一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，包括：1）从健康茁壮的雨城丹桂树上，选取盛花期时的新鲜花梗，进行消毒处理；2）无菌条件下，将处理后的材料接种于诱导及分化培养基上，温度25±1℃，全黑暗条件下，培养至分化；其中，诱导及分化培养基为：B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2,4-D0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH5.5；3）将已分化的愈伤组织接种于增殖培养基中，温度25±1℃，光照时间为12h/天，光照强度为2500lx，25天继代增殖一次，即可；其中，增殖培养基为：B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L，pH5.5。本发明以花梗为外植体进行愈伤组织的分化及增殖培养，先经过30天的诱导培养，愈伤组织的分化率较高，达到90%；然后经过25天的继代增殖培养，愈伤组织的增殖系数较高，可以达到1.8，具有很好的实用性。
【专利说明】一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组培【技术领域】，具体涉及一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法。
【背景技术】
[0002]桂花(Osmanthus fragrans Lour.)，亦称山桂、岩桂、九里香、木犀，木犀科木犀属的代表种，常绿灌木至小乔木。它不仅是我国的十大传统名花之一，而且集绿化、美化、香化为一体，属观赏和实用兼具的优良园林、经济树种，深受我国人民的喜爱。
[0003]雨城丹桂(Osmanthus fragrans iYucheng Dan’)是丹桂品种群中的一个优良品种，常绿大灌木，树冠卵形， 花期9月中旬，着花繁密花冠斜展，花色橙红香味中等，观赏性极佳。此外环境适应性强，耐高温较耐寒，对土壤的要求不太严格，生长速度快，种植范围广，如此之多的优点使之在丹桂家族中成为珍贵的品种。
[0004]以往桂花的繁殖多以嫁接为主，扦插、压条为辅，繁殖系数小；播种繁殖存在生理后熟等原因，不能满足生产上的需要；而雨城丹桂花冠雌蕊退化，花后不结实，采用何种途径使之快速繁育成为很有价值的研究方向。组织培养作为新兴的生物繁殖技术，不但繁殖系数大，还能保持品种的优良性状，同时也是高等植物细胞工程、基因工程和改良的重要基础之一，可以短时间获得大量植物材料，从而使雨城丹桂得到快速繁殖与推广。而目前关于雨城丹桂组织培养快繁体系研究的内容较少，还不能满足使用需求。
【发明内容】
[0005]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，为短时间内获得大量雨城丹桂小苗提供了科学的培养基配方，丰富了雨城丹桂这一珍贵的桂花品种的组织培养快繁方法，为以后的相关研究提供一些借鉴和参考意义。
[0006]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，包括以下步骤:
O从健康茁壮的雨城丹桂树上，选取盛花期时的新鲜花梗，进行消毒处理；
2)无菌条件下，将处理后的材料接种于诱导及分化培养基上，温度25±1°C，全黑暗条件下，培养至分化；其中，诱导及分化培养基为:Β5+6-ΒΑ2.0-3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+蔗糖 30g/L+ 琼脂 6.8g/L，ρΗ5.5 ；
3)将已分化的愈伤组织接种于增殖培养基中，温度25±1°C，光照时间为12h/天，光照强度为25001x，25天继代增殖一次，即可；其中，增殖培养基为:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6.8g/L, pH 5.5。
[0007]步骤I)中，从健康茁壮的雨城丹桂树上选取盛花期时的新鲜花梗，先用加入少量去污粉的自来水浸泡I小时，然后用流水冲洗3小时；在水平超净工作台的无菌条件下，将冲洗过的花梗在75%的酒精中浸泡30秒后，在2%的次氯酸钠溶液中浸泡3分钟，再用无菌水仔细冲洗5遍。
[0008]步骤2)中，诱导及分化培养基为:B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+ 蔗糖 30g/L+琼脂 6.8g/L，pH5.5。
[0009]采用诱导及分化培养基B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L,这种激素配比的培养基配方，经过30天的培养，愈伤组织的分化率较高,达到90%，而且整个花梗变成愈伤组织团状愈伤，淡黄白色颗粒，状态较好。
[0010]采用增殖培养基为B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L,这种激素配比的培养基配方，经过25天的培养，愈伤组织的增殖系数较高，可以达到1.8。
[0011]有益效果:与现有技术相比 ，本发明的雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，以花梗为外植体进行愈伤组织的分化及增殖培养，采用诱导及分化培养基B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L进行诱导，经过30天的培养，愈伤组织的分化率较高，达到90%，而且整个花梗变成愈伤组织团状愈伤，淡黄白色颗粒，状态较好；采用增殖培养基为B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L进行继代增殖，经过25天的培养，愈伤组织的增殖系数较高，可以达到1.8，具有很好的实用性，可为后期的丛生芽诱导和基因改良工作提供大量的实验材料。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是雨城丹桂花梗愈伤组织分化示意图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0014]实施例1
本实施例的雨城丹桂，以幼嫩花梗为外植体的愈伤组织分化及增殖，是先从健康茁壮的雨城丹桂树上，选取盛花期时的新鲜花梗，后进行消毒处理，然后将其在无菌操作台上接种于事先配好的分化培养基上，I个月后将已分化的愈伤组织接种于继代增殖培养基中进行增殖。
[0015]I)新鲜外植体的选取与消毒灭菌
从健康茁壮的雨城丹桂树上选取盛花期时的新鲜花梗，先用加入少量去污粉的自来水浸泡I小时，然后用流水冲洗3小时；在水平超净工作台的无菌条件下，将冲洗过的花梗在75%的酒精中浸泡30秒后，在2%的次氯酸钠溶液中浸泡3分钟，再用无菌水仔细冲洗5遍。
[0016]2)无菌培养基的制备
诱导及分化培养基:Β5+6-ΒΑ2.0-3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L，pH 调至 5.5，蔗糖 30g/L，琼脂 6.8g/L。
[0017]增殖培养基为:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L, pH 调至 5.5，蔗糖 30g/L，琼脂6.8g/L。
[0018]培养基分装后尽快将培养瓶口密封，并及时放入高压灭菌锅内进行消毒灭菌。灭菌条件为121°C、0.1MPa下灭菌15分钟，灭好的培养基从高压锅中取出后，放入干净的准备室中让其自然冷却凝固。
[0019]3)接种
将灭菌后的花梗在无菌条件下剪掉两端成0.5cm左右的小段，接种于诱导及分化培养基上，每瓶接种5个材料。
[0020]4)培养
将接种后的培养瓶放入培养室进行愈伤组织的分化，条件为:温度25±1°C，全黑暗处理，30天后统计诱导率分别为90% (B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L)和80%(B5+6-BA3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L)。其中，该诱导率为成功诱导出愈伤的花梗与花梗总接种数的比值。
[0021]30天后发现，如图1所示，整个花梗变成愈伤组织团状愈伤，淡绿色或浅黄绿色的颗粒，状态较好。有些花梗基部和周围都形成淡绿色或浅黄绿色的颗粒或团状物质，经鉴别为分化形成的愈伤组织， 这些花梗就是用此分化培养基成功诱导出愈伤的花梗，
一个月后将分化良好的愈伤组织转于继代增殖培养基中，条件为:温度25土1°C，光照时间为12h/天，光照强度为25001x，30天后统计增殖系数达1.8。其中，增殖系数的计算公式为:
增殖系数=(增殖后愈伤组织重量一增殖前愈伤组织重量)/增殖前愈伤组织重量。
[0022]对比实施例1
方法同实施例1，其中，诱导及分化培养基分别为:MS+6-BA2mg/L+2，4-D0.05mg/L、B5+6-BA1.0mg/L+2, 4_D1.0Omg/L, 30天后统计诱导率仅为20%、50%，同发明中的诱导率达90%差距较大。
[0023]对比实施例2
方法同实施例1，其中，增殖培养基为B5+6-BA1.0mg/L+NAA0.10mg/L，实验步骤同本发明，30天后统计增值系数仅为0.9，同发明中的增值系数达1.8差距较大。
[0024]因此，本发明的结果为:以幼嫩花梗为外植体接种于诱导及分化培养基:B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L中，30天后统计诱导率达90% ;将已分化的愈伤组织接于增殖培养基:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L中，30天后统计增值系数达1.8。
[0025]以上实施例中，B5和MS均为基本培养基，其配方参照分子生物学实验手册。其中，B5 培养基配方为:150mg/L NaH2PO4.H20、3000mg/L KN03、150mg/L CaCl2.2H20、134mg/L (NH4) 2S04、250mg/L MgSO4.7H20、37.3 mg/L Na2-EDTA,27.8mg/L FeSO4.7H20、lOmg/L MnSO4.7H20、2mg/L ZnSO4.7H20、0.025mg/L CoCl2.6H20、0.75mg/L KI,0.25mg/LNa2Mo0.2H20、3mg/L H3B03、0.025mg/L CuSO4.5H20、10mg/L 维生素 B1、1.0mg/L 维生素 B6、2.0mg/L 甘氨酸、1.0mg/L 烟酸、100.0mg/L 肌醇、30g/L 鹿糖，pH5.5。
【权利要求】
1.一种雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)从健康茁壮的雨城丹桂树上，选取盛花期时的新鲜花梗，进行消毒处理； 2)无菌条件下，将处理后的材料接种于诱导及分化培养基上，温度25±1°C，全黑暗条件下，培养至分化；其中，诱导及分化培养基为:Β5+6-ΒΑ2.0-3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+蔗糖 30g/L+ 琼脂 6.8g/L，ρΗ5.5 ； 3)将已分化的愈伤组织接种于增殖培养基中，温度25±1°C，光照时间为12h/天，光照强度为25001x，25天继代增殖一次，即可；其中，增殖培养基为:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6.8g/L, pH 5.5。
2.根据权利要求1所述的雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，其特征在于:步骤I)中，从健康茁壮的雨城丹桂树上选取盛花期时的新鲜花梗，先用加入少量去污粉的自来水浸泡I小时，然后用流水冲洗3小时；在水平超净工作台的无菌条件下，将冲洗过的花梗在 75%的酒精中浸泡30秒后,在2%的次氯酸钠溶液中浸泡3分钟,再用无菌水仔细冲洗5遍。
3.根据权利要求1所述的雨城丹桂愈伤组织分化及增殖方法，其特征在于:步骤2)中，诱导及分化培养基为:B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6.8g/L，pH5.5。
【文档编号】A01H4/00GK103733998SQ201310725163
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】王良桂, 杨秀莲, 王亚莉, 张春霞, 凌敏 申请人:南京林业大学