多倍体芒的诱导方法
【专利摘要】本发明公开了一种多倍体芒的诱导方法，利用芒带芽点愈伤组织进行多倍体诱变，诱变剂是含有Ca2+和甘露醇的水溶液，该水溶液中还含有已过滤灭菌的安磺灵或诺考达唑，通过多倍体鉴定，最终得到多倍体诱变率可达35.19%，周期2-3个月，与常规育种相比，诱变时间大大缩短，诱导率大幅提高，成本也大为降低；为芒新品种选育提供了一条新途径。
【专利说明】多倍体芒的诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物细胞遗传学领域，涉及植物组织培养技术，具体地说是多倍体芒的诱导技术。
【背景技术】
[0002]芒(Miscanthussinensis)隶属于禾本科芒属(Miscanthus Andresson),多年生高大草本，除西北、西藏外，在全国各地均有分布。由于其广泛的生态适应性、能源效益高效性、经济用途多样性以及具有很强的环保功能，使其成为备受关注的生物质能源之一。而要将其投入产业化生产，除了要打破相关的技术壁垒，原材料的品质和数量也是重中之重。由于植物多倍体具有形态巨大、抗逆性强、化学物质含量较高等特点而受到育种学家的广泛重视，目前国内外对芒属植物中的三倍体一奇岗(二倍体的芒X四倍体的荻)研究得较为深入。若能利用多倍体育种手段培育出四倍体，不仅能直接作为新品种加以运用，而且还能为后续的育种工作提供优良的亲本，开发出更多具有实用价值的新品种。
[0003]采用化学试剂进行多倍体诱导，多是利用所选试剂对植物微管蛋白的结合作用来有效阻止微管聚合，从而抑制纺锤体的形成，达到诱导染色体加倍的效果。秋水仙素是一种常用的多倍体诱变剂，但在芒的多倍体诱变过程中发现，其对芒的愈伤组织毒害很大，诱变处理后，胚性细胞常因微管聚合异常死亡，导致多倍体诱变率低；此外，秋水仙素的价格昂贵，价格通常是1000元/g左右，在大规模工厂化诱导多倍体的时候，增加了诱变成本。诺考达唑有使微管解聚的作用，是一种纺锤体形成抑制剂，其在抑制小鼠胚胎成纤维细胞纺锤体形成时，能使细胞不经有丝分裂而进行再复制形成多倍体细胞；与秋水仙素相比，有一定价格优势，价格通常是30元/g左右。安磺灵常用作除草剂，在玉米、小麦多倍体育种中效果较好，在部分植物中离体多倍体诱导程度比秋水仙素高，药害程度较秋水仙素轻；与秋水仙素相比，有极大的价格优势，价格通常是I元/g左右。
[0004]此外，本发明人发现甘露醇的使用，能够保证薄壁细胞的成活率，进而导致对于最终的诱导成功率有很大的影响。而且在植物多倍体诱导过程中，环境温度和Ca2+浓度由于对微管聚合的调控也成为影响多倍体诱导率的重要因素。本发明综合不同诱变剂及浓度，不同甘露醇浓度、不同处理温度和Ca2+浓度等因素，通过设计相应的实验方案对芒的愈伤进行不同处理，探讨以上因素在芒多倍体诱导过程中的作用，找到多倍体芒的诱导最佳的处理组合方案。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种诱导率高、成本低的多倍体芒的诱导方法。
[0006]多倍体芒的诱导方法，该方法包括如下步聚: [0007]将带芽点的愈伤组织浸泡于多倍体诱导剂中处理，所述的多倍体诱导剂是含有Ca2+和甘露醇的水溶液，该水溶液中还含有已过滤灭菌的安磺灵或诺考达唑。
[0008]安磺灵浓度为5-15 μ M0[0009]诺考达唑浓度为2.5-10 μ M0
[0010]甘露醇浓度为20-25g/L ；Ca2+ 浓度 1.02-4.0mM。
[0011]上述方法中浸泡处理温度为5-25°C、浸泡处理时间为10-20min。
[0012]安磺灵浓度优选为10 μ Μ，Ca2+浓度优选为1.02mM,甘露醇浓度优选为25g/L，浸泡温度优选5°C，处理优选15min。
[0013]诺考达唑浓度优选为5 μ Μ，Ca2+浓度优选为1.02mM,甘露醇浓度优选为20g/L，浸泡温度优选15°C，处理优选20min。
[0014]上述方法将愈伤组织浸泡后取出，接种到无激素基本MS培养基进行暗培养；然后取出愈伤组织洗去残存的诱变剂，接种到愈伤分化增殖生根培养基中光照培养。多倍体诱导剂浸泡处理后的无激素暗培养温度为5-25°C;时间为36-48h。暗培养后将愈伤组织从无激素培养基中取出，用25g/L的甘露醇溶液洗去残留的诱变剂，清洗3-5次，每次2-5分钟，在无菌滤纸上晾干后，再接种到愈伤分化增殖生根培养基中光照培养。
[0015]本发明所述多倍体芒的诱导方法，其具体操作步骤如下:
[0016]1、多倍体的诱变:将诺考达唑或安磺灵过滤灭菌，分别将带芽点的愈伤组织浸泡于已过滤灭菌的不同浓度诺考达唑或安磺灵的水溶液中，并添加不同浓度的钙离子和甘露醇，在不同的诱变温度下，处理不同时间，各设5次重复；
[0017]安磺灵浓度为5、10、15μΜ ;
[0018]诺考达唑浓度为2.5、5、10μΜ ;`[0019]甘露醇浓度为20、25g/L ;
[0020]Ca2+ 浓度 1.02、2.99、4.0mM ;
[0021]上述方法中浸泡处理温度为5、15、25°C ；
[0022]浸泡处理时间为10、15、20min。
[0023]2、将愈伤取出，接种到无激素基本MS培养基进行暗培养温度为5-25°C ;时间为36-48h ;然后取出愈伤组织用25g/L的甘露醇溶液洗去残存的诱变剂，清洗3_5次，每次2-5分钟，在无菌滤纸上晾干后，再接种到愈伤分化增殖生根培养基中光照培养。
[0024]3、多倍体鉴定:切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
[0025]在上述试验的多个处理中，多倍体芒诱导率都达到了 20%以上，诱导率最高组合为安磺灵浓度10 μ Μ，温度5°C, 1.02mM Ca2+，处理15min，其诱导率为35.19%。
[0026]本发明提出的多倍体芒的诱导方法，通过诱变剂浸泡愈伤组织，愈伤组织分化成苗，多倍体鉴定，最终得到多倍体材料，周期2-3个月，为芒新品种选育提供了一条新途径，而且该方法诱导率高、对愈伤组织毒害小，成本低廉。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为本发明的各培养阶段培养物的照片:A.种子诱导愈伤；B.诱变剂处理前的愈伤；C.用安磺灵处理后的愈伤；D.用安磺灵处理后的愈伤；E.用诺考达唑处理后愈伤；F.芒的丛生芽；G.再生植株；H.种植于温室；1.二倍体(左)与四倍体(右)植株；
[0028]图2为芒的对照株(2X )和诱变株(4X )染色体核型图(1000X )。【具体实施方式】
[0029]以下结合实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。
[0030]实施例1
[0031]取材:芒(M.sinensis) 02178，采集自湖南怀化，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
[0032]1、诱变材料的准备:挑选已诱导得到的带芽点的致密胚性愈伤组织，收集到50ml的三角瓶中备用；
[0033]2、多倍体的诱变:将胚性愈伤组织浸泡在诱变剂中，诱变剂成分包括25g/L甘露醇、1.02mM Ca2+和10 μ M安磺灵，溶剂为水；处理温度5°C，处理15min，设置5个重复；将愈伤取出，接种到无激素基本培养基，5°C暗培养，处理36h。
[0034]3、丛生芽诱导或增殖:将处理后的愈伤组织取出，用灭菌过的浓度为25g/L的甘露醇溶液冲洗3次，I次2分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留溶液；将愈伤组织转入分化增殖生根培养基中，使其分化增殖成苗。
[0035]4、多倍体鉴定:切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
[0036]结果表明，多倍体芒02178的诱导率为35.19%。
[0037]实施例2
[0038]取材:芒(M.sinensis) 00051，采集自四川乐山，保存于湖南农业大学芒属植物资
源圃。`
[0039]1、诱变材料的准备:挑选已诱导得到的带芽点的致密胚性愈伤组织，收集到50ml的三角瓶中备用；
[0040]2、多倍体的诱变:将胚性愈伤组织浸泡在诱变剂中，诱变剂成分包括20g/L甘露醇、1.02mM Ca2+和5 μ M诺考达唑，溶剂为水；处理温度15°C，处理20min，设置5个重复；将愈伤取出，接种到无激素基本培养基，15°C暗培养，处理48h。
[0041]3、丛生芽诱导或增殖:将处理后的愈伤组织取出，用灭菌过的浓度为20g/L的甘露醇溶液冲洗5次，I次I分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留溶液；将愈伤组织转入分化增殖生根培养基中，使其分化增殖成苗。
[0042]4、多倍体鉴定:切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
[0043]结果表明，多倍体芒00051的诱导率为26.92%。
[0044]实施例3
[0045]取材:芒(M.sinensis) 02178，采集自湖南怀化，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
[0046]1、诱变材料的准备:挑选已诱导得到的带芽点的致密胚性愈伤组织，收集到50ml的三角瓶中备用；
[0047]2、多倍体的诱变:将胚性愈伤组织浸泡在诱变剂中，诱变剂成分包括25g/L甘露醇、2.99mM Ca2+和5 μ M诺考达唑，溶剂为水；处理温度25°C，处理15min，设置5个重复；将愈伤取出，接种到无激素基本培养基，25 °C暗培养，处理36h。
[0048]3、丛生芽诱导或增殖:将处理后的愈伤组织取出，用灭菌过的浓度为25g/L的甘露醇溶液冲洗3次，I次2分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留溶液；将愈伤组织转入分化增殖生根培养基中，使其分化增殖成苗。
[0049]4、多倍体鉴定:切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
[0050]结果表明，多倍体芒02178的诱导率为20.48%。
[0051]实施例4
[0052]取材:芒(M.sinensis) 04158，采集自湖北赤壁，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
[0053]1、诱变材料的准备:挑选已诱导得到的带芽点的致密胚性愈伤组织，收集到50ml的三角瓶中备用；
[0054]2、多倍体的诱变:将胚性愈伤组织浸泡在诱变剂中，诱变剂成分包括20g/L甘露醇、4.0mMCa2+和15 μ M安磺灵，溶剂为水；处理温度15°C，处理15min，设置5个重复；将愈伤取出，
[0055]接种到无激素基本培养基，15°C暗培养，处理48h。
[0056]3、丛生芽诱导或增殖:将处理后的愈伤组织取出，用灭菌过的浓度为20g/L的甘露醇溶液冲洗4次，1次2分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留溶液；将愈伤组织转入分化增殖生根培养基中，使其分化增殖成苗。
[0057]4、多倍体鉴定:切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
[0058]结果表明，多倍体芒04158的诱导率为20.99%。
[0059]对比例1:
[0060]取材:芒(M.sinensis) 02178，采集自湖南怀化，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
[0061]1、诱变材料的准备:挑选已诱导得到的带芽点的致密胚性愈伤组织，收集到50ml的三角瓶中备用；
[0062]2、多倍体的诱变:将胚性愈伤组织浸泡在诱变剂中，诱变剂成分包括25g/L甘露醇、4mMCa2+和2.48mM秋水仙素，溶剂为水；处理温度5°C，处理lOmin，设置5个重复；将愈伤取出，接种到无激素基本培养基，5°C暗培养，处理36h。
[0063]3、丛生芽诱导或增殖:将处理后的愈伤组织取出，用灭菌过的浓度为25g/L的甘露醇溶液冲洗3次，I次2分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留溶液；将愈伤组织转入分化增殖生根培养基中，使其分化增殖成苗。
[0064]4、多倍体鉴定:切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
[0065]结果表明，多倍体芒02178的诱导率为2.48% ;而且本对比例秋水仙素的使用量远高于本发明所使用的诺考达唑或安磺灵。
[0066]对比例2:
[0067]取材:芒(M.sinensis) 02178，采集自湖南怀化，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
[0068]1、诱变材料的准备:挑选已诱导得到的带芽点的致密胚性愈伤组织，收集到50ml的三角瓶中备用；
[0069]2、多倍体的诱变:将胚性愈伤组织浸泡在诱变剂中，诱变剂成分包括20g/L甘露醇、
[0070]1.02mM Ca2+和1.24mM秋水仙素，溶剂为水；处理温度5°C，处理15min，设置5个重复；将愈伤取出，接种到无激素基本培养基，5°C暗培养，处理36h。
[0071]3、丛生芽诱导或增殖:将处理后的愈伤组织取出，用灭菌过的浓度为25g/L的甘露醇溶液冲洗3次，I次2分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留溶液；将愈伤组织转入分化增殖生根培养基中，使其分化增殖成苗。
[0072]4、多倍体鉴定:切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
[0073]结果表明，多倍体芒02178的诱导率为18.18%，接近于本发明的最低诱导率，但仍然低于本发明；而且关键是秋水仙素的成本要远高于诺考达唑或安磺灵；此外，发明人发现在其他条件与本发明相同情况下，本对比例秋水仙素的浓度比对比例I减小会使诱导率增加，但随着秋水仙素使用量继续减少，并不能使诱导率继续升高，当减少到μ M级别时，则诱导率几乎为零。[0074]对比例3
[0075]取材:芒(M.sinensis) 00051，采集自四川乐山，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
[0076]1、诱变材料的准备:挑选已诱导得到的带芽点的致密胚性愈伤组织，收集到50ml的三角瓶中备用；
[0077]2、多倍体的诱变:将胚性愈伤组织浸泡在诱变剂中，诱变剂成分包括15 μ M安磺灵，溶剂为水；处理温度25°C，处理lOmin，设置5个重复；将愈伤取出，接种到无激素基本培养基，25°C暗培养，处理36h。
[0078]3、丛生芽诱导或增殖:将处理后的愈伤组织取出，用灭菌过的浓度为20g/L的甘露醇溶液冲洗5次，I次I分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留溶液；将愈伤组织转入分化增殖生根培养基中，使其分化增殖成苗。
[0079]4、多倍体鉴定:切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
[0080]结果表明，多倍体芒00051的诱导率为4.35%。
[0081]对比例4
[0082]取材:芒(M.sinensis) 00051，采集自四川乐山，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
[0083]1、诱变材料的准备:挑选已诱导得到的带芽点的致密胚性愈伤组织，收集到50ml的三角瓶中备用；
[0084]2、多倍体的诱变:将胚性愈伤组织浸泡在诱变剂中，诱变剂成分包括10 μ M诺考达唑，
[0085]溶剂为水；处理温度25°C，处理lOmin，设置5个重复；将愈伤取出，接种到无激素基本培养基，25 °C暗培养，处理36h。
[0086]3、丛生芽诱导或增殖:将处理后的愈伤组织取出，用灭菌过的浓度为20g/L的甘露醇溶液冲洗5次，I次I分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留溶液；将愈伤组织转入分化增殖生根培养基中，使其分化增殖成苗。
[0087]4、多倍体鉴定:切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
[0088]结果表明，多倍体芒00051的诱导率为5.97%。
[0089]由对比例3和4可见未添加钙离子和甘露醇对于诱导率也是有巨大影响的。
[0090]由实施例及对比例可见，诺考达唑或安磺灵配组钙离子和甘露醇诱导效果都明显优于秋水仙素诱变剂配组，且秋水仙素诱导剂的用量在同比条件下比前两者高近1000倍，加上秋水仙素单价的昂贵，显而易见，诺考达唑和安磺灵的诱变剂配组更适用于规模化生产。
【权利要求】
1.多倍体芒的诱导方法，其特征在于，该方法包括如下步聚: 将带芽点的愈伤组织浸泡于多倍体诱导剂中处理，所述的多倍体诱导剂是含有Ca2+和甘露醇的水溶液，该水溶液中还含有已过滤灭菌的安磺灵或诺考达唑。
2.根据权利要求1所述的多倍体芒的诱导方法，其特征在于，安磺灵浓度为5-15μ M。
3.根据权利要求1所述的多倍体芒的诱导方法，其特征在于，诺考达唑浓度为2.5_10 u Mo
4.根据权利要求1或2或3所述的多倍体芒的诱导方法，其特征在于，甘露醇浓度为20-25g/L ；Ca2+ 浓度 1.02-4.0mM。
5.根据权利要求4所述的多倍体芒的诱导方法，其特征在于，浸泡处理温度为5-25°C、浸泡处理时间为10-20min。
6.根据权利要求1所述的多倍体芒的诱导方法，其特征在于，安磺灵浓度为10μ M，Ca2+浓度为1.02mM，甘露醇浓度为25g/L，浸泡温度5°C，处理15min。
7.根据权利要求1所述的多倍体芒的诱导方法，其特征在于，诺考达唑浓度为5μ M，Ca2+浓度为1.02mM,甘露醇浓度为20g/L，浸泡温度15°C，处理20min。
8.根据权利要求1所述的多倍体芒的诱导方法，其特征在于，将愈伤组织浸泡后取出，接种到无激素基本MS培养基进行暗培养；然后取出愈伤组织洗去残存的诱变剂,接种到愈伤分化增殖生根培养基中光照培养。
9.根据权利要求8所述`的多倍体芒的诱导方法，其特征在于，多倍体诱导剂浸泡处理后的无激素暗培养温度为5-25°C ;时间为36-48h。
10.根据权利要求9所述的多倍体芒的诱导方法，其特征在于，暗培养后将愈伤组织从无激素培养基中取出，用25g/L的甘露醇溶液洗去残留的诱变剂，清洗3-5次，每次2-5分钟，在无菌滤纸上晾干后，再接种到愈伤分化增殖生根培养基中光照培养。
【文档编号】A01H4/00GK103718968SQ201410017763
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】陈智勇, 易自力, 刘清波 申请人:湖南农业大学