子接种2个茎段，共接种30个，接种后放入培养室中进行培养，培养条件为:温度23 °C，光照强度15001x，光照时间12h/d,培养30d后，污染率35.91%,萌芽率42.63%。
`[0012]实施例2
一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其具体步骤如下:
(1)取春季生长健壮的、带饱满腋芽的茶树茎段为外植体；
(2)将外植体剪成小段，以质量分数为75%的酒精消毒23s，无菌水冲洗2遍，用质量分数为0.1%的升汞消毒4min，无菌水冲洗2遍，再用质量分数为0.1%的升汞消毒5min，无菌水冲洗4遍；
(3)将外植体伤口处因消毒变色的部分切下，然后切成1-1.5cm长、带一个腋芽的茎段，待用;
(4)以MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 琼脂粉 6.5g 配制培养基，将 pH 值调至5.7，配制好的培养基分装在500mL的广口三角瓶中，高温灭菌20min ；
(5)将氨苄青霉素和硫酸链霉素经微孔过滤器抽滤灭菌，按每升培养基加入200mg氨苄青霉素和150mg硫酸链霉素的比例，分别将氨苄青霉素和硫酸链霉素加入到装有培养基的广口三角瓶中，摇匀后再分装到培养瓶中；
(6)将处理后的茎段接在含有抗生素的培养基上，每个瓶子接种I个茎段，共接种30个，接种后放入培养室中进行培养，培养条件为:温度24 °C，光照强度18001x，光照时间12h/d,培养33d后，污染率36.64%,萌芽率43.29%。
[0013]实施例3
一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其具体步骤如下:
(I)取春季生长健壮的、带饱满腋芽的茶树茎段为外植体；(2)将外植体剪成小段，以质量分数为75%的酒精消毒25s，无菌水冲洗2遍，用质量分数为0.1%的升汞消毒4min，无菌水冲洗2遍，再用质量分数为0.1%的升汞消毒5min，无菌水冲洗3遍；
(3)将外植体伤口处因消毒变色的部分切下，然后切成1-1.5cm长、带一个腋芽的茎段，待用;
(4)以MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 琼脂粉 6.5g 配制培养基，将 pH 值调至5.8，配制好的培养基分装在500mL的广口三角瓶中，高温灭菌20min ；
(5)将氨苄青霉素和硫酸链霉素经微孔过滤器抽滤灭菌，按每升培养基加入200mg氨苄青霉素和150mg硫酸链霉素的比例，分别将氨苄青霉素和硫酸链霉素加入到装有培养基的广口三角瓶中，摇匀后再分装到培养瓶中；
(6)将处理后的茎段接在含有抗生素的培养基上，每个瓶子接种2个茎段，共接种30个，接种后放入培养室中进行培养，培养条件为:温度25 °C，光照强度20001x，光照时间12h/d,培养35d后，污染率36.87%,萌芽率43.96%。
[0014]实施例4不同浓度氨苄青霉素和硫酸链霉素对内生菌的抑制效果 一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其具体步骤如下:
(1)取春季生长健壮的、带饱满腋芽的茶树茎段为外植体；
(2)将外植体剪成小段，以质量分数为75%的酒精消毒25s，无菌水冲洗2遍，用质量分数为0.1%的升汞消毒4min，无菌水冲洗2遍，再用质量分数为0.1%的升汞消毒5min，无菌水冲洗5遍；
(3)将外植体伤口处因消毒变色的部分切下，然后切成1-1.5cm长、带一个腋芽的茎段，待用;
(4)以MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+ 蔗糖 30g+ 琼脂粉 6.5g 配制培养基，将 pH 值调至5.6，配制好的培养基分装在500mL的广口三角瓶中，高温灭菌20min ；
(5)将氨苄青霉素和硫酸链霉素经微孔过滤器抽滤灭菌，按所需浓度将氨苄青霉素和硫酸链霉素加入培养基中，摇匀后再分装到培养瓶中；
(6)将处理后的茎段接在含有抗生素的培养基上，每个瓶子接种2个茎段，接种后放入培养室中进行培养，培养条件为:温度25 °C，光照强度15001x，光照时间12h/d，培养30d。
【权利要求】
1.一种降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)取春季生长健壮的、带饱满腋芽的茶树茎段为外植体； (2)将外植体剪成小段，以质量分数为75%的酒精消毒20-25s，无菌水冲洗2遍；用质量分数为0.1%的升汞消毒4min，无菌水冲洗2遍；再用质量分数为0.1%的升汞消毒5min，无菌水冲洗3-5遍； (3)将外植体切口处因消毒变色的部分切下，然后切成1-1.5cm长，带一个腋芽的茎段； (4)将上述茎段接在含有抗生素的培养基上，每个瓶子接种1-2个茎段，接种后放入培养室中进行培养。
2.根据权利要求1所述的降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其特征在于:所述培养基为:MS+1.5 mg/L 6-BA +0.3mg/L NAA+蔗糖30g+琼脂粉6.5g，pH值调至5.6-5.8，配制好的培养基分装在500mL的广口三角瓶中，高温灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其特征在于:培养基中加入抗生素的组成成分及浓度如下: 氨苄青霉素:200mg/L ； 硫酸链霉素:150mg/L。
4.根据权利要求1所述的降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其特征在于:所述含抗生素的培养基是将抗生素经微孔过滤器抽滤灭菌后，加入到装有培养基的广口三角瓶中，摇匀后再分装到培养瓶中。
5.根据权利要求1所述的降低茶树组织培养过程中外植体污染的方法，其特征在于:培养条件为:温度23-25 °C，光照强度1500-20001x，光照时间12h/d，培养30d_35d。
【文档编号】A01H4/00GK103609454SQ201310639348
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】孙威江, 吴婉婉 申请人:福建农林大学